蠶蛹源肽鋅納米粒子的制備及其結(jié)構(gòu)表征

廖明君，張自然,，惠 森，陳璐雯，楊春媛，張宗凱，牛改改

（1.北部灣大學(xué)食品工程學(xué)院，廣西高校北部灣海產(chǎn)品高值化利用與預(yù)制食品重點實驗室，廣西欽州 535011；2.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 535000）

鋅是人體必需的微量元素，參與調(diào)節(jié)細胞生長、基因表達和免疫反應(yīng)等生理活動，在生命活動中起著重要的作用，鋅的缺乏可導(dǎo)致生長遲緩和免疫功能受損[1]。據(jù)報道，目前全球約17%的人群出現(xiàn)鋅缺乏癥狀，缺鋅已成為影響全球性人類健康的一大誘因[2]。造成機體缺鋅的主要原因是日常膳食中鋅的生物利用度低，如鋅易與植酸形成不溶性復(fù)合物，而無法被腸道吸收[3]。因此，開發(fā)有效的補鋅劑具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

傳統(tǒng)上的補鋅劑如硫酸鋅、葡萄糖酸鋅等往往存在易在微堿性環(huán)境下沉淀、生物利用度低，以及刺激胃腸道等缺點，不宜長期使用[2]。而食源性蛋白肽可與鋅形成螯合物，相比無機鋅具有穩(wěn)定性好、安全、易吸收等優(yōu)點而成為有效補鋅的一種重要形式，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前國內(nèi)外學(xué)者已利用動植物蛋白為原料酶解而得多肽，制備出多種肽鋅螯合物，如Zhang 等[4]通過在牡蠣蛋白酶解液中加入硫酸鋅，成功制備得到肽鋅納米粒，并對其溶解性、胃腸穩(wěn)定性和結(jié)合機制進行了探討，結(jié)果顯示肽鋅納米粒在胃腸道中的溶解性和穩(wěn)定性顯著優(yōu)于硫酸鋅；Peng 等[5]利用南瓜籽制備得到兩條肽鋅螯合物在胃腸穩(wěn)定性和促鋅吸收效果方面顯著優(yōu)于無機鋅。因此，開發(fā)食源性肽補鋅制劑具有重要的現(xiàn)實意義。

我國桑蠶業(yè)歷史悠久，是世界蠶桑生產(chǎn)第一大國，蠶蛹年產(chǎn)量高達65 萬噸[6]。蠶蛹富含蛋白質(zhì)，且氨基酸組成均衡，是人體理想的蛋白來源。近年來，以蠶蛹蛋白為原料，制備得到多種生理活性肽。例如，Li 等[7]采用堿提取法獲得蠶蛹蛋白，發(fā)現(xiàn)采用超聲波粉碎-堿性蛋白酶酶解制備得到酶解液對小鼠脾細胞顯示了促增殖效果；沈圓圓等[8]利用納豆菌液態(tài)發(fā)酵法成功制備了蠶蛹抗炎活性多肽。其中，相對于其它方法，酶解法制備蠶蛹肽具有操作簡便，酶切位點可控等優(yōu)點，應(yīng)用前景廣闊[9]。

目前，蠶蛹主要作為動物飼料使用，部分用于食品加工，產(chǎn)品有蛋白粉、氨基酸和蛋白纖維等，尚未得到有效的開發(fā)利用。國內(nèi)外學(xué)者普遍認為肽中的組氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）、天冬氨酸（Asp）和蛋氨酸（Met）與其金屬螯合能力密切相關(guān)[10]。資料顯示，蠶蛹蛋白質(zhì)中富含Asp 和Glu 等帶電氨基酸，分別約占總氨基酸量的10%和14%[11]，可為金屬提供豐富的結(jié)合位點，提示其中蘊含鋅螯合肽片段，是制備肽鋅螯合物的良好原料。然而，目前尚未見蠶蛹肽鋅螯合物的相關(guān)報道。因此，本文以蠶蛹為原料，利用可控酶解技術(shù)制備活性肽，探索蠶蛹肽鋅螯合物的制備工藝參數(shù)，并借助紫外光譜、熒光光譜、粒徑分析、紅外光譜及掃描電鏡等技術(shù)手段進行結(jié)構(gòu)表征，期望為補鋅制劑的開發(fā)及蠶蛹的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠶蛹 廣西靖西鑫晟繭絲綢科技有限公司；甘氨酸、苯并戊三酮（茚三酮）、七水合硫酸鋅 分析純，上海國藥制藥集團；堿性蛋白酶 8.6×105units/g，丹麥諾維信公司；其他分析試劑均為國產(chǎn)分析純；MD34-500 透析袋 西安優(yōu)博生物科技有限公司。

iCE 3500 AA 原子吸收光譜儀、Lumina 熒光光度計 美國Thermofisher 公司；納米粒度及Zetasizer NANO-ZS Zeta 電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；高分辨場發(fā)射掃描電子顯微鏡 德國Zeiss 公司；Vario EL cube元素分析儀 德國Elementar 公司；Fnortier-TGA4000紅外光譜儀 北京北分瑞利分析儀器（集團）有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蠶蛹肽的制備

1.2.1.1 蠶蛹蛋白的提取及預(yù)處理 參照Zhou 等[12]的方法使用正己烷脫脂，并采用堿溶酸沉法提取蠶蛹蛋白質(zhì)，即于脫脂蠶蛹粉中加入氫氧化鈉溶液（1 mol/L），質(zhì)量體積比為1:10，45 ℃攪拌5 h，離心（8000 r/min，10 min）取上清液，用1 mol/L 鹽酸調(diào)pH 至4.0，室溫攪拌10 min，離心（8000 r/min，10 min），取沉淀，用500 Da 透析袋透析除鹽后，凍干備用，即為蠶蛹蛋白。參照任子旭等[13]的方法對蠶蛹蛋白進行超聲波改性處理，具體操作如下：在（30±5）℃條件下，用超聲功率為530 W 的超聲波對濃度為50 g/L 的蠶蛹蛋白溶液處理35 min。

1.2.1.2 蠶蛹肽的制備 參考趙梓月等[14]的方法利用堿性蛋白酶制備蠶蛹多肽。將經(jīng)過超聲波處理的蠶蛹蛋白溶液用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為10 g/L 的懸浮液，加入1% 堿性蛋白酶，調(diào)整pH8.0，于50 ℃恒溫水搖床中酶解（140 r/min）。酶解結(jié)束后，100 ℃水浴滅酶10 min，冷卻至室溫，離心（8000 r/min，10 min），取上清液，備用。通過對比不同酶解時間（0，2，4，6，8，10，12 h）下酶解液對鋅螯合率的變化，確定適宜的酶解參數(shù)。將此條件下制備的酶解液進行膜過濾（0.45 μm，混合纖維膜）處理，調(diào)節(jié)蠕動泵轉(zhuǎn)速使膜板出口壓力穩(wěn)定在0.2 MPa。收集小于10 kDa 組分進行凍干備用，即為螯合用蠶蛹肽（Silkworm Chrysalis Peptide，SCP），于4 ℃冰箱中保存待用。

1.2.2 蠶蛹肽鋅螯合物的制備 取一定體積的10 mg/mL SCP 水溶液與一定的體積的硫酸鋅（ZnSO4，100 mg/mL）混合，調(diào)整至一定的pH，置于恒溫水浴搖床（140 r/min）中反應(yīng)至所需時間。取出后冷卻，加入3 倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置過夜，離心（8000 r/min，10 min），去除上清液，加入乙醇清洗沉淀3 次以上，直至用氯化鋇檢測無硫酸根檢出為止，凍干，備用。

1.2.3 不同因素對蠶蛹肽螯合鋅能力的影響 為尋找蠶蛹肽鋅螯合的最佳工藝參數(shù)，本研究對ZnSO4的質(zhì)量比（1:0.125、1:0.25、1:0.33、1:0.5、1:1、1:2、1:3）、pH（3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0）、螯合時間（20、40、60、80、100 min）以及溫度（25、35、45、55、65 ℃）等因素對螯合能力的影響進行分析，以期得到蠶蛹肽鋅螯合物的最佳制備工藝。首先，在溫度50 ℃，pH 6.5，分別加入不同劑量的硫酸鋅，反應(yīng)20 min，進行螯合率的測定。并在此基礎(chǔ)上，探究不同pH、螯合時間以及溫度下肽對鋅螯合率的變化。將最優(yōu)條件下制備的肽鋅螯合物（Silkworm Chrysalis Peptide-Zinc，SCP-Zn）凍干，備用。

1.2.4 水解度的測定 采用茚三酮法測定水解度[15]。取0.5 mL 待測樣品，加入蒸餾水補足至2.0 mL，加入茚三酮試劑1.0 mL，立即搖勻，沸水浴15 min，冷卻至室溫，然后加入5.0 mL 40%乙醇，搖勻后，立刻于570 nm 處測定吸光度值。使用蒸餾水為空白參比。采用甘氨酸制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。水解度計算公式見下式：

式中：h 表示被水解的肽鍵數(shù)；htot表示蛋白質(zhì)總肽鍵數(shù)；Ch表示酶解液中的氨基含量，μmol/L；Cm表示原料蛋白質(zhì)中游離氨基的含量，mmol/g；N 表示酶解液蛋白含量，mg/mL；6.25 表示蛋白換算系數(shù)；蠶蛹的htot=8.09[16]。

1.2.5 鋅螯合能力的測定 肽鋅螯合能力的測定用螯合率來表示，螯合率（%）=（螯合鋅含量/總鋅含量）×100。

鋅含量的測定采用GB 5009.14-2017 原子吸收法。其中，螯合鋅的提取采用乙醇沉淀法，如1.2.2所述。

1.2.6 蠶蛹肽鋅螯合物的結(jié)構(gòu)表征

1.2.6.1 紫外光譜分析 向20 mL 5 mg/mL SCP 溶液中分別加入不同量的ZnSO4，使Zn2+濃度為0、1、2、4、8、16 mmol/L，室溫反應(yīng)30 min 后，過0.45 μm混合纖維膜，取濾液備用。分別采用全自動紫外掃描儀于200～500 nm范圍內(nèi)分別進行全波長掃描，考察鋅的加入量對蠶蛹肽中的分子外層電子躍遷情況的影響，進而探究肽鋅螯合情況，采用去離子水調(diào)零。

1.2.6.2 熒光光譜分析 向20 mL 5 mg/mL SCP 溶液中分別加入不同量的ZnSO4，使Zn2+濃度為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 mmol/L，室溫反應(yīng)30 min 后，過0.45 μm 混合纖維膜，取濾液備用。采用熒光光譜儀測定鋅對肽內(nèi)源熒光及肽構(gòu)象的影響。測定條件如下：激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長為300～500 nm，裂縫寬度為10 nm，PMT 為450 V[4]。

1.2.6.3 形貌觀察 采用高分辨率場發(fā)射掃描電鏡測定新鮮制備的SCP 和SCP-Zn 的表面形貌。即將待測樣凍干粉均勻噴涂于導(dǎo)電膠上，噴金后采用FESEM 觀察形貌。

1.2.6.4 元素組成分析 采用元素分析儀測定元素組成。樣品前處理與形貌觀測處理方法相同。

1.2.6.5 粒度分析 采用動態(tài)光散射技術(shù)（DLS）在Nano-ZS 上測定SCP-Zn 的粒徑分布和多分散系數(shù)（PDI）。采用超純水作為分散液稀釋樣品至1 mg/mL，于25 ℃下進行測定，每個樣品至少平行測定三次以上。

1.2.6.6 傅里葉變換紅外光譜分析 采用傅里葉變紅外光譜儀對SCP-Zn 的二級結(jié)構(gòu)進行測定，測定方法參考Van 等[17]和蔡沙等[18]的方法進行改進。各取約25 mg SCP-Zn 凍干粉及SCP 凍干粉分別與225 mg 溴化鉀在研缽中磨勻，壓成薄片后放入紅外光譜儀進行掃描，掃描波長范圍為400～4000 cm-1，連續(xù)掃描128 次，分辨率為2 cm-1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析與顯著性分析，P<0.05 表示差異顯著，采用Origin 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解時間對肽鋅螯合物形成的影響

以水解度和螯合率為指標(biāo)考察酶解時間對肽鋅螯合物形成的影響，如圖1 所示。結(jié)果顯示，隨著酶解時間的延長，水解度先逐漸增加后趨于穩(wěn)定，這符合酶解反應(yīng)的趨勢[18]；同時，肽對鋅的螯合率隨著酶解時間的延長，呈現(xiàn)先增長后下降的趨勢，6 h 酶解液對鋅的螯合率最大（58.05%），顯著高于其它時間點（P<0.05）。天然蛋白質(zhì)內(nèi)部蘊藏著豐富的生理活性肽段，酶解處理可有效將這些肽段釋放出來，而酶的種類及酶解時間等酶解條件，直接影響著肽的種類及數(shù)量，最終決定了酶解液對鋅的螯合能力。堿性蛋白酶來源于枯草桿菌，作為一種絲氨酸內(nèi)切酶，酶切位點廣，被廣泛用于金屬螯合肽的制備[19]，因此本研究選擇堿性蛋白酶作為蠶蛹蛋白水解用酶。一方面，酶解時間是影響酶解產(chǎn)物鋅螯合能力的重要因素，如分別以芝麻蛋白[20]、牡蠣蛋白[4]和米糠蛋白[21]為原料，所制備的酶解液的螯合能力隨著酶解時間呈現(xiàn)先增長后下降的趨勢，與本研究結(jié)果一致。這可能是由于酶解反應(yīng)會釋放金屬螯合位點；另一方面，隨著酶解反應(yīng)的持續(xù)進行，鋅螯合位點與酶解液中的其他組分發(fā)生結(jié)合，如半胱氨酸的巰基作為金屬螯合位點之一，易在酶解過程中發(fā)生氧化，而喪失金屬螯合能力[22]。從圖1 可以看出，蠶蛹蛋白的水解度與其對鋅的螯合能力存在密切關(guān)系，酶解6 h 為蠶蛹鋅螯合肽的最佳制備時間。

圖1 酶解時間對肽鋅形成能力和水解度的影響Fig.1 Effects of hydrolysis time on silkworm peptide-zinc complexation and degree of hydrolysis

2.2 蠶蛹肽鋅納米粒的制備工藝優(yōu)化

為提高SCP-Zn 的制備效率，本研究對蠶蛹肽鋅螯合條件進行探索，如圖2 所示。從圖2 中可以看出，肽鋅質(zhì)量比、pH 及溫度對SCP 和鋅的螯合反應(yīng)影響十分顯著，而反應(yīng)時間則無顯著影響。隨著SCP與ZnSO4質(zhì)量比從1:0.125 增加至1:0.33，肽對鋅的螯合能力保持穩(wěn)定，于1:0.5 時螯合率驟然降至66.3%（圖2A）。這說明蠶蛹肽對鋅的螯合位點有限，當(dāng)質(zhì)量比為1:0.5 時，肽中對鋅的螯合位點已全部被Zn2+占據(jù)。因此，當(dāng)繼續(xù)增加ZnSO4時，螯合鋅的質(zhì)量并不會持續(xù)增加。為保證有足夠的Zn2+與蠶蛹肽結(jié)合形成螯合物，后續(xù)選擇肽鋅質(zhì)量比為1:0.5進一步優(yōu)化螯合物制備工藝。從圖2B 可知，pH 是影響肽和鋅形成螯合物的重要參數(shù)。在不同pH 下（3.0～8.0），蠶蛹肽對鋅的螯合能力變化顯著（P<0.05）。首先，隨著pH 從3.0 增加至6.5，肽鋅螯合能力逐漸增加，并于pH6.5 時達到最大值（66.5%）。這可能是由于在酸性條件下，溶液中的H+與Zn2+競爭反應(yīng)位點，阻礙了肽與鋅的螯合[23]。另外，當(dāng)pH>6.5 時，溶液中的OH-與Zn2+結(jié)合，形成沉淀，從而導(dǎo)致螯合率下降[24]。因此，pH6.5 為蠶蛹肽鋅螯合的最適pH，該結(jié)果與Zhang 等[4]的研究結(jié)果一致。圖2C 為反應(yīng)時間對蠶蛹肽螯合鋅能力的影響，結(jié)果顯示，孵育時間對肽鋅螯合能力無顯著影響（P>0.05）。因此，選擇20 min 為最佳螯合時間。由圖2D 可知，溫度對蠶蛹肽鋅螯合能力影響較大。隨著溫度的增加，蠶蛹肽對鋅的螯合能力也隨著增加，并于55 ℃時達到最大值（72.63%），隨后下降。肽鋅螯合屬于吸熱反應(yīng)，因此，在25～45 ℃內(nèi)，適當(dāng)?shù)募訜嵊兄隍戏磻?yīng)的反應(yīng)速率和平衡系數(shù)增大，利于螯合反應(yīng)的進行與肽的折疊和重組，從而使得肽鋅螯合能力增加；而過度加熱會造成多肽變性，多肽中的配合位點丟失，從而導(dǎo)致肽鋅螯合能力的下降[25]。因此，螯合溫度選擇55 ℃進行后續(xù)的螯合工藝優(yōu)化試驗。

圖2 不同螯合條件對SCP 的鋅螯合能力影響Fig.2 Effects of different chelating conditions on the zincbinding capacity of SCP

因此，本研究確定最佳螯合工藝條件如下：SCP 與ZnSO4質(zhì)量比為1:0.5，pH6.5，時間20 min，溫度為55 ℃。

2.3 蠶蛹肽鋅螯合物的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 紫外光譜分析 圖3 為在SCP 中加入不同劑量的ZnSO4后所得紫外掃描光譜圖。SCP 在202 nm出現(xiàn)強吸收峰；在288 nm 處出現(xiàn)一個弱吸收峰。這兩個吸收峰分別是由肽鍵上的發(fā)色基團（C=O）n→π*、π→π*電子躍遷和酪氨酸的苯環(huán)引起[17]。隨著ZnSO4的加入，這兩個吸收峰發(fā)生了移動和強度逐漸減弱的現(xiàn)象。如，最大吸收峰移至198 nm；288 nm 處的峰值隨著絡(luò)合反應(yīng)的進行逐漸藍移至287 nm，且吸光度值明顯降低，這表明SCP 中的發(fā)色基團（-C=O，-COOH）和助色基團（-OH，-NH2）因參與了螯合反應(yīng)而發(fā)生偏振變化[26]。大豆肽-鋅螯合物[27]和花生肽-鋅螯合物[28]也呈現(xiàn)出相似的紫外光譜變化。這說明SCP 與鋅發(fā)生了螯合反應(yīng)。

圖3 Zn2+的劑量對SCP 紫外可見光譜的影響Fig.3 Effect of zinc dosage on the Ultraviolet-visible spectrum of SCP

2.3.2 熒光光譜分析 由于蛋白質(zhì)中含有苯丙氨酸（Phe）、酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）等可在一定波長下激發(fā)產(chǎn)生內(nèi)源熒光的氨基酸，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)或多肽結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，如折疊或與小分子物質(zhì)結(jié)合后，熒光強度即會發(fā)生改變，因此內(nèi)源熒光強度的變化能夠間接反映蛋白質(zhì)或肽與Zn2+的結(jié)合程度[29]。圖4 為Zn2+對SCP 熒光光譜的影響，隨著Zn2+的增加，SCP 熒光光譜峰峰值逐漸降低，最終峰值趨于穩(wěn)定。圖中，隨著Zn2+濃度從0 增加至9 mmol/L，樣品熒光強度從1217.8 降低到804.0。其中，當(dāng)1 mmol/L Zn2+加入時，樣品的內(nèi)源熒光強度下降幅度最大。資料顯示，蛋白質(zhì)或肽與金屬螯合時易發(fā)生折疊，聚集現(xiàn)象，從而導(dǎo)致內(nèi)源熒光淬滅[26,30]。同時，由于肽的螯合位點有限，圖4 顯示，Zn2+濃度達到8 mmol/L 時，繼續(xù)增加Zn2+的量，熒光強度值無明顯變化，說明此時SCP 中的金屬螯合位點完全被占據(jù)。該結(jié)果與Meng等[31]報道一致，即Zn2+的引入會使得羅非魚膠原蛋白肽的內(nèi)源熒光強度降低。

圖4 Zn2+的劑量對SCP 熒光光譜的影響Fig.4 Effect of zinc dosage on fluorescence spectrum of SCP

2.3.3 形貌觀察及元素組成分析 從圖5 可以看出，SCP 和SCP-Zn 的表面形貌有顯著不同。SCP 呈現(xiàn)光滑的片狀，而SCP-Zn 呈顆粒狀結(jié)構(gòu)，且粒徑均勻。造成這一變化的主要原因是金屬離子與肽存在很強的相互作用，二者結(jié)合造成了肽的聚集。研究顯示Zn2+會加速肽的二聚反應(yīng)，并穩(wěn)定二聚體的結(jié)構(gòu)，該聚合作用的作用力主要為分子間作用力、表面張力以及晶體的各向異性，而肽鏈中參與聚合的基團主要是-SH、-COOH 和-NH，三者通過分子間氫鍵參與聚合反應(yīng)[5,8,22]。此外，肽鏈中的氨基可與Zn2+結(jié)合發(fā)生脫水后形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使得肽中的親水基團被隱藏于聚集體內(nèi)部，從而造成SCP-Zn 具有一定的疏水性[32]。

圖5 SCP 和SCP-Zn 的掃描電鏡圖（SEM）Fig.5 SEM images of SCP and SCP-Zn

SCP 和SCP-Zn 的表面元素組成分析顯示，兩個樣品中均含有Cl、C、N、O、Na、Zn、P、S 和K 等元素。為了便于分析肽鋅螯合前后肽與鋅組成比例的變化，特將C、N、O、Zn 四種元素提取出來，并計算質(zhì)量百分比，如表1 所示。SCP 中C、N、O 三種元素占比高達99.87%，Zn 僅占0.13%，而SCPZn 中C、N、O 三種元素占比為62.54，鋅含量高達37.46%。這說明，肽與鋅的成功螯合大大提高了肽中鋅的含量。

表1 SCP 和SCP-Zn 的表面元素組成相對含量（%）Table 1 Surface elemental compositions of SCP and SCP-Zn (%)

2.3.4 粒徑分析 粒徑大小依賴于粒子的體積大小，是表征待測物質(zhì)物理性質(zhì)的一個重要參數(shù)。表2 顯示，SCP 和SCP-Zn 的平均粒徑分別為153.36±2.31（PDI：0.35±0.01）和71.99±0.67 nm（PDI：0.27±0.05）。與SCP 相比，SCP-Zn 的粒徑顯著降低，且分布更加集中，這說明在SCP 和Zn2+螯合后發(fā)生了折疊、聚集，該結(jié)果與熒光光譜結(jié)論一致。另外，SCP-Zn 的PDI 值小于SCP，進一步證實SCP-Zn 粒徑分布更為集中。Zheng 等[33]在椰子餅球蛋白肽-Zn 螯合物中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。

2.3.5 紅外光譜分析（FTIR）FTIR 是表征肽鋅螯合物結(jié)合機制的一種有效方法，峰強度變化及位移可以反映肽與金屬離子之間的作用位點[24]。為更好的闡明SCP 與Zn 的螯合作用，本研究運用FTIR 對SCP 和SCP-Zn 進行檢測。如圖6 所示，與SCP 相比，SCP-Zn 的紅外光譜圖發(fā)生了明顯變化，如由 NH 伸縮振動和O-H 伸縮振動產(chǎn)生酰胺A 吸收峰從3303 cm-1移至3273 cm-1，飽和碳的 C-H 吸收峰2934 cm-1消失，主要由-C=O 伸縮振動引起酰胺I 帶（1700～1600 cm-1）由1650 cm-1移至1604 cm-1，主要反映N-H 彎曲振動及 C-N 伸縮振動的酰胺II帶（1600～1500 cm-1）由1556 cm-1移至1524 cm-1，-COO-由1408 cm-1移至1417 cm-1，而酰胺III 帶作為C-N 伸縮振動及N-H 平面內(nèi)彎曲振動的主要反映[34]，由1239 cm-1移至1244 cm-1，-C-O 吸收峰由1022 cm-1移至1042 cm-1。這說明，SCP 中含有-COOH、-C=O 及-NH2，而SCP-Zn 中肽的FTIR 譜圖峰強度及位置的變化說明這些基團參與了螯合反應(yīng)，是SCP-Zn 的主要螯合位點[35]。國內(nèi)外研究學(xué)者普遍認為肽中氨基酸殘基的羧基是金屬螯合的主要位點[36]。如Ca2+與海參卵肽的螯合位點、Zn2+與玉米肽的螯合位點均為-COOH、-NH2、-C=O[37-38]，Sun等[39]采用FTIR 發(fā)現(xiàn)，肽中氨基的N 原子和羧基的O 原子是Zn2+螯合的主要位點。

圖6 SCP 和SCP-Zn 紅外光譜分析Fig.6 FTIR analysis of SCP and SCP-Zn

3 結(jié)論

本研究將蠶蛹肽和Zn2+進行螯合，以螯合率為主要指標(biāo)，采用單因素實驗，確定了蠶蛹肽制備的最佳酶解時間為6 h，肽鋅螯合物的最佳制備工藝條件為肽鋅比1:0.5、pH6.5、溫度55 ℃、時間20 min，此時螯合率達72.63%。對蠶蛹肽與Zn2+螯合前后進行結(jié)構(gòu)表征發(fā)現(xiàn)，鋅的結(jié)合會引起蠶蛹肽發(fā)生偏振變化、熒光淬滅、表面形貌及元素組成的改變。SCP-Zn 為一納米粒子，其表面呈顆粒狀結(jié)構(gòu)，鋅相對含量高達37.46%。紅外光譜發(fā)現(xiàn)，Zn2+的主要螯合位點為肽鏈中的-COOH、-C=O 及-NH2。本研究對豐富有機補鋅制劑，開拓蠶蛹加工途徑，提升蠶蛹價值提供理論依據(jù)。經(jīng)制備而得的肽鋅納米粒是一混合物，其中的有效活性組分有待于進一步分離、鑒定，其胃腸穩(wěn)定性及促鋅吸收活性尚需進一步研究。