柱前衍生-高效液相色譜法測定構(gòu)樹飼料中氨基酸的含量

賴紅芳，潘立衛(wèi)，韋雪梅，覃國樂，黃秀香

（河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西宜州 546300）

構(gòu)樹（Broussonetia papyrifera）是一種?？坡淙~喬木，雌雄異株，又叫楮樹，含有豐富的蛋白質(zhì)和多種微量元素，是一種優(yōu)質(zhì)的畜禽飼料資源（龔利福等，2021 ；彭皓等，2019）。由于構(gòu)樹葉中的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，直接讓畜禽食用新鮮的構(gòu)樹葉，蛋白質(zhì)不易被畜禽吸收（陶興無，2005），因此，對構(gòu)樹葉進行發(fā)酵處理可以有效提高豬、雞等畜禽對構(gòu)樹飼料中蛋白質(zhì)的利用率和動物機體的免疫機能和抗病能力，且對肉蛋白質(zhì)有所改善（夏敏等，2020 ；蔡玉等，2019 ；邳植等，2018）。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的最基本物質(zhì)，因此，測定氨基酸的含量及構(gòu)成可以了解蛋白質(zhì)生物效價，也是評價動物飼料質(zhì)量的重要指標。檢測氨基酸的方法有分光光度計法（中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2019）、液相色譜- 質(zhì)譜串聯(lián)法（郭尚偉等，2016）、氣相色譜法（Roessner 等，2000），氨基酸自動分析法（張?zhí)K平等，2017）和高效液相色譜法（劉成模等，2022）。分光光度計法操作簡單，但檢測種類單一，且無法對氨基酸進行分離；氨基酸自動分析儀價格昂貴，檢測成本高，不適合廣泛運用（張椿翊等，2022）；高效液相色譜法檢測氨基酸操作簡單、樣品用量少、選擇性好、分離效率高（魏姜勉，2021），且采用柱前衍生具有靈敏度高，重現(xiàn)性好等優(yōu)點（歐陽道福，2018），因此，本研究采用酸水解法來提取發(fā)酵構(gòu)樹飼料中的氨基酸，并對水解條件進行優(yōu)化，建立一種鄰苯二甲醛（OPA）柱前衍生- 高效液相色譜檢測構(gòu)樹飼料中的氨基酸方法，為構(gòu)樹飼料中氨基酸含量的分析檢測提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 飼料：雜交構(gòu)樹飼料、野生構(gòu)樹飼料（發(fā)酵的時間為2021 年10 月29 日），由河池學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院覃國樂教授提供。

18 種氨基酸標準品：Solarbio，乙腈、甲醇（色譜純），鹽酸、氫氧化鈉磷酸氫二鈉、無水乙酸鈉、鄰苯二甲醛（OPA）、硼酸、苯酚、冰乙酸均為分析純。

1.1.2 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Agilent 8453 紫外可見分光光度計（美國安捷倫公司）；電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；FE 28 酸度計（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的水解 將構(gòu)樹飼料烘干、粉碎、過篩，除去油脂和色素，烘干、備用。按文獻（木合布力阿布力孜等，2011）對樣品進行水解后離心，吸取上清液1.0 mL 水浴蒸干，殘渣用2.0 mL 0.1 mol/L 的HCl 溶液溶解，過無機膜（0.45 μm）后保存，備用。

1.2.2 氨基酸的衍生方法 移取75 μL 的氨基酸水解液，依次加入300 μL（pH = 9.0）的緩沖鹽溶液、150 μL 的OPA 衍生劑溶液、75 μL 10%的冰乙酸溶液（調(diào)節(jié)pH值至中性）、900 μL純水，定容到1.5 mL，衍生5 min 后排氣泡，過有機膜（0.45 μm），待上機。

1.2.3 標準曲線的繪制 準確稱取天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸標準品各0.05 g 于小燒杯中，用0.1 mol/L 的HCl 溶液溶解并定容至50 mL 容量瓶中，搖勻，得到濃度為1.0 g/L 的氨基酸混合標準溶液。按文獻（淳澤利等，2019）操作，按1.2.2 的方法進行衍生，取1μL 衍生液在1.2.4 條件下測試。以峰面積為Y軸，氨基酸的質(zhì)量濃度為X軸，得出各氨基酸標準曲線方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.4 色譜分析條件 色譜柱：Advance Bio AAA 反相色譜柱（4.6×100 mm，2.7μL）；流動相A 為10 mmol Na2HPO4，pH=8.2（±0.2）；流動相B 為乙腈-甲醇-純水（體積比為45：45：10）；流速0.8 mL/min，柱溫40℃，進樣量：1μL，檢測波長為338 nm；流動相洗脫梯度如表1 所示。

表1 洗脫梯度程序

1.2.5 飼料中氨基酸水解條件的優(yōu)化 采取單因素試驗，以氨基酸峰面積的大小為主要參考對象，對氮氣（通入、不通入）、水解溫度（80、90、100、110、120 ℃）、水解時間（10、15、20、24、26 h）、水解液濃度（4、5、6、7、8 mol/L 的HCl 溶液）4 個因素進行試驗，研究不同條件對飼料中氨基酸水解的影響，篩選出符合飼料中氨基酸水解的最佳條件。

2 結(jié)果

2.1 飼料中氨基酸水解條件的優(yōu)化

2.1.1 氮氣對飼料中氨基酸水解的影響 由圖1可知，通入氮氣水解的效果比沒有通入氮氣水解好，因為氮氣是惰性氣體，水解時可以避免氨基酸在高溫時被氧化，起到保護作用。

圖1 通入氮氣對飼料中氨基酸吸收峰面積的影響

2.1.2 HCl 濃度對飼料中氨基酸水解的影響 由圖2 可知，隨著HCl 溶液濃度的增大，氨基酸的峰面積也隨之增加；當HCl 溶液濃度為6 mol/L，氨基酸的峰面積達到最大值，但當濃度繼續(xù)增大，氨基酸的峰面積均呈下降趨勢。因為HCl 濃度過低時，達不到蛋白質(zhì)水解的酸度要求，過高時，部分氨基酸會被破壞。

圖2 HCl 濃度對飼料中氨基酸的吸收峰面積的影響

2.1.3 水解溫度對飼料中氨基酸水解的影響 由圖3 可知，隨著水解溫度升高，各氨基酸的峰面積也逐漸升高，在110℃達到最大值，但溫度繼續(xù)升溫，氨基酸的峰面積呈下降趨勢。溫度過低時水解速率慢；溫度過高時氨基酸會發(fā)生脫氨和脫羧等反應(yīng)。

圖3 水解溫度對飼料氨基酸的吸收峰面積的影響

2.1.4 水解時間對飼料中氨基酸水解的影響 如圖4 所示，隨著水解時間的增加，氨基酸的峰面積呈上升趨勢，但水解了24 h 后氨基酸的峰面積開始降低，說明24 h 水解基本完成，再增加時間反而使氨基酸分解或被氧化。

圖4 水解時間對氨基酸峰面積的影響

結(jié)合單因素試驗結(jié)果可知，水解的最優(yōu)條件為：通入氮氣作保護氣，6 mol/L 的HCl 溶液作為水解液，水解時間為24 h，水解溫度為110℃。

2.2 系統(tǒng)適用性 取衍生化后的標準品液和樣品液1μL，按照“1.2.4”中的儀器方法進行測定。結(jié)果表明，衍生化后的18 種混合氨基酸標準品和樣品的色譜峰中除了甘氨酸和蘇氨酸不能分開外，其余的16 氨基酸峰形尖銳，分離度良好，如下圖所示?？捎糜陲暳现邪被岷康臏y定。

圖5-1 18 種氨基酸標準品色譜圖

圖5-2 野生構(gòu)樹飼料所含氨基酸的色譜圖

圖5-3 雜交構(gòu)樹飼料所含氨基酸的色譜圖

2.3 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限由表2 可知，按1.2.3 操作后，以氨基酸標準品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，相應(yīng)的峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程及氨基酸的檢出限。結(jié)果表明，16 種氨基酸的相關(guān)系數(shù)為0.9991 ～0.9999。

表2 試驗方法的線性范圍和檢出限

2.3 精密度試驗 移取氨基酸混合標準溶液75μL，按1.2.2 衍生方法進行衍生，按1.2.4 方法平行測定5 次，以這5 次測出來的峰面積來考察儀器的精密度，5 次測定結(jié)果的RSD 值為0.74% ～3.57%（n=5）。

2.4 重現(xiàn)性實驗 準確稱取3 份雜交構(gòu)樹飼料樣品，按照1.2.1 和1.2.2 的方法進行操作，再按1.2.4 方法測定，記錄16 種氨基酸的峰面積，結(jié)果顯示，16 種氨基酸峰面積對應(yīng)的相對標準偏差RSD 為0.44% ～3.76%。

2.5 構(gòu)樹飼料中氨基酸的含量測定與結(jié)果分析構(gòu)樹飼料按1.2.1 和1.2. 2 進行操作后（n=3），按1.2.4 方法測定，結(jié)果如表3 所示。由表3 可知，雜交構(gòu)樹飼料檢測出15 種氨基酸，含量最高的是谷氨酸。必需氨基酸有5 種，占總氨基酸的36.22%，含量從多到少的排序為亮氨酸＞苯丙氨酸＞纈氨酸＞賴氨酸＞異亮氨酸。野生構(gòu)樹飼料檢測出14 種氨基酸，含量最高的是谷氨酸。必需氨基酸有5 種，占總氨基酸的34.74%，含量從多到少的排序為亮氨酸＞纈氨酸＞賴氨酸＞苯丙氨酸＞異亮氨酸。

表3 樣品中氨基酸含量的測定結(jié)果

2.6 加標回收率實驗 準確稱取雜交構(gòu)樹飼料樣品3 份，加入同一水平的氨基酸混合標準液1 mL，按照1.2.1 和1.2.2 方法操作，再按1.2.4 方法測定，考察方法的回收率。得到平均回收率為90.5% ～107.8%。

3 討論

鄰苯二甲醛（OPA）作為衍生劑，氨基酸的衍生時間短，只需5 min，縮短了氨基酸的分析檢測時間（齊麟等，2022），而且氨基酸的分離效果較好，峰型好看、不拖尾，準確度和精密度較好，能滿足構(gòu)樹飼料的氨基酸含量測定需要。

由表3 可知，雜交構(gòu)樹飼料的總氨基酸比野生構(gòu)樹飼料的高，這可能是雜交構(gòu)樹通過雜交育種后，在人工種植過程比野生構(gòu)樹生長的環(huán)境好（曹力凡等，2021 ；郭琪等，2020）。雜交構(gòu)樹飼料的總氨基酸為8.53 g/100 g ；野生構(gòu)樹飼料的總氨基酸含量為7.11 g/100 g ；與玉米飼料的總氨基酸（8.1 g/100 g）相差不大（尤曉蒙，2015），可以考慮用構(gòu)樹飼料取代玉米，減少成本，緩解蛋白質(zhì)飼料不足的問題（陳景來，2022）。為養(yǎng)殖戶在選擇飼料上提供一定的參考價值，也為構(gòu)樹飼料的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

采用柱前衍生- 高效液相色譜法對構(gòu)樹飼料中的氨基酸進行測定，結(jié)果顯示，構(gòu)樹飼料中16種氨基酸的質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回收率為90.5% ～107.8%。構(gòu)樹飼料的氨基酸種類豐富，總氨基酸含量高，因此，氨基酸可作為評價構(gòu)樹飼料品質(zhì)的重要指標之一。