IL-15 轉(zhuǎn)染人CIK 細(xì)胞對HT-29 的殺瘤效果探究

王柏濤，梁宇堃，王丙萍，楊超旗，高艷偉b

作為較為多見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤， 結(jié)腸癌（colorectal cancer，CRC）的致死率已躍居癌癥死亡率前列[1]，中國新近CRC 發(fā)病人數(shù)顯現(xiàn)迅速上漲態(tài)勢。當(dāng)前雖已對CRC 的發(fā)生發(fā)展及其浸潤、 轉(zhuǎn)移機(jī)制有了一定認(rèn)知，但由于早期癥狀多不典型，大多發(fā)現(xiàn)時已屬晚期[2]。 手術(shù)、化學(xué)治療和放射治療為CRC 主要治療方式，但此類療法復(fù)發(fā)率及病死率較高，且預(yù)后差。 作為腫瘤治療的第4 種模式，免疫治療現(xiàn)已成為多數(shù)惡性腫瘤的標(biāo)準(zhǔn)療法[3]，且過繼性細(xì)胞免疫療法已在治療某些血液系統(tǒng)疾病中獲得較好療效[4]。

具備自然殺傷T 細(xì)胞表型特性，同時多細(xì)胞因子參與調(diào)控所致的細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷（cytokine-induced killer，CIK）細(xì)胞，多數(shù)學(xué)者基于其增殖速度、抗瘤殺瘤等方面的優(yōu)越性[5]，CIK 療法已然變成腫瘤免疫學(xué)研究的關(guān)鍵所在。 白細(xì)胞介素（interleukin，IL）15（IL-15）已被證實可顯著增強(qiáng)CIK 細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性[6]。筆者實驗對IL-15 基因（IL-15）轉(zhuǎn)染人CIK 細(xì)胞治療CRC 進(jìn)行初步探究，評估其對人CRC 細(xì)胞株HT-29細(xì)胞的殺傷效果。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗病毒、細(xì)胞與血液樣本

攜帶IL-15的慢病毒上清液（GeneChem Company，中國上海）。

人CRC 株HT-29 由內(nèi)蒙古自治區(qū)腫瘤研究所供給。

靜脈采集健康成年人血液標(biāo)本15 mL。 取得患者知情同意并簽署知情同意書（編號：20220709）。

1.1.2 主要試劑

達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)液 （Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Gibco， 美國）； 異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate isomer，F(xiàn)ITC）-白細(xì)胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）3、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）-CD56、 鼠抗人FITC-IgG （BD， 美國）；GT-551（TaKaRa， 日本）；KBM-551 培養(yǎng)液 （康寧生命，中國）；CD3 單抗（蘇州VANVO，中國）；干擾素γ（interferon γ，IFN-γ）、IL-1α、IL-2（R ＆ D，美國）； CCK-8（北京沃比森，中國）；細(xì)胞因子IL-15、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、IFN-γ 酶聯(lián)免疫吸附分析 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（BD，美國）。

1.1.3 儀器與設(shè)備

離心管、細(xì)胞培養(yǎng)皿（Costar，美國）；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD，美國) ；CO2培養(yǎng)箱（賽默飛，美國）；超凈臺（AIRTECH，中國）；熒光顯微鏡（徠卡，德國）；恒溫水浴鍋（RADOBIO，中國）；電子天平（METTLER TOLEDO，中國）；多量程移液器（Brand，德國）；-80 ℃超低溫冰箱（REVCO， 美國）； 酶標(biāo)儀 （北京PERLONG，中國）。

1.2 方法

1.2.1 CIK 細(xì)胞培養(yǎng)

將血液標(biāo)本15 mL 用0.9%氯化鈉溶液（NaCl 溶液）稀釋至30 mL，與淋巴細(xì)胞分離液混合（混合比=1 ∶2.5）離心后制備成功外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。 培養(yǎng)液設(shè)為GT-551，濃度調(diào)至2 × 106/mL，依培養(yǎng)進(jìn)程，將IFN-γ、IL-1α、IL-2 等細(xì)胞因子及CD3 單抗加入后染色，觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2IL-15轉(zhuǎn)染CIK 細(xì)胞

取出購買含IL-15的病毒上清液。將PBMC 制備的CIK 細(xì)胞培養(yǎng)5 d，細(xì)胞濃度更換為1×106/mL 后預(yù)備轉(zhuǎn)染。 CIK 細(xì)胞與含IL-15的慢病毒各1 mL 混合后重新懸浮。 在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)孵育2 h。 之后按25 r/s 離心300 s。 后將上清液棄置，用KBM-551 重懸沉淀物。間隔1 d 用上述病毒的上清液，再次進(jìn)行轉(zhuǎn)染。依據(jù)之前的步驟，將上清液按以往轉(zhuǎn)速再次離心300 s。 收集上清液置于-80 ℃冰箱備再次實驗用。

1.2.3 流式細(xì)胞檢測

（1）CIK 細(xì)胞鑒定：培養(yǎng)3 ～4 d 后，CIK 細(xì)胞聚集成團(tuán)且集落形成；經(jīng)清洗、染色等步驟后，上機(jī)鑒定。

（2）CIK 細(xì)胞感染效率鑒定：轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)2 d后，在光學(xué)顯微鏡下詳細(xì)觀察CIK 的感染效率。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附分析

分別提取IL-15-CIK 細(xì)胞及CIK 細(xì)胞培養(yǎng)7、11、14 d 的上清液1 mL， 用ELISA 法檢測IL-15、IFN-γ 和TNF-α 的表達(dá)水平。 以未轉(zhuǎn)染的CIK 所培育出的上清液作參照。實驗前將所有細(xì)胞的上清液冰上融化至液態(tài)，同時將檢測試劑盒平衡至室溫，按照ELISA 細(xì)胞因子檢測試劑盒的說明進(jìn)行檢測操作。

1.2.5 結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)

將人CRC 細(xì)胞株HT-29 培養(yǎng)、傳代于DMEM 中（內(nèi)含10% FBS、100 μg/mL 青/鏈霉素）。

1.2.6 CCK-8 法檢測IL-15-CIK 細(xì)胞對結(jié)腸癌細(xì)胞的殺瘤效果

取培養(yǎng)24 h 的CRC 細(xì)胞作為靶細(xì)胞，取制備好的CIK 和IL-15-CIK 細(xì)胞用作測定實驗中的效應(yīng)細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞分為兩組，調(diào)整靶細(xì)胞濃度為5×103/孔，按效靶比（E∶T）5∶1、10∶1、20∶1、25∶1 混合后經(jīng)培養(yǎng)箱孵育1 d，每孔各添加15 μL 的CCK-8，酶標(biāo)儀測量出光密度（optical density，OD），并測算殺傷率。

殺傷率（%）=[1-（研究組OD -效應(yīng)細(xì)胞OD）/靶細(xì)胞OD]×100%。

1.2.7 殺瘤前后HT-29 細(xì)胞中細(xì)胞因子含量測定

選連續(xù)培育14 d 效應(yīng)細(xì)胞。 收集E∶T 為25∶1時IL-15-CIK 及CIK 細(xì)胞對HT-29 細(xì)胞株作用前后的上清液各0.5 mL， 用ELISA 法檢測上清液內(nèi)IL-15、IFN-γ、TNF-α 含量變化。以未轉(zhuǎn)染的CIK 所培育出的上清液作參照。實驗前將所有細(xì)胞的上清液冰上融化至液態(tài)， 同時將檢測試劑盒平衡至室溫， 按照ELISA 法細(xì)胞因子（IL-15、IFN-γ、TNF-α）檢測試劑盒的說明進(jìn)行檢測操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析處理均選用SPSS 22.0 版本。 計數(shù)、計量資料分別以百分率（%）、均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示；組間比較依情況可選用F檢驗、t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIK 及轉(zhuǎn)基因CIK 細(xì)胞的鑒定

取連續(xù)培養(yǎng)5 d 的CIK 細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下仔細(xì)觀察可見細(xì)胞增殖明顯，數(shù)目增多，胞體增大，形態(tài)漸趨飽滿，成團(tuán)簇狀分布，且形成集落（圖1）；以鼠抗人IgG 為同型對照， 經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定為CIK 細(xì)胞（圖2）；將培養(yǎng)5 d 的CIK 細(xì)胞，用含IL-15的慢病毒感染48 h 后， 倒置熒光顯微鏡鏡下觀察其明場圖和熒光圖，說明轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型構(gòu)建成功（圖3）。

圖1 培養(yǎng)第5 天CIK 細(xì)胞（200× ）Fig.1 Image of CIK cells cultured for 5-day(200×)

圖2 CIK 細(xì)胞鑒定流式圖Fig.2 Flow cytometry diagrams of CIK cell identification

圖3 IL-15-CIK 細(xì)胞的明場圖（A）和熒光圖（B）（50×）Fig.3 Bright field diagram(A)and fluorescence image(B)of IL-15-CIK cells(50×)

2.2 兩種效應(yīng)細(xì)胞對結(jié)腸癌細(xì)胞的作用比較

CCK-8 法檢測結(jié)果顯示，E ∶T 為10 ∶1 時，IL-15-CIK 細(xì)胞與CIK 細(xì)胞對CRC 靶細(xì)胞具有殺傷能力， 但殺傷活性相比較， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。隨著E ∶T 增加，殺傷活性逐漸增強(qiáng)，CRC 細(xì)胞被IL-15-CIK 細(xì)胞及細(xì)胞CIK 細(xì)胞有效裂解。當(dāng)E ∶T 達(dá)到25 ∶1，IL-15-CIK 細(xì)胞與CIK 細(xì)胞對CRC 細(xì)胞的殺傷作用相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。 光學(xué)顯微鏡下對比觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)HT-29 被殺傷前，細(xì)胞呈良好貼壁狀態(tài)（圖4A）；IL-15-CIK 細(xì)胞殺傷HT-29 細(xì)胞后，細(xì)胞貼壁狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)為半貼壁，大量細(xì)胞死亡（圖4 B）；CIK 細(xì)胞殺傷HT-29 細(xì)胞時，細(xì)胞死亡數(shù)量明顯少于IL-15-CIK 細(xì)胞殺傷后 （圖4C）。 由此說明，IL-15-CIK 細(xì)胞對CRC 靶細(xì)胞的殺傷能力強(qiáng)于CIK 細(xì)胞。

表1 不同E ∶T 下CRC 細(xì)胞的殺傷率比較Tab.1 Comparison of killing rate of CRC cells at different E ∶T

圖4 HT-29 細(xì)胞殺瘤前后效果對比光學(xué)顯微鏡圖Fig.4 Image of optical microscopy of HT-29 cells before and after tumor-killing

2.3 兩種細(xì)胞中細(xì)胞因子的分泌及其對HT-29 細(xì)胞株殺瘤時影響

2.3.1 不同培養(yǎng)時間兩種細(xì)胞的細(xì)胞因子含量比較

在IL-15-CIK 細(xì)胞及CIK 細(xì)胞培養(yǎng)7 d、11 d、14 d中， 兩種細(xì)胞上清液中IL-15、IFN-γ 及TNF-α 的含量均隨著時間的增長而升高，并且可以觀察到轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的3 種細(xì)胞因子含量顯著高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，兩種細(xì)胞間差異明顯，兩種細(xì)胞間不同時間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 但在IL-15-CIK 細(xì)胞中觀察到，TNF-α含量在11 d 與14 d 內(nèi)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其余時間相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見表2。

表2 兩種細(xì)胞不同培養(yǎng)時間IL-15、IFN-γ、TNF-α 含量比較Tab.2 Comparison of IL-15，IFN-γ and TNF-α content at different culture time between 2 cell lines

2.3.2 培養(yǎng)14 d 兩種細(xì)胞殺瘤前后細(xì)胞因子含量比較

選體外培養(yǎng)14 d 的IL-15-CIK 細(xì)胞及CIK 細(xì)胞以E ∶T=25 ∶1 對HT-29 細(xì)胞株作用后，檢測到兩種上清液中IL-15、IFN-γ、TNF-α 的含量較殺瘤前有所變化。在CIK 細(xì)胞中，IFN-γ 含量顯著變高，較殺瘤前差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但I(xiàn)L-15、TNF-α 的含量雖有所增加， 但這種變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 在IL-15-CIK 細(xì)胞中，IL-15、IFN-γ、TNF-α含量均較殺瘤前明顯升高， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 通過對比發(fā)現(xiàn)，IL-15-CIK 細(xì)胞3 種細(xì)胞因子的含量與CIK 細(xì)胞相比，明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見表3。

表3 兩種細(xì)胞殺瘤前后細(xì)胞因子含量比較Tab.3 Comparison of cytokine content before and after tumor-killing between 2 cell line

3 討論

免疫治療是目前除傳統(tǒng)手術(shù)切除、放化療及靶向藥物外，最具發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤新興療法[7]。而從機(jī)體自身或其他機(jī)體提取出的免疫細(xì)胞，通過擴(kuò)增、基因工程改造等方式，重新返回機(jī)體，以期激發(fā)免疫應(yīng)答反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮抗瘤作用的診療思路，意即過繼性細(xì)胞療法（adoptive cell therapy，ACT）。 此種療法已在臨床部分腫瘤中得到廣泛應(yīng)用[8]。 近年來發(fā)現(xiàn)CIK 細(xì)胞在增殖速度、抗瘤效果方面具備一定優(yōu)勢，通過與相關(guān)細(xì)胞因子共同作用，從而提升其生物學(xué)屬性[9]。細(xì)胞因子參與調(diào)控免疫反應(yīng)，扮演重要角色，對腫瘤的新興療法方面有遠(yuǎn)大前景。 IL 作為一組白細(xì)胞重點表達(dá)的細(xì)胞因子， 多數(shù)IL 家族因子關(guān)于抗瘤治療上凸顯關(guān)鍵[4]。 而經(jīng)基因工程改造的T 淋巴細(xì)胞，以IL-2 為節(jié)點。 近年來，因IL-15 對參與先天免疫和適應(yīng)性免疫的細(xì)胞具有廣泛的活性，被認(rèn)為是免疫基因治療的強(qiáng)有力的候選者[10]。 不僅與IL-2 的功能相似，且可抑制活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡 （activation-induced cell death，AICD），減少細(xì)胞凋亡并增加T 細(xì)胞持久性，且毒性較小[11]。

既往已證實， 成功制備14 d 左右的CIK 細(xì)胞抗瘤效果達(dá)到頂峰。 該實驗中， 筆者選用CIK 細(xì)胞和IL-15-CIK 細(xì)胞對CRC 細(xì)胞進(jìn)行殺傷活性檢測，結(jié)果顯示當(dāng)效靶比為10 ∶1，IL-15-CIK 細(xì)胞及CIK 細(xì)胞對CRC 細(xì)胞均具有殺傷能力， 表明IL-15-CIK 細(xì)胞及CIK 細(xì)胞對CRC 均有一定的抑制能力。 但隨著E ∶T 比值的逐漸升高，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞對CRC 的殺傷強(qiáng)度顯著強(qiáng)于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞， 同時也證明IL-15-CIK細(xì)胞擁有極為明顯的針對CRC 細(xì)胞株的殺傷特性。

該實驗同時表明，TNF-α 等多種細(xì)胞因子可被效應(yīng)細(xì)胞自分泌生成。并且當(dāng)IL-15-CIK 細(xì)胞及CIK細(xì)胞以E ∶T=25 ∶1 為限對HT-29 細(xì)胞進(jìn)行殺瘤實驗后， 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子IL-15、IFN-γ、TNF-α 較前均有所增加， 其中IL-15-CIK 細(xì)胞較CIK 細(xì)胞的細(xì)胞因子含量增加更明顯。 以上結(jié)果表示，當(dāng)CIK 細(xì)胞顯著增多后，不僅提升免疫屬性，更可分泌具備多種生物效能的細(xì)胞因子， 且IL-15-CIK 細(xì)胞較CIK 細(xì)胞在同等時間條件下的殺瘤作用更強(qiáng)。同時細(xì)胞因子參與抗瘤后各自發(fā)揮其功能。 而由CD4+、 CD8+生成的IFN-γ 可對同種生物進(jìn)行廣泛調(diào)節(jié)。它能使細(xì)胞建立抗病毒狀態(tài)的生物活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化和對免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用[12]。 作為細(xì)胞免疫的關(guān)鍵參與者，主要通過抑制腫瘤細(xì)胞的分裂、增殖，從而發(fā)揮抗瘤作用[13]。 多數(shù)通過調(diào)節(jié)引起相關(guān)細(xì)胞死亡的TNF-α[14]，主要源于巨噬細(xì)胞。 可直接作用于腫瘤細(xì)胞，阻抑腫瘤的形成[15]。

4 結(jié)論

綜上所述， 應(yīng)用轉(zhuǎn)基因CIK 細(xì)胞在體外展現(xiàn)了較好的腫瘤殺傷活性，然而其在動物體內(nèi)或是腫瘤患者體內(nèi)是否能夠真正發(fā)揮出良好的抗腫瘤特性，有待動物和臨床試驗的再論證。