殼聚糖-纖維素納米纖維復(fù)合膜的制備及表征

陳曉霞，邱宇龍，李儀茜，畢景然

（大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034）

隨著人們生活水平的日益提高，食品質(zhì)量和安全問(wèn)題越來(lái)越受到消費(fèi)者的廣泛關(guān)注。目前石油衍生聚合物在食品保鮮領(lǐng)域得到了廣泛的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，但由于其不可回收及不可生物降解性，消費(fèi)者對(duì)天然生物聚合物材質(zhì)的食品保鮮膜認(rèn)同度更高[1-2]。

殼聚糖（chitosan，CS）是一種天然的陽(yáng)離子多糖，具有良好的成膜性、生物降解性[3]、抗氧化性和抗菌活性[4]，因此，CS 基復(fù)合膜被廣泛應(yīng)用在食品保鮮方面[5]。然而，由于CS 糖苷鏈上的分子內(nèi)和分子間的網(wǎng)絡(luò)鏈間隙，導(dǎo)致CS 基復(fù)合膜機(jī)械性能較差，限制了CS 的實(shí)際利用[6]。纖維素是一種天然大分子多糖，由β-D-葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵連接而成，結(jié)晶度高，由纖維素I 晶型和無(wú)定形區(qū)組成。由氧化法制備的纖維素納米纖維（cellulose nanofibrils，CNF），在纖維素分子上引入了大量的羧基，具有高長(zhǎng)徑比、高比表面積以及無(wú)定形晶體結(jié)構(gòu)，能夠通過(guò)氫鍵建立牢固的納米纖維素網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可作為復(fù)合膜的增強(qiáng)填料[7]。Yadav等[8]采用共混法制備了CNF/CS 綠色復(fù)合薄膜，隨著CNF 添加量的增加，復(fù)合膜的吸濕率和水溶性都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可作為食品包裝用于食品保鮮。Tang 等[9]以CNF為增強(qiáng)填料，制備了可降解、透明度高的CS/瓜爾膠（guar gum，GG）/CNF 納米復(fù)合膜，與純CS/GG 膜相比，CS/GG/CNF 納米復(fù)合膜的抗拉強(qiáng)度更大，氧氣透過(guò)率更低，是一種潛在的新型食品包裝材料。京尼平（genipin，GP） 是梔子苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解后的產(chǎn)物，化學(xué)結(jié)構(gòu)具有羥基、羧基等多個(gè)活性基團(tuán)，其毒性與人工合成的化學(xué)交聯(lián)劑相比較小[10]。京尼平作為京尼平苷的苷元衍生物，可用于多種天然生物材料的交聯(lián)，是一種優(yōu)良的天然生物交聯(lián)劑，可以與CS 分子上的伯氨基反應(yīng)生成雜環(huán)胺，引發(fā)CS 分子通過(guò)短橋結(jié)構(gòu)進(jìn)行有序的交聯(lián)[11]。通過(guò)GP 交聯(lián)形成的大分子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，交聯(lián)程度高、性質(zhì)穩(wěn)定、阻隔性能強(qiáng)。

本研究以絲瓜絡(luò)為原料，通過(guò)2，2，6，6-四甲基哌啶-氮-氧化物（2，2，6，6-tetramethyl-1-piperidinyloxy，TEMPO）氧化法制備CNF。以GP 作為交聯(lián)劑，通過(guò)在CS 中添加不同量的CNF，制備CS-GP-CNF 復(fù)合膜，采用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）及X 射線衍射（X-ray diffractometer，XRD）等技術(shù)對(duì)復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，探究復(fù)合膜的交聯(lián)機(jī)制，并研究不同添加量的CNF 對(duì)復(fù)合膜水蒸氣透過(guò)率的影響，探討CS-GP-CNF 復(fù)合膜在雞肉冷藏保鮮中的應(yīng)用效果，以期為天然食品包裝膜的制備提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絲瓜絡(luò)：天津品煜悠佳商貿(mào)有限公司；CS（生化試劑）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；GP（98%）、脂肪醇聚氧乙烯醚：上海麥克林生化科技股份有限公司；乙酸乙酯、乙酸、鹽酸、氫氧化鉀、次氯酸鈉、無(wú)水乙醇（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；溴化鈉、TEMPO（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉（生物試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

中草藥粉碎機(jī)（FW177）：天津市泰斯特儀器有限公司；恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S）：深圳市三莉科技有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（GFL-70）：天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；自動(dòng)凱氏定氮儀（K9840）：山東海能科學(xué)儀器有限公司；透射電子顯微鏡（JEM-2100）、SEM（JSM-7800F）：日本電子株式會(huì)社；傅里葉變換紅外光譜儀（Spectrum II）：鉑金埃爾默儀器有限公司；X 射線衍射儀（XRD-7000S）：日本島津公司；真空冷凍干燥機(jī)（FD8-3）：美國(guó)Siemon 公司。

1.3 方法

1.3.1 纖維素的制備

將40 g 絲瓜絡(luò)用中草藥粉碎機(jī)粉碎，加入至10g/L的脂肪醇聚氧乙烯醚（質(zhì)量濃度2%）滲透劑中，連續(xù)攪拌24 h 后，用去離子水徹底清洗樣品，之后采用乙酸乙酯萃取。在75 ℃下緩慢加入40 mL 乙酸和60 g 次氯酸鈉。過(guò)濾后的樣品在90 ℃下與400 mL 氫氧化鉀溶液（5%）混合攪拌2 h，去除半纖維素。在80 ℃下，利用400 mL 鹽酸（1%）攪拌剩余樣品2 h 后，用去離子水洗滌至中性，采用真空冷凍干燥機(jī)凍干得到纖維素粉。

1.3.2 CNF 的制備

將1 g 纖維素粉與100 mL TEMPO-NaBr 溶液（含0.1 g TEMPO 和0.016 g NaBr）混合，在30 ℃下攪拌4 h，攪拌過(guò)程中緩慢滴加0.5 mol/L NaOH 溶液，調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液至pH10。加入10 mL 無(wú)水乙醇終止反應(yīng)，將反應(yīng)后的產(chǎn)物用去離子水反復(fù)潤(rùn)洗至中性，10 000 r/min 離心10 min，去除上層清液，將沉淀凍干即得CNF[12]。

1.3.3 CS-GP-CNF 復(fù)合膜的制備

將CS（1.5 g）溶于100 mL 1%乙酸溶液中，攪拌6 h，制得1.5% CS 溶液。隨后，將CNF 分別按CS 的0%、1%、2%、3%、6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)） 加入到CS 溶液中。攪拌20 min 后，加入終濃度為0.15 mmol/L 的GP 水溶液，攪拌30 min，制備CS-GP-CNF 交聯(lián)溶液。超聲1 h 后，將200 mL CS-GP-CNF 交聯(lián)溶液倒入模具（30 cm×25 cm）中，在40 ℃下干燥2 h，形成干燥的復(fù)合膜，樣品分別記為CS-GP-CS、CS-GP-CNF1、CS-GP-CNF2、CS-GPCNF3、CS-GP-CNF6。

1.3.4 測(cè)試與表征

1.3.4.1 透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察

將一滴用去離子水稀釋的CNF 懸浮液滴在有碳涂層的銅網(wǎng)上，然后用乙酸雙氧鈾復(fù)染2 min，并在室溫下晾干。使用TEM 觀察CNF 形貌。

1.3.4.2 FTIR 分析

使用溴化鉀壓片后對(duì)CNF 進(jìn)行掃描，掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1；對(duì)CS-GP-CNF 復(fù)合膜進(jìn)行掃描，掃描范圍為4 000～650 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.3.4.3 XRD 分析

XRD 譜圖掃描范圍為5°～60°，掃描速度為5°/min。結(jié)晶度計(jì)算公式如下。

Cr=（I002-Iam）/Iam

式中：Cr為結(jié)晶度，%；I002為（002）面衍射的最大強(qiáng)度；Iam為樣品非晶態(tài)部分散射的強(qiáng)度。

1.3.4.4 SEM 觀察

將CS-GP-CNF 復(fù)合膜用液氮冷凍后脆斷，噴金，利用SEM 對(duì)復(fù)合膜的橫切面進(jìn)行微觀形貌分析。

1.3.4.5 水蒸氣透過(guò)率（water vapor permeability，WVP）測(cè)定

采用WVP 測(cè)試系統(tǒng)對(duì)樣品進(jìn)行水蒸氣透過(guò)率的測(cè)試[13]。將CS-GP-CNF 復(fù)合膜剪成直徑60 mm 的圓形，固定在裝有20 mL 飽和NaCl 溶液的稱(chēng)量瓶（相對(duì)濕度為75%）的頂部，然后放置在裝有CaCl2的干燥器（相對(duì)濕度0%）內(nèi)。每隔24 h 定期對(duì)試驗(yàn)容器進(jìn)行稱(chēng)重，連續(xù)稱(chēng)量3 d。水蒸氣透過(guò)率計(jì)算公式如下。

W=（△m×x）/（A×△t×△P）

式中：W為水蒸氣透過(guò)率，g/（s·m·Pa）；△m 為試驗(yàn)前后的質(zhì)量差，g；x為復(fù)合膜的平均厚度，m；A 為復(fù)合膜面積，m2；△t 為測(cè)量時(shí)間差，s；△P 為復(fù)合膜兩側(cè)的水蒸氣壓差，2 809 Pa。

1.3.5 CS-GP-CNF6在雞肉貯藏中的應(yīng)用

為評(píng)價(jià)復(fù)合膜的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，以CS-GP-CNF6復(fù)合膜為包裝材料對(duì)雞肉進(jìn)行保鮮。將雞胸肉在120 ℃的高溫下油炸2 min，然后轉(zhuǎn)移至沸水中煮15 min，以模擬燒雞加工工藝。將雞肉切成2 cm×2 cm×2 cm 的小塊，用制備好的復(fù)合膜包覆雞肉，試驗(yàn)組分別為CS-GPCNF6、商用聚乙烯保鮮膜和未包膜空白組。將包覆好的雞肉放于4 ℃冰箱冷藏，分別貯藏1、3、5、7、10 d 后測(cè)定樣品的菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮含量。

1）菌落總數(shù)測(cè)定：參照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行雞肉中菌落總數(shù)的測(cè)定[14]。

2）揮發(fā)性鹽基氮含量的測(cè)定：參照GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》進(jìn)行雞肉中揮發(fā)性鹽基氮含量的測(cè)定[15]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與分析，使用Origin 2021 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CNF 的性質(zhì)

2.1.1 TEM 分析

CNF 的TEM 圖像見(jiàn)圖1。

圖1 CNF 的TEM 圖像Fig.1 TEM images of CNF

從圖1 中可以發(fā)現(xiàn)CNF 的平均寬度為（7.3±3.6）nm，平均長(zhǎng)度為（156.3±46.9）nm。CNF 長(zhǎng)徑比可高達(dá)21.41，因此，可作為復(fù)合膜的增強(qiáng)填料，以提高其阻隔性能。另外，纖維素粉經(jīng)過(guò)TEMPO 催化處理后，CNF之間存在團(tuán)聚現(xiàn)象，這是由于氧化作用導(dǎo)致纖維素分子中大部分—OH 和—COOH 等親水性基團(tuán)暴露，在分子內(nèi)及分子間形成大量氫鍵，引發(fā)團(tuán)聚[16]。

2.1.2 FTIR 分析

CNF 的FTIR 圖像見(jiàn)圖2。

圖2 CNF 的FTIR 譜圖Fig.2 FTIR spectrum of CNF

由圖2 可知，在3 361～3 343 cm-1處出現(xiàn)較強(qiáng)較寬的吸收峰，這是由—OH 伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的纖維素的特征峰。在2 910 cm-1處存在的尖峰對(duì)應(yīng)為C—H 的伸縮振動(dòng)吸收峰，在1 649 cm-1處的特征峰是酰胺基Ⅰ的彎曲振動(dòng)，1 200 ～1 000 cm-1吸收帶屬于—C—O—的伸縮振動(dòng)峰，890 cm-1處對(duì)應(yīng)的是纖維素C—H 的變形振動(dòng)[17]。木質(zhì)素對(duì)應(yīng)的芳香骨架振動(dòng)峰（1 510 cm-1）、C—H 伸縮振動(dòng)峰（1 246 cm-1）和彎曲振動(dòng)峰（828 cm-1）在CNF 圖譜中沒(méi)有顯示，說(shuō)明原料中的木質(zhì)素已完全通過(guò)TEMPO 氧化被去除。

2.1.3 XRD 分析

通過(guò)氧化反應(yīng)制備的CNF 的XRD 結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 CNF 的XRD 譜圖Fig.3 XRD spectrum of CNF

由圖3 可知，CNF 在2θ=15.8°、22.4°和34.42°附近處出現(xiàn)明顯的衍射峰，分別代表了纖維素I 型結(jié)晶結(jié)構(gòu)的（110）、（012）以及（040）晶面。計(jì)算得到CNF 的結(jié)晶度為72.3%，這說(shuō)明TEMPO 氧化可能只發(fā)生在纖維素的無(wú)定形區(qū)，對(duì)內(nèi)部晶區(qū)影響不大，因此纖維素的晶型結(jié)構(gòu)得以保持。

2.2 復(fù)合膜的性質(zhì)

2.2.1 SEM 分析

CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 復(fù)合膜的橫切面形貌見(jiàn)圖4。

圖4 CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 復(fù)合膜的橫切面形貌Fig.4 Cross-section images of CS-GP-CS and CS-GP-CNF composite films

由圖4 可知，在化學(xué)交聯(lián)劑京尼平的作用下，CS可以充分交聯(lián)，形成結(jié)構(gòu)完整，表面均一、光滑、無(wú)氣泡的CS-GP-CS 復(fù)合膜。Costa 等[18]的研究表明，隨著CNF 添加量的逐漸增大，京尼平分子中的酯基（C-11）逐漸被CNF 取代，產(chǎn)生了高分子量的酸酐基團(tuán)，并通過(guò)氫鍵作用形成了結(jié)節(jié)狀網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，由此造成復(fù)合膜表面形貌的粗糙節(jié)點(diǎn)，其中CS-GP-CNF6復(fù)合膜的橫切面形貌明顯出現(xiàn)小型白色團(tuán)聚結(jié)構(gòu)。

2.2.2 FTIR 分析

CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 復(fù)合膜的FTIR 譜圖見(jiàn)圖5。

如圖5 所示，CS-GP-CS 復(fù)合膜的FTIR 譜圖中，在3 434 cm-1和2 854 cm-1處存在CS 分子中O-H 和C-H 基團(tuán)的伸縮振動(dòng)典型吸收峰。由于CS 的氨基與京尼平C-3 處的烯烴碳原子發(fā)生了親核取代反應(yīng)，因此，CS-GP-CS 及CS-GP-CNF 復(fù)合膜在1 452 cm-1處均存在與C-N 的伸縮振動(dòng)相關(guān)的吸收峰。同時(shí)，GP 分子C-11 上的酯基分別被CS 和CNF 取代，分別對(duì)應(yīng)仲酰胺（1 637 cm-1）和酸酐（1 459 cm-1）的吸收峰，證明CSGP-CS 和CS-GP-CNF 復(fù)合膜中存在化學(xué)交聯(lián)作用。

2.2.3 晶體結(jié)構(gòu)

CNF、CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 復(fù)合膜的XRD譜圖見(jiàn)圖6。

如圖6 所示，CS-GP-CS 復(fù)合膜的XRD 譜圖在2θ=8.18°、11.68°、18.26°處存在3 個(gè)衍射峰，在23.54°處有一個(gè)寬峰，這是典型的半晶指紋圖譜。當(dāng)CNF 通過(guò)GP 與CS 交聯(lián)時(shí)，CNF 分子中的羧基被交聯(lián)劑取代。因此，交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)體系中分子間和分子內(nèi)氫鍵的分布發(fā)生了部分改變，但其規(guī)律性并未被明顯破壞。此外，由于CNF 的典型纖維素I 結(jié)構(gòu)的晶體平面與CS的衍射峰重疊，因此，CS-GP-CNF 復(fù)合膜的XRD 譜圖形狀與CS-GP-CS 相似。隨著CNF 添加量的逐漸增大，2θ=11.68°處的衍射峰逐漸增大，說(shuō)明CS-GP-CNF復(fù)合膜的面間距離變小。

2.2.4 WVP 測(cè)定結(jié)果

CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 復(fù)合膜的水蒸氣透過(guò)率見(jiàn)表1。

表1 CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 復(fù)合膜的水蒸氣透過(guò)率Table 1 Water vapor permeability of CS-GP-CS and CS-GPCNF films

阻隔性能是食品包裝材料防止食品腐敗的重要指標(biāo)，特別是優(yōu)良的阻水特性可有效避免微生物繁殖。水蒸氣透過(guò)率可反映包裝食品與周?chē)髿庵g的水分交換速率。如表1 所示，由于化學(xué)交聯(lián)劑GP 的作用，CS-GP-CS 及CS-GP-CNF 復(fù)合膜的交聯(lián)結(jié)構(gòu)緊密，均展現(xiàn)出較高的防潮性能。雖然CNF 表面親水位點(diǎn)豐富，具有較高的親水性，但CS-GP-CNF 復(fù)合膜的WVP 仍較低，如CNF 含量最高的CS-GP-CNF6復(fù)合膜的WVP 為1.14×10-11g/（s·m·Pa），遠(yuǎn)低于玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸鈉復(fù)合膜[4.62×10-6g/（s·m·Pa）][19]。

2.2.5 CS-GP-CNF 復(fù)合膜在雞肉貯藏中的應(yīng)用

2.2.5.1 菌落總數(shù)

不同包裝材料對(duì)冷藏雞肉菌落總數(shù)的影響見(jiàn)圖7。

圖7 不同包裝材料對(duì)冷藏雞肉菌落總數(shù)的影響Fig.7 Effect of different films on colony number of chicken during refrigerated storage

如圖7 所示，在4 ℃條件下，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各組雞肉的菌落總數(shù)不斷增加，其中，未包膜空白組雞肉的菌落總數(shù)上升速率最大，在貯藏第3 天達(dá)到（4.49±0.14）lg（CFU/mL），超過(guò)了GB/T 20558—2006《地理標(biāo)志產(chǎn)品符離集燒雞》[20]中規(guī)定的菌落總數(shù)限值4.47 lg（CFU/mL）。商用聚乙烯保鮮膜雖對(duì)雞肉具有保護(hù)作用，但在第10 天時(shí)，雞肉的菌落總數(shù)達(dá)到了（5.10±0.21）lg（CFU/mL）。由于CS 良好的抑菌性[21]及復(fù)合膜的防潮特性，在貯藏第10 天時(shí)，被CS-GPCNF6復(fù)合膜包覆的雞肉菌落總數(shù)仍未超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)限值，僅為（4.16±0.09）lg（CFU/mL），表明CS-GP-CNF6復(fù)合膜可以有效地抑制雞肉的細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.2.5.2 雞肉的揮發(fā)性鹽基氮含量

揮發(fā)性鹽基氮是判斷肉制品新鮮度的重要指標(biāo)之一。在內(nèi)源酶和微生物的作用下，蛋白質(zhì)會(huì)被降解成小分子氨和胺類(lèi)，可通過(guò)凱氏定氮法測(cè)定揮發(fā)性鹽基氮含量。不同包裝材料對(duì)冷藏雞肉揮發(fā)性鹽基氮含量的影響見(jiàn)圖8。

由圖8 可知，新鮮雞肉的初始揮發(fā)性鹽基氮含量為（10.0±0.5）mg/100 g，各組的揮發(fā)性鹽基氮含量變化趨勢(shì)基本一致，均隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。參照肉制品新鮮度判定標(biāo)準(zhǔn)：揮發(fā)性鹽基氮含量一級(jí)鮮度≤15.00 mg/100 g，二級(jí)鮮度≤25.00 mg/100 g[21]。未包膜空白組雞肉的揮發(fā)性鹽基氮含量在貯藏1 d 后達(dá)到18.70 mg/100 g，由一級(jí)鮮度轉(zhuǎn)為二級(jí)鮮度，且在第7天超過(guò)25.00 mg/100 g。商用聚乙烯保鮮膜包裹的雞肉樣品于貯藏第3 天轉(zhuǎn)為二級(jí)鮮度，貯藏第7 天時(shí)揮發(fā)性鹽基氮含量為25.31 mg/100 g。相比之下，CS-GPCNF6復(fù)合膜包覆雞肉的揮發(fā)性鹽基氮含量整體低于未包膜空白組和商用聚乙烯保鮮膜組。CS-GP-CNF6組雞肉的揮發(fā)性鹽基氮含量在貯藏第5 天時(shí)僅為16.20 mg/100 g，且可保障雞肉的二級(jí)鮮度直至第10天（此時(shí)雞肉揮發(fā)性鹽基氮含量為21.20 mg/100 g），表明CS-GP-CNF 復(fù)合膜具有潛在的食品保鮮能力。

3 結(jié)論

本文以絲瓜絡(luò)為原料制備了長(zhǎng)徑比為21.41 的CNF，并以CNF 及天然多糖聚合物CS 為原料，通過(guò)GP 化學(xué)交聯(lián)，制備了表面均一、光滑、無(wú)氣泡的CSGP-CNF 復(fù)合膜。當(dāng)CNF 添加量為CS 質(zhì)量的6%時(shí)，所制備的CS-GP-CNF6復(fù)合膜的水蒸氣透過(guò)率僅為1.14 × 10-11g/（s·m·Pa）。以CS-GP-CNF6復(fù)合膜包覆雞肉樣品，評(píng)價(jià)其在食品保鮮領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，結(jié)果顯示，在4 ℃下貯藏10 d 時(shí)，雞肉的菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮含量分別為（4.16±0.09）lg（CFU/mL）和21.20 mg/100 g，保鮮效果明顯優(yōu)于未包膜空白組和商用聚乙烯保鮮膜組。