節(jié)律基因CLOCK 單核苷酸多態(tài)性與生活方式在學(xué)齡前兒童肥胖中的交互作用

劉 玲，林秀雯

近年來，兒童肥胖已經(jīng)成為一個(gè)日趨嚴(yán)重、全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[1]。 有研究顯示[2]，多數(shù)肥胖青少年在學(xué)齡前體質(zhì)量增加幅度最為明顯，而學(xué)齡前時(shí)期體質(zhì)量增長(zhǎng)過快可造成兒童青春期前肥胖和體脂過度，導(dǎo)致青春期早發(fā)。 另有研究顯示[3]，日常的不良生活行為因素是兒童肥胖的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因此學(xué)齡前兒童早期肥胖是青少年肥胖持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵時(shí)期，探究該階段兒童肥胖的不良生活方式并進(jìn)行及時(shí)干預(yù)防控對(duì)兒童的身心發(fā)展是至關(guān)重要的。

肥胖是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。晝夜節(jié)律運(yùn)動(dòng)輸出周期故障 （circadian locomotor output cycles kaput，CLOCK）基因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物生物鐘基因， 對(duì)人體生物鐘及多種生理參數(shù)具有重要的調(diào)節(jié)作用[4，5]。 其中節(jié)律基因CLOCK 單核苷酸T3111C 位點(diǎn) （簡(jiǎn)稱T3111C 位點(diǎn)） 多態(tài)性不僅與睡眠-覺醒周期有關(guān)，還與體質(zhì)量有關(guān)。 有研究顯示[6]，T3111C 位點(diǎn)多態(tài)性與兒童的飲食習(xí)慣有關(guān)， 是改變飽腹感飲食行為的遺傳危險(xiǎn)因素，可能與兒童早期肥胖的發(fā)生存在一定聯(lián)系。 但是，目前有關(guān)此方面的研究?jī)?nèi)容較少，對(duì)T3111C 位點(diǎn)多態(tài)性與肥胖之間的聯(lián)系還存在較大爭(zhēng)議。 對(duì)此，筆者通過分析T3111C 位點(diǎn)多態(tài)性及生活方式在不同兒童中的分布狀態(tài)，探索二者交互作用與肥胖的關(guān)系，以期為兒童的健康方案的精準(zhǔn)化管理及預(yù)防提供相應(yīng)的理論支持。

1 材料與方法

1.1 臨床材料

選擇2021 年6 月至2022 年6 月在佛山復(fù)星禪誠(chéng)醫(yī)院兒童保健門診查體的肥胖兒童60 例 （肥胖組），其中男性34 例，女性26 例；年齡3 ～6 歲，平均年齡5.42 歲（標(biāo)準(zhǔn)差1.23 歲）；體質(zhì)量16.54 ～18.73 kg，平均體質(zhì)量17.08 kg（標(biāo)準(zhǔn)差2.75 kg）。另選擇100 例體質(zhì)量正常的健康兒童作為對(duì)照組，其中男性57 例，女性43 例；年齡3 ～6 歲，平均年齡5.39 歲（標(biāo)準(zhǔn)差1.16 歲）；體質(zhì)量13.75 ～15.21 kg，平均體質(zhì)量14.96 kg（標(biāo)準(zhǔn)差2.45 kg）。 所有納入該研究患兒及其家屬均知情并簽署知情同意書。

選擇標(biāo)準(zhǔn)： 根據(jù)兒童身高的體質(zhì)量≥美國(guó)國(guó)家健康統(tǒng)計(jì)中心和（或）世界衛(wèi)生組織（National Center for Health Statistics/World Health Organization，NCHS/WHO）標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量的120%。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①與遺傳、內(nèi)分泌、代謝、中樞神經(jīng)疾病有關(guān)的肥胖和肥胖綜合征；②長(zhǎng)期或間斷補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)品者；③圍產(chǎn)期異常者；④攝食異常、心理疾病患兒；⑤原發(fā)肝腎等器質(zhì)性病變； ⑥不愿配合研究調(diào)查者；⑦兒童直系父母合并精神異常不能完成調(diào)查者；⑧未跟隨父母生活的兒童。

兩組性別、 年齡比較， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料和生活方式收集

通過調(diào)查問卷收集兒童的臨床資料和生活方式（問卷由父母或監(jiān)護(hù)人填寫）， 臨床資料包括兒童性別、年齡、出生體質(zhì)量、分娩方式、家庭情況等。生活方式包括兒童膳食結(jié)構(gòu)（豆制品、海產(chǎn)品、奶制品、蔬菜、水果等）、睡眠時(shí)間、屏幕接觸時(shí)間（電視、計(jì)算機(jī)、游戲機(jī)等）、戶外活動(dòng)時(shí)間等。

1.2.2 基因多態(tài)性檢測(cè)

1.2.2.1 DNA 提取 采集兒童空腹外周血5 mL[乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝]，參照DNA 純化試劑盒說明書（Promega 公司，美國(guó)）從外周血單核細(xì)胞中提取基因組DNA，-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 基因型檢測(cè) 采用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增目的基因。 反應(yīng)體系：50 ng 基因組DNA，7 μL 2 × PCR 緩沖溶液，15 mmol/L MgCl2，5 μmol/L 引物，0.55 UTag酶（天根公司，中國(guó)北京）。 反應(yīng)條件：94 ℃15 min，94 ℃20 s，56 ℃30 s，72 ℃60 s，72 ℃3 min，啟動(dòng)PCR 反應(yīng)。 通過酶切反應(yīng)可知T3111C 位點(diǎn)存在3 種基因型， 野生TT、雜合突變TC 和純合突變CC，基因分型見圖1。

圖1 T3111C 位點(diǎn)基因分型圖Fig.1 Diagram of T3111C locus genotyping

引物序列如下：T3111C F 5"-TCCAGCAGTTTCATGAGATGC-3"，R5"-GAGGTCATTTCAAGCTGAGC-3"。

1.2.3 分析方法

利用Excel 計(jì)算樣本群體是否符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P＞0.05 為符合）；通過多因素Logistics 回歸分析肥胖的危險(xiǎn)因素。 通過比值比（odds ratio，OR）及95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度，分析T3111C 位點(diǎn)多態(tài)性與生活方式因素在學(xué)齡前兒童肥胖中的交互作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

通過SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。 以平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示計(jì)量資料，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較；使用百分?jǐn)?shù)（%）表示計(jì)數(shù)資料，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)

經(jīng)Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，T3111C 位點(diǎn)各基因型分布符合Hardy-Weinberg 定律（P＞0.05）。 見表1。 這提示該研究所納入樣本群體具有良好的代表性。

表1 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)Tab.1 Result of Hardy-Weinberg genetic equilibrium test

2.2 兩組T3111C 位點(diǎn)多態(tài)性基因型及等位基因頻率分布比較

兩組兒童TT 基因型頻率、TC 基因型頻率、CC 基因型頻率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組兒童基因T 分布和基因C 分布比較， 差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。 見表2。

表2 兩組T3111C 位點(diǎn)多態(tài)性基因型和等位基因比較Tab.2 Comparison of T3111C polymorphism genotype and allele between 2 groups

2.3 兩組臨床資料及生活方式比較

對(duì)比兩組兒童臨床資料及生活方式可知，兩組兒童出生體質(zhì)量、暴飲暴食、屏幕接觸時(shí)間、戶外活動(dòng)時(shí)間、豆制品、海產(chǎn)品、垃圾食品方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見表3。

表3 兩組臨床資料及生活方式比較Tab.3 Comparison of general data and lifestyle between 2 groups

2.4 Logistic 回歸分析學(xué)齡前兒童肥胖的危險(xiǎn)因素

以兒童是否肥胖作為因變量（否=0，是=1），以2.3節(jié)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素及T3111C 位點(diǎn)基因型作為自變量（賦值見表4）進(jìn)行Logistic 多因素回歸分析。 結(jié)果顯示，暴飲暴食、戶外活動(dòng)時(shí)間＜30 min/d、垃圾食品≥3 次/周、 豆制品＜3 次/周、T3111C 位點(diǎn)攜帶TT 基因型是影響學(xué)齡前兒童肥胖的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。 見表5。

表4 學(xué)齡前兒童肥胖的Logistic 多因素回歸分析賦值變量表Tab. 4 Logistic multivariate regression analysis of preschool children obesity assignment variable table

表5 Logistic 回歸分析學(xué)齡前兒童肥胖的危險(xiǎn)因素Tab.5 Logistic regression analysis of risk factors of obesity in preschool children

2.5 T3111C 位點(diǎn)多態(tài)性與生活方式因素在學(xué)齡前兒童肥胖中的交互作用

T3111C 位點(diǎn)TT 基因型與暴飲暴食、戶外活動(dòng)時(shí)間、豆制品及垃圾食品攝入量均有正交互作用（表6）。其中暴飲暴食同時(shí)攜帶TT 基因型者與不暴飲暴食同時(shí)攜帶CC 基因型者相比，肥胖風(fēng)險(xiǎn)前者是后者的2.936 倍；戶外活動(dòng)時(shí)間＜30 min/d 同時(shí)攜帶TT 基因型者與戶外活動(dòng)時(shí)間≥30 min/d 同時(shí)攜帶CC 基因型者相比，前者肥胖風(fēng)險(xiǎn)是后者的3.235 倍；豆制品＜3 次/周且攜帶TT 基因型者與豆制品≥3 次/周且攜帶CC 者相比，肥胖風(fēng)險(xiǎn)前者是后者的3.540 倍；垃圾食品≥3 次/周同時(shí)攜帶TT 基因型者與垃圾食品＜3 次/周同時(shí)攜帶CC 基因型者相比，前者肥胖風(fēng)險(xiǎn)是后者的4.573 倍。

表6 T3111C 位點(diǎn)多態(tài)性與生活方式因素在學(xué)齡前兒童肥胖中的交互作用Tab.6 Interaction between T3111C polymorphism and lifestyle factors in preschool children with obesity

3 討論

隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展和生活水平的不斷提高，無(wú)論發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家，學(xué)齡前兒童的超重和肥胖率均呈迅速上升趨勢(shì)[7]。據(jù)專家預(yù)測(cè)，若不采取有效的干預(yù)措施，到2030 年，超重肥胖的兒童數(shù)將增至近5 000 萬(wàn)人[8]。 肥胖不光是一種營(yíng)養(yǎng)性的疾病，還會(huì)影響身體其他器官，導(dǎo)致代謝發(fā)生異常，對(duì)兒童的身心健康造成了嚴(yán)重威脅。因此探究學(xué)齡前兒童肥胖的相關(guān)影響因素并進(jìn)行有效的控制和預(yù)防是至關(guān)重要的。

既往研究結(jié)果表明[9]，人體內(nèi)多種代謝和生理功能均是由晝夜節(jié)律系統(tǒng)控制的，生物鐘蛋白紊亂可誘發(fā)多種疾病。 節(jié)律基因CLOCK 是內(nèi)源性分子晝夜生物鐘的最重要的基因之一，它參與轉(zhuǎn)錄-翻譯的蛋白產(chǎn)物是人體形成晝夜節(jié)律的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，在人體正常的代謝活動(dòng)中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用[10，11]。 近年來，研究者發(fā)現(xiàn)T3111C 位點(diǎn)多態(tài)性與機(jī)體脂代謝異常有關(guān)，可引發(fā)功能性改變，增加肥胖風(fēng)險(xiǎn)。在一項(xiàng)有關(guān)飲食與超重和肥胖患者血脂間關(guān)系的研究中提到，在T3111C 位點(diǎn)多態(tài)性不同組中，患者間的血脂差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[12]。而另一項(xiàng)研究顯示[13]，T3111C位點(diǎn)中具有C 等位基因的個(gè)體體質(zhì)量較低， 肥胖的風(fēng)險(xiǎn)較低。 筆者研究發(fā)現(xiàn)，通過對(duì)比肥胖兒童和正常兒童T3111C 位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布發(fā)現(xiàn)，肥胖組兒童TT 基因型的人數(shù)占比顯著高于對(duì)照組兒童， 而TC 和CC 基因型的人數(shù)占比低于對(duì)照組，Logistic 多因素回歸分析顯示，T3111C 位點(diǎn)攜帶TT基因型是影響學(xué)齡前兒童肥胖的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這提示T3111C 位點(diǎn)中TT 基因型的兒童相比于TC 和CC基因型兒童更易肥胖。 研究顯示[14]，多數(shù)復(fù)雜疾病均為環(huán)境因素和遺傳易感性共同作用的結(jié)果。因此環(huán)境因素在學(xué)齡前兒童肥胖的發(fā)生發(fā)展中也具有舉足輕重的作用。 研究顯示[15]，不良的飲食習(xí)慣和體育運(yùn)動(dòng)量的不足是導(dǎo)致兒童肥胖的最主要原因。豆制品中的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸可顯著改善兒童機(jī)體內(nèi)的胰島素抵抗，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)程度的同時(shí)達(dá)到控制體質(zhì)量的效果[16]。 筆者通過行Logistic 多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，暴飲暴食、戶外活動(dòng)時(shí)間＜30 min/d、垃圾食品≥3 次/周、 豆制品＜3 次/周是影響學(xué)齡前兒童肥胖的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。 這提示，在日常生活中家長(zhǎng)應(yīng)注意兒童的生活方式，做到規(guī)律進(jìn)食、減少垃圾食品攝入、增加豆制品攝入的同時(shí)還應(yīng)注意增加戶外活動(dòng)時(shí)間，以降低兒童肥胖風(fēng)險(xiǎn)。

通過交互作用指標(biāo)對(duì)兩因素間的交互作用進(jìn)行定量分析是流行病學(xué)常用的一種評(píng)估方法。分析基因和環(huán)境的交互作用可更加深入地了解環(huán)境因素對(duì)遺傳因素易感性的影響及疾病的發(fā)生機(jī)制[17]。 目前關(guān)于T3111C 位點(diǎn)多態(tài)性與生活方式因素的交互作用在肥胖發(fā)病機(jī)制中所扮演的角色還尚未有研究報(bào)道，這是因?yàn)樵撐稽c(diǎn)多態(tài)性與肥胖之間的關(guān)聯(lián)尚處于探究階段。 筆者研究結(jié)果顯示，T3111C 位點(diǎn)TT 基因型與暴飲暴食、戶外活動(dòng)時(shí)間、豆制品及垃圾食品攝入量均有正交互作用。 其中暴飲暴食同時(shí)攜帶TT 基因型者與不暴飲暴食同時(shí)攜帶CC 基因型者相比，肥胖風(fēng)險(xiǎn)前者是后者的2.936 倍；戶外活動(dòng)時(shí)間＜30 min/d 同時(shí)攜帶TT 基因型者與戶外活動(dòng)時(shí)間≥30 min/d 同時(shí)攜帶CC 基因型者相比， 前者肥胖風(fēng)險(xiǎn)是后者的3.235 倍； 豆制品＜3 次/周且攜帶TT 基因型者與豆制品≥3 次/周且攜帶CC 者相比， 肥胖風(fēng)險(xiǎn)前者是后者的3.540 倍；垃圾食品≥3 次/周同時(shí)攜帶TT 基因型者與垃圾食品＜3 次/周同時(shí)攜帶CC 基因型者相比，前者肥胖風(fēng)險(xiǎn)是后者的4.573 倍。 究其機(jī)制，筆者猜測(cè)，這可能是由于T3111C 位點(diǎn)與腦組織中的蛋白表達(dá)存在密切關(guān)聯(lián)，可通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)體質(zhì)量進(jìn)行一定的調(diào)節(jié)，TT 基因型的兒童可能受神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用更傾向于攝入高熱量食物， 對(duì)豆制品、海產(chǎn)品、蔬菜水果等攝入不足，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的胰島素抵抗加重，導(dǎo)致高熱食物吸收后無(wú)法及時(shí)代謝，造成脂肪堆積，進(jìn)而為肥胖的發(fā)生創(chuàng)造了條件。此外，體育活動(dòng)的不足對(duì)脂肪酸合成酶的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而減少了脂肪的生成，反之則增加肥胖風(fēng)險(xiǎn)，這與筆者研究結(jié)果相符。

筆者研究局限性：所納入樣本數(shù)量較少，可能一定程度上會(huì)影響分析結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性； 其次，肥胖發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，影響的因素也很多，筆者研究未完全納入。 對(duì)此，筆者將在未來研究中進(jìn)一步證實(shí)該研究的分析結(jié)果。

綜上所述，暴飲暴食、戶外活動(dòng)時(shí)間＜30 min/d、垃圾食品≥3 次/周、 豆制品＜3 次/周、T3111C 位點(diǎn)攜帶TT 基因型是影響學(xué)齡前兒童肥胖的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。節(jié)律基因CLOCK 單核苷酸T3111C 位點(diǎn)TT 基因型與暴飲暴食、戶外活動(dòng)時(shí)間、豆制品及垃圾食品攝入量均有正交互作用。