攜單抗載增效劑超聲納米微泡制備實(shí)驗(yàn)的探索與研究

王婧茹，紅 華，張惠卿，王占忠，梁丹艷，劉 倩，孫 冉

超聲微泡造影劑已從微米級(jí)進(jìn)入納米級(jí)（直徑約40 ～350 nm）領(lǐng)域，具有穩(wěn)定性更高、血液循環(huán)時(shí)間更長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)。納米載體技術(shù)已可實(shí)現(xiàn)對(duì)特異性配體或抗體進(jìn)行修飾， 通過(guò)組織外滲透定向到達(dá)宿主目標(biāo)微環(huán)境，利用納米粒自身屬性攜帶藥物或基因并保持活性[1]，發(fā)揮分子探針的作用，與超聲造影技術(shù)結(jié)合后在精準(zhǔn)成像的同時(shí)實(shí)現(xiàn)靶向給藥治療[2]，為臨床的診療工作提供有效的醫(yī)學(xué)手段。屬于第一代光敏劑的血卟啉單甲醚 （hematoporphyrinmono-methyl ether，HMME）基于其光敏和聲敏的雙重特點(diǎn)[3，4]可作為一種增效劑被包裹在超聲造影劑殼膜內(nèi)，以期在增強(qiáng)超聲顯像和治療效果方面起到作用。 筆者擬從制備材料的選擇、納米微泡與抗體的連接方式、反應(yīng)條件及合成后的驗(yàn)證方式等幾方面探索研究，制備得到攜單抗載增效劑超聲納米微泡。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑

聚乳酸羥基乙酸[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]（聚合比50 ∶50）（美國(guó)Acros）；（+）-生物素-N-羥基琥珀酰亞胺酯 （N-hydroxysuccinimide，NHS）98 %（ALFA，美國(guó)）；帕博利珠（pembrolizumab）單抗（MCE 試劑公司，美國(guó)）；HMME （上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司， 中國(guó)）； 鏈霉親和素 （Streptavidin and Conjugates，SA）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中國(guó)）；全氟戊烷（perfluoropentane，PFP）（TCI 公司，日本）；鏈霉親和素-熒光素異硫氰酸酯偶聯(lián)物（Streptavidin fluorescein isothiocyanate conjugate，Streptavidin-FITC）（Sigma-Aldrich 公司，德國(guó)）；六氟化硫（博萊科公司，意大利）。

1.1.2 主要儀器

超聲細(xì)胞粉碎儀（蘇州納森超聲科技有限公司，中國(guó)）；恒溫孵育搖床（鄭州宏朗儀器設(shè)備有限公司，中國(guó)）；高速離心機(jī)（Eppendorf 公司，德國(guó)）；透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡（HITACHI，日本），動(dòng)態(tài)激光散射儀（PSS 粒度儀公司，美國(guó)）；紫外可見分光光度儀（Merinton，美國(guó)）；掃描隧道顯微鏡（Nanosurf，瑞士）；激光共聚焦顯微鏡（Zeiss，德國(guó)）；超聲診斷儀（飛利浦公司，荷蘭）；恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，中國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 攜單抗載增效劑超聲納米微泡的制備

1.2.1.1 載增效劑納米微泡的制備 將5 mL CHCl3加入50 mg PLGA 與4 mg HMME 的混合液中， 磁力攪拌至混勻溶解并置于冰水浴，后與16 mL 4% 聚乙稀醇（polyvinylalcohol，PVA）及400μLPFP 充分混合溶解，置于超聲細(xì)胞粉碎儀內(nèi)工作20 min（功率90 W，間隔5 s），再加入20 mL 2%異丙醇，磁力攪拌10 h，多次離心洗滌，得到載有HMME 超聲納米微泡。

1.2.1.2 鏈霉親和素修飾納米微泡 將2 mg SA 加入上述納米微泡， 先后經(jīng)過(guò)pH 6、pH 7.4 MES Buffer 及1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽[1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]、NHS 混合后冰水浴搖床孵育且多次離心（9 000 r/min，5 min）， 洗滌后得到的混合溶液中再次孵育離心洗滌，得到SA 化的載增效劑超聲納米微泡。

1.2.1.3 PD-1 單抗生物素化 將5 mg PD-1 單抗和5 mL pH 7.4 MES Buffer 的混合溶液與20 mg 生物素酯溶于1 mL 超純水的混合溶液中， 使PD-1 單抗與生物素酯的比例保持在1 mg ∶10 μL， 在PD-1 單抗溶液中加入生物素酯溶液后混合， 室溫?fù)u床孵育1.5 h，4 ℃條件下在pH 7.4 MES Buffer 中透析72 h 后去除游離生物素酯。

1.2.1.4 攜PD-1 單抗載增效劑超聲納米微泡的制備上述步驟所得溶液中加入2 mg FITC-SA， 常溫?fù)u床孵育2 h 后在pH 7.4 MES Buffer 中透析72 h，去除游離FITC-SA，與連接SA 之前制備所得納米微泡按比例相混合后再搖床孵育2 h， 多次離心洗滌， 制得攜PD-1 單抗載增效劑超聲納米微泡。

1.2.2 納米微泡的基本性質(zhì)檢測(cè)和實(shí)驗(yàn)表征分析

1.2.2.1 納米微泡物理性質(zhì)及其表征 采用掃描電子顯微鏡觀察納米微泡大小形態(tài)、表面結(jié)構(gòu)及分布特征，得到表面立體三維圖像。 透射電子顯微鏡觀察觀察納米微泡內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)， 獲得表面和內(nèi)部結(jié)構(gòu)信息。動(dòng)態(tài)激光散射儀分析其粒徑、穩(wěn)定性、聚合物分散指數(shù)，測(cè)定表面Zeta 電位。 紫外分光光度計(jì)測(cè)量計(jì)算HMME 的包封率。 超聲診斷儀灰階及造影模式下觀察納米微泡體外超聲顯像效果。

1.2.2.2 PD-1 單抗生物素化制備及結(jié)合驗(yàn)證 在激光共聚焦顯微鏡下驗(yàn)證PD-1 單抗生物素化及FITC-SA 與生物素化單抗結(jié)合，觀察并分析載增效劑及攜帶單抗納米微泡制備情況。

1.2.3 納米微泡相變及超聲顯像效果體外初步驗(yàn)證

稱取納米微泡、六氟化硫、超純水3 組液體各5 mL，在室溫下進(jìn)行超聲圖像對(duì)比觀察。 將裝有納米微泡溶液的乳膠手套分別放入29 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃幾組不同溫度狀態(tài)下的水浴鍋內(nèi)， 超聲診斷儀在灰階及造影模式下觀察幾組溶液的聲像圖變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布， 統(tǒng)計(jì)描述采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。 采用線性回歸方程對(duì)HMME 濃度與光密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行繪制。 決定系數(shù)R2用來(lái)描述方程擬合優(yōu)度， 回歸方程擬合實(shí)際情況的真實(shí)度與R2接近1 的程度呈正相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 納米微泡制備、物理性質(zhì)表征及結(jié)合驗(yàn)證

2.1.1 納米微泡制備結(jié)果

運(yùn)用乳化法成功制備出以PLGA 為載體、內(nèi)部加載HMME 及PFP，且用PD-1 單抗修飾其表面的攜單抗載增效劑超聲納米微泡。透射電子顯微鏡下表現(xiàn)為內(nèi)部黑色的類球形結(jié)構(gòu)， 表明PFP 及HMME 被包裹于納米微泡內(nèi)核中心而非殼層內(nèi)（圖1）。

圖1 透射電子顯微鏡下攜單抗前后納米微泡為內(nèi)部黑色的類球形結(jié)構(gòu)Fig.1 Images of spherical structures with black interior of nanobubbles before and after carrying monoclonal antibody under transmission electron microscope

2.1.2 穩(wěn)定性觀察

復(fù)溶后分散均勻，顏色隨稀釋濃度不同表現(xiàn)差異（圖2），短期內(nèi)4 ℃條件下可以穩(wěn)定保存。

圖2 不同稀釋倍數(shù)下的納米粒乳液外觀Fig.2 Image of appearance of nanobubbles emulsions at different dilution ratios

2.1.3 納米微泡載藥前后大小分布與Zeta 電位

掃描電子顯微鏡下納米微泡呈表面光整的類球形結(jié)構(gòu)，大小較勻稱（圖3），局部可見小范圍粘連聚集現(xiàn)象。 動(dòng)態(tài)激光散射儀測(cè)得納米微泡攜PD-1 單抗前后平均粒徑分別為（322.29±83.56）nm 和（330.17±75.28）nm。 表明PD-1 單抗對(duì)微球粒徑無(wú)明顯影響（圖4）， 靜置數(shù)天后復(fù)測(cè)粒徑分布未見明顯變化；納米微泡Zeta 電位是（- 2.41 ± 1.75） mV；聚合物分散指數(shù)約為0.287（圖5）。

圖4 動(dòng)態(tài)激光散射儀測(cè)得納米微泡攜單抗前（A）、后（B）粒徑分布圖Fig.4 Diagrams of particle size distribution of nanobubbles carrying monoclonal antibody before(A)and after(B)by dynamic laser scattering

圖5 動(dòng)態(tài)激光散射儀測(cè)得納米微泡Zeta 電位圖Fig. 5 Zeta potential diagram of nanobubbles by dynamic laser scattering

2.1.4 包封率與影響因素

HMME 投入較少時(shí)，部分微球內(nèi)核中空；投入較多時(shí)， 有部分游離狀態(tài)的HMME 存在， 當(dāng)其調(diào)節(jié)為PLGA 的0.04 倍時(shí)實(shí)驗(yàn)效果最佳。依據(jù)紫外分光光度計(jì)測(cè)量不同濃度HMME 與二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 配置溶液中最大吸收波長(zhǎng)處相對(duì)應(yīng)的光密度值繪制質(zhì)量濃度-光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線，由包封率計(jì)算公式（納米微球中HMME 的含量/放入HMME 總量）×100%得到納米微泡中HMME 的包封率為40.4%（圖6）。 納米微球在偏堿性環(huán)境中對(duì)HMME 包封狀態(tài)不佳，在酸性環(huán)境中與SA 結(jié)合效率較低，當(dāng)調(diào)節(jié)pH=7.4 時(shí)， 可較好包封HMME 的同時(shí)高效率結(jié)合SA。 相應(yīng)激發(fā)波長(zhǎng)下納米微泡在激光共聚焦顯微鏡下表現(xiàn)為紅色熒光（圖7A、B），SA 修飾后的生物素化單抗為綠色熒光（圖7C、D），兩色疊加融合間接表明二者結(jié)合成功，攜PD-1 單抗載增效劑納米粒呈黃色熒光（圖7E、F）。

圖6 紫外分光光度計(jì)測(cè)量后繪制HMME 濃度-光密度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.6 Standard curve of HMME concentration-optical density after measurement by ultraviolet spectrophotometer

圖7 攜單抗前后納米微泡激光共聚焦掃描圖Fig.7 Laser confocal scanning images of nanobubbles before and after carrying monoclonal antibody

2.2 納米微泡體外相變及聲像圖表現(xiàn)

2.2.1 納米微泡體外相變

實(shí)驗(yàn)制備納米微泡一定溫度下體外超聲顯像均勻度不及六氟化硫微泡，但回聲更強(qiáng)（圖8）。 超聲灰階模式中隨溫度升高的過(guò)程中納米微泡由少許點(diǎn)狀等回聲逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檩^多的氣泡樣強(qiáng)回聲，最后回聲再次降低；造影模式下有相同的聲像圖改變過(guò)程，由少量增強(qiáng)至范圍明顯擴(kuò)大，到最后減少消失。 整個(gè)變化過(guò)程中回聲由低到高、增強(qiáng)明顯由少到多的分界點(diǎn)在40 ℃左右（圖9）。

圖8 室溫恒溫狀態(tài)體外超聲灰階模式下納米微泡、六氟化硫微泡及超純水聲像圖對(duì)比Fig.8 Comparison of ultrasound images of nanobubbles，sulfur hexafluoride microbubbles and ultrapure water in vitro at room temperature by ultrasonic gray-scale mode

圖9 溫度升高過(guò)程中納米微泡聲像圖變化過(guò)程Fig.9 Ultrasonographic changes of nanobubbles during temperature rising

2.2.2 體外超聲顯像效果

納米微泡隨溫度升高發(fā)生相變形成直徑更大的微泡，增強(qiáng)了超聲顯像效果；溫度繼續(xù)升高達(dá)一定界值（50 ℃左右），微泡破裂融合后，超聲增強(qiáng)強(qiáng)度隨之下降。3 組液體中納米微球回聲更強(qiáng)但分散性欠佳的可能原因之一是因?yàn)閆eta 電位受pH 值影響，且電位絕對(duì)值的高低與納米微泡膠態(tài)分散的穩(wěn)定性呈正相關(guān)。 當(dāng)納米微泡整體帶有電荷量少，Zeta 電位絕對(duì)值越低時(shí)，納米微泡越傾向于凝結(jié)或凝聚[5]；其次HMME 的疏水性也可能導(dǎo)致團(tuán)聚的出現(xiàn)。 由此可見在納米微泡制備過(guò)程中關(guān)于材料的選擇和比例調(diào)控、溶液酸堿度的調(diào)試、反應(yīng)時(shí)間的控制等各個(gè)環(huán)節(jié)都至關(guān)重要。

3 討論

超聲納米微泡造影劑基于其粒徑小、穿透力強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，結(jié)合修飾靶向配體或抗體等載體技術(shù)，易通過(guò)組織間隙被動(dòng)富集于目標(biāo)靶區(qū)域，實(shí)現(xiàn)較好顯像效果同時(shí)攜帶藥物和基因達(dá)到載藥治療的目的。筆者通過(guò)利用生物素-親和素復(fù)合系統(tǒng)穩(wěn)固和反應(yīng)高度專一的特性，將PD-1 單抗與超聲納米微泡進(jìn)行連接，制備出攜單抗超聲納米微泡。

蛋白質(zhì)作為納米微泡外殼材料進(jìn)入體內(nèi)后可能會(huì)發(fā)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)，脂質(zhì)殼膜亦會(huì)存在體循環(huán)穩(wěn)定性差、半衰期短、載藥能力不足等問(wèn)題，筆者選高分子聚合物PLGA 作為微球殼膜，其成膜性、生物相容性好且無(wú)毒，以及可進(jìn)行生物降解等特點(diǎn)，使微泡能保持較好的穩(wěn)定性，同時(shí)在通過(guò)調(diào)節(jié)聚合物比例間接調(diào)整微泡降解速率方面占據(jù)一定優(yōu)勢(shì)?；谄浒踩咝У奶匦裕勺鳛樯锊牧显诔曉煊邦I(lǐng)域及臨床發(fā)揮作用。

筆者實(shí)驗(yàn)HMME 被包裹于PLGA 殼膜內(nèi)表現(xiàn)為透射電子顯微鏡下的黑色類球形結(jié)構(gòu)。 HMME 投入比例略低時(shí)，只被包載于部分PLGA 殼膜內(nèi)，還可見內(nèi)核中空的微球；HMME 投入比例較高時(shí)，無(wú)法全部被包裹入殼膜內(nèi)，激光共聚焦顯微鏡視野內(nèi)的紅色熒光可能有部分游離狀態(tài)的HMME 存在。 多次調(diào)試二者比例保持在1:25 左右時(shí)有較好的飽和狀態(tài)，測(cè)得HMME 的包封率約為40.4%。

筆者實(shí)驗(yàn)對(duì)納米微泡進(jìn)行SA 化修飾的過(guò)程選用碳二亞胺法，利用EDC/NHS 作為交聯(lián)劑可提高殼膜柔韌性[6]的特點(diǎn)，同時(shí)將二者作為PLGA 末端羧基的活化劑參與酰胺的合成過(guò)程，與SA 上的氨基共同結(jié)合后形成穩(wěn)定的酯鍵。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)當(dāng)納米微泡分散于MES Buffer pH 8 的偏堿性環(huán)境中，溶液的顏色狀態(tài)，以及激光共聚焦顯微鏡下的觀察和包封率檢測(cè)提示微泡中HMME 包封情況欠佳， 可能原因之一是含有PLGA末端羧基的殼膜在堿性環(huán)境中對(duì)HMME 的包封能力受到影響；當(dāng)MES Buffer 呈酸性時(shí)，SA 上氨基的部分結(jié)合位點(diǎn)會(huì)被占用，從而降低與微泡中PLGA 末端羧基的結(jié)合效率。 重新調(diào)試MES Buffer 的酸堿度發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH 值為7.4 時(shí)可以較好地平衡HMME 的包封狀態(tài)及SA 的結(jié)合效率。

抗體與納米微泡的連接常采用直接法和間接法，前者通過(guò)化學(xué)鍵橋接或電荷吸附，穩(wěn)定性欠佳；后者主要利用生物素-親和素復(fù)合系統(tǒng)。生物素上有與SA連接的結(jié)合位點(diǎn)咪唑酮環(huán)，SA 有4 個(gè)可與生物素分子結(jié)合的亞基色氨酸殘基， 二者依靠高于抗原抗體54 100 萬(wàn)倍的結(jié)合力以4 ∶1 的比例發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，親和力極強(qiáng)。 筆者實(shí)驗(yàn)被生物素化的PD-1 抗與SA化的PLGA 納米微泡基于此方式連接形成以不易受酸堿等理化因素干擾為優(yōu)勢(shì)的穩(wěn)固的PD-1 單抗-生物素-親和素系統(tǒng)[7]。

HMME 在激光共聚焦顯微鏡相應(yīng)激發(fā)波長(zhǎng)下顯現(xiàn)紅色熒光，被熒光素異硫氰酸酯FITC 標(biāo)記的鏈霉親和素（FITC-SA）呈現(xiàn)綠色熒光。 選用有不同截留相對(duì)分子質(zhì)量的半透膜透析袋過(guò)濾掉PD-1 單抗生物素化過(guò)程中多余未反應(yīng)的生物素酯，再加入FITC-SA參與反應(yīng)并過(guò)濾掉多余的FITC-SA，生物素與SA 的成功結(jié)合表現(xiàn)為激光共聚焦顯微鏡下的綠色單熒光，同時(shí)間接說(shuō)明PD-1 單抗已被生物素化。 SA 上的氨基與載HMME 納米粒中PLGA 的末端羧基結(jié)后合形成穩(wěn)定的酯鍵， 雙色疊加融合最終表現(xiàn)為黃色熒光，間接表明攜PD-1 單抗載HMME 納米粒成功制備。筆者研究中FITC-SA 可同時(shí)作為實(shí)驗(yàn)及驗(yàn)證材料參與制備和檢驗(yàn)過(guò)程，通過(guò)生物素親和素間穩(wěn)定專一的連接方式，在完成對(duì)PD-1 單抗生物素化初步驗(yàn)證的同時(shí)完成攜PD-1 單抗載增效劑納米微泡的制備過(guò)程。

液態(tài)氟碳作為超聲納米造影劑內(nèi)核時(shí)具有較好的穩(wěn)定性是基于其生物學(xué)惰性[2，8]，只有達(dá)到觸發(fā)條件時(shí)可進(jìn)行液氣相轉(zhuǎn)變，空化效應(yīng)產(chǎn)生的大量微氣泡增大與周圍組織的聲阻抗差，達(dá)到較好的顯像效果。 全氟己烷（perfluorohexane，PFH）屬于液態(tài)氟碳常見分類之一，由于其本身具有較高的沸點(diǎn)，達(dá)到微球相變所需更高溫度及能量時(shí)易造成周圍組織的損傷和凝固性732 壞死。而全氟戊烷（Perfluoropentane，PFP）沸點(diǎn)及相變溫度均較低， 筆者實(shí)驗(yàn)中40 ℃左右開始實(shí)現(xiàn)高效率顯像。

PFP 微球相變溫度高于其沸點(diǎn)受拉普拉斯壓力及液態(tài)氟碳微球外殼界面的表面張力等因素的影響；且由于泊松壓力的存在，相變觸發(fā)溫度的高低與微球直徑的大小呈反相關(guān)[9]，同時(shí)由于液體黏度的存在，相變發(fā)生需要滿足的前提條件之一是PFP 微球初始直徑達(dá)到某一界值[10]。筆者實(shí)驗(yàn)中PFP 微球在室溫條件下保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，當(dāng)達(dá)到閾值溫度發(fā)生相變后原尺寸會(huì)增大至5 ～6 倍[11]，微泡數(shù)量增加達(dá)峰值，超聲圖像上的灰度也到達(dá)峰值，一定范圍內(nèi)隨溫度升高進(jìn)行增大、聚集、融合、破裂的系列過(guò)程，隨后回聲強(qiáng)度逐漸減弱，造影模式有著同樣的變化趨勢(shì)，直至相變過(guò)程完成。 此外納米微泡的組成物質(zhì)及構(gòu)成比例[12～15]，以及超聲輻照裝置在聲致相變時(shí)關(guān)于系統(tǒng)、圖像及探頭等技術(shù)參數(shù)如超聲波頻率、聲強(qiáng)的選擇均可影響相變過(guò)程。

對(duì)HMME 進(jìn)行靶向修飾可使其在目標(biāo)微環(huán)境中保持較高濃度，被相應(yīng)光、聲源激發(fā)后，通過(guò)產(chǎn)生的光毒性或單線態(tài)氧等活性氧自由基帶來(lái)的細(xì)胞毒性[16]，在增強(qiáng)超聲顯像效果的同時(shí)起到靶向殺傷作用。由于HMME 本身疏水性而發(fā)生團(tuán)聚對(duì)超聲顯像效果的負(fù)面影響，還需進(jìn)一步探究調(diào)整納米微球各構(gòu)成成分與HMME 之間的混合比例及方式，在實(shí)現(xiàn)HMME 作為增效劑的優(yōu)勢(shì)被運(yùn)用的同時(shí)，改善不均勻增強(qiáng)的現(xiàn)象。

綜上所述，筆者通過(guò)實(shí)驗(yàn)初步對(duì)攜單抗載增效劑超聲納米微泡制備的實(shí)驗(yàn)條件及驗(yàn)證方式進(jìn)行了探索與研究，利用生物素-親和素復(fù)合系統(tǒng)高穩(wěn)定性的前提下可以保持所連接分子生物活性的優(yōu)勢(shì)，依靠單抗在體內(nèi)特異性結(jié)合相應(yīng)的靶點(diǎn)抗原，促使靶向性的超聲納米粒到達(dá)目標(biāo)微環(huán)境發(fā)揮作用，以期為靶向超聲造影劑的制備提供新思路，為后續(xù)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及治療研究做鋪墊。

（利益沖突聲明： 所有作者均聲明不存在利益沖突）