甘草預(yù)防氣管插管致呼吸道損傷的有效成分篩選

張杰，丁聲雙，郭敏，薛陽(yáng)，徐紫清，侯懷晶，薛建軍*

1.730050 甘肅省蘭州市，甘肅省中醫(yī)院麻醉科

2.730050 甘肅省蘭州市，甘肅省中西醫(yī)結(jié)合麻醉臨床研究中心

3.730000 甘肅省蘭州市，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院

4.730050 甘肅省蘭州市，甘肅省中醫(yī)院

氣管插管術(shù)是全身麻醉過(guò)程中最重要、最安全的呼吸支持方式。但由于其屬于侵入性操作，可引起多種并發(fā)癥。術(shù)后咽喉痛（POST）是全身麻醉后常見的輕微但令人不快的術(shù)后并發(fā)癥之一，發(fā)病率高達(dá)62%［1］。POST 會(huì)使患者術(shù)后的不適感增加、住院時(shí)間延長(zhǎng)，嚴(yán)重影響了患者滿意度和術(shù)后恢復(fù)質(zhì)量［2-3］。隨著全身麻醉氣管插管手術(shù)患者日趨增多和加速康復(fù)外科（ERAS）的快速發(fā)展，POST 的防治受到廣大麻醉醫(yī)師的關(guān)注。最近一項(xiàng)網(wǎng)狀Meta 分析［4］比較了6 種外用藥物預(yù)防氣管插管POST 的療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利多卡因并不是預(yù)防POST 的最佳外用藥物，建議根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)和患者的喜好選擇甘草甜素、皮質(zhì)類固醇、非甾體抗炎藥或N-甲基-D-門冬氨酸（NMDA）受體拮抗劑用于減輕POST。目前，針對(duì)POST 的干預(yù)措施多以術(shù)前預(yù)防為主，具有一定的緩解作用，但POST發(fā)生率仍然較高［5］。因此，尋找具有療效確切且不良反應(yīng)小的臨床干預(yù)方法已成為研究熱點(diǎn)。

甘草來(lái)源于豆科植物甘草、脹果甘草或光果甘草的干燥根和根莖［6］，主要包括三萜皂苷類化合物、黃酮類化合物和多糖類化合物等［7］，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等多種功效［8］，是臨床常用中藥之一。本課題組前期研究［9］發(fā)現(xiàn)甘草噴劑能明顯減輕大鼠氣管黏膜水腫滲出和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，降低大鼠氣管插管后血清促炎因子腫瘤壞死因子（TNF）-α、白介素（IL）-1 的表達(dá)水平。此外，通過(guò)臨床研究發(fā)現(xiàn)甘草噴霧劑可減輕全身麻醉氣管插管應(yīng)激反應(yīng)和POST 的發(fā)生率［10］，同時(shí)基于循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)顯示甘草制劑局部應(yīng)用能有效預(yù)防氣管插管后的咽喉痛［11］，但目前尚無(wú)針對(duì)甘草具體有效成分防治插管后氣道損傷或POST 的研究。因此，本研究通過(guò)建立全身麻醉氣管插管大鼠模型，篩選甘草預(yù)防氣管插管致呼吸道損傷的有效成分，從中醫(yī)藥角度為防治全身麻醉氣管插管致呼吸道損傷提供新思路。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)Wistar 大鼠60 只，6～8 周齡，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)62001000000591）。所有動(dòng)物操作獲得甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查（倫理審批編號(hào)：2020-233），并根據(jù)國(guó)際疼痛研究協(xié)會(huì)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

DH-140 型小動(dòng)物呼吸機(jī)（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），高速冷凍離心機(jī)（5424R，德國(guó)Eppendorf），病理切片機(jī)（RM2016，德國(guó)徠卡），組織攤片機(jī)（KD-P，鄭州博邦儀器有限公司），顯微拍照系統(tǒng)（ICX41，寧波舜宇光學(xué)科技有限公司），酶標(biāo)儀（ELX800，美國(guó)Bio Rad 公司）。

異氟醚購(gòu)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司，丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購(gòu)于南京建成科技有限公司，TNF-α、IL-2、IL-4、IL-10、皮質(zhì)醇（Cor）、腎上腺素（E）和去甲腎上腺素（NE）試劑盒購(gòu)于江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 甘草提取物的制備

甘草購(gòu)于甘肅數(shù)字本草檢驗(yàn)中心有限公司，并經(jīng)該公司鑒定為甘草根和莖。將甘草飲片粉碎，過(guò)60 目篩；稱取甘草粉末三份，每份約10.0 g，加水200 mL，超聲提取1 h，離心（3 000 r/min，5 min），取上清液，醇沉（80%乙醇、9 h），離心，取上清液，水浴濃縮至約50 mL，得總多糖（TP）；加75%乙醇200 mL，超聲提取1 h，過(guò)濾，濾液用AB-8 大孔吸附樹脂純化，80%乙醇洗脫，洗脫液濃縮至約50 mL，得總黃酮；加75%乙醇200 mL，回流提取90 min，過(guò)濾，濾液用HPD-300 大孔吸附樹脂純化，50%乙醇洗脫，洗脫液濃縮至約50 mL，得總皂苷。

1.4 研究方法

1.4.1 動(dòng)物分組及處理：本研究于2021年4月—2022年7月進(jìn)行。將60 只SPF 級(jí)Wistar 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為6 組：對(duì)照組、氣管插管組、利多卡因組、總多糖組、總皂苷組、總黃酮組，每組10 只。除對(duì)照組外，其余五組采用1%戊巴比妥鈉麻醉，制備氣管插管模型。插管前各治療組按1 mL/100 g（按體質(zhì)量計(jì)）分別經(jīng)口噴入1%利多卡因、總多糖、總皂苷、總黃酮，浸潤(rùn)軟腭及懸雍垂周圍組織。對(duì)照組和氣管插管組經(jīng)口噴入等體積0.9%氯化鈉溶液。

1.4.2 參照文獻(xiàn)［8］制備氣管插管大鼠模型。模型制備：將大鼠用1%戊巴比妥鈉溶液（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后，3～5 min 后大鼠意識(shí)消失，全身肌肉松弛。將麻醉后的大鼠仰臥固定于手術(shù)板上，把固定的大鼠同手術(shù)臺(tái)一起傾斜約45°（大鼠頭朝上），用手術(shù)鉗將大鼠舌頭小心拉出口腔，左手持大鼠喉鏡，右手持自制氣管導(dǎo)管（16G 血管穿刺針），趁大鼠吸氣時(shí)聲門打開瞬間將自制氣管導(dǎo)管插入氣道，用棉簽確認(rèn)氣管導(dǎo)管的位置，然后連接呼吸機(jī)。參數(shù)設(shè)置：頻率80 次/min，潮氣量5～10 mL，吸呼比為1∶1.5。麻醉維持：持續(xù)吸入1.3%異氟醚，機(jī)械通氣期間觀察大鼠狀態(tài)，包括大鼠胸廓起伏頻率與程度、口唇黏膜是否紅潤(rùn)、有無(wú)異動(dòng)等，若發(fā)現(xiàn)異常，及時(shí)檢查呼吸回路。麻醉蘇醒：機(jī)械通氣2 h后停止異氟醚吸入，待大鼠完全清醒后拔除氣管導(dǎo)管，將其放回鼠籠待解剖。

1.4.3 蘇木精-伊紅（HE）染色：氣管導(dǎo)管拔除2 h 后，在1%戊巴比妥鈉深麻醉（80 mg/kg）狀態(tài)下，采集大鼠咽部黏膜組織，用4%多聚甲醛固定，觀察病理。將標(biāo)本脫水，石蠟包埋，制作5 μm 厚切片，用HE 染色，并采用寧波舜宇I(lǐng)CX41 顯微鏡拍照系統(tǒng)進(jìn)行觀察、拍照。

1.4.4 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測(cè)定：拔除氣管導(dǎo)管2 h后，在1%戊巴比妥鈉深麻醉（80 mg/kg）狀態(tài)下，從腹主動(dòng)脈采集血液樣本，在3 500 r/min 條件下離心10 min，收集血清并保存在-80 ℃冰箱備用。按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)炎性因子（TNF-α、IL-2、IL-4、IL-10）、氧化應(yīng)激指標(biāo)（MDA、T-AOC、SOD）及應(yīng)激激素（Cor、E、NE）水平。

1.4.5 免疫組化檢測(cè)Toll 樣受體2（TLR2）和Toll 樣受體4（TLR4）表達(dá)水平：將制備好的咽部黏膜組織石蠟切片用二甲苯脫蠟，然后依次加入高至低濃度乙醇使組織再水化，加入抗原修復(fù)液，然后用3% H2O2消除過(guò)氧化物酶，然后用牛血清密封。經(jīng)一抗和二抗孵育后，進(jìn)行脫蠟洗滌，抗原修復(fù)，加入DAB 顯色，脫水密封后使用顯微拍照系統(tǒng)觀察和拍照。通過(guò)Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算各視野TLR2 和TLR4 平均光密度值（AOD），以AOD=IOD/Area（即intDen/Area）表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 22.0 軟件（IBM 公司，阿蒙克市，美國(guó)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用GraphPad Prism 9.0 軟件作圖。計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示。當(dāng)方差齊檢驗(yàn)沒有呈現(xiàn)出顯著性（α=0.05）時(shí)，采用單因素方差分析和Tukey 事后檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估多重比較。反之，采用Dunnett's T3 進(jìn)行組間分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甘草不同成分對(duì)大鼠咽部黏膜組織病理變化的影響

對(duì)照組黏膜層和黏膜下層結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。氣管插管組可見黏膜脫落，黏膜下結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與氣管插管組相比，利多卡因組黏膜層及黏膜下層結(jié)構(gòu)破壞較輕，可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；總多糖組和總黃酮組黏膜及黏膜下層結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)減少；總皂苷組黏膜及黏膜下層結(jié)構(gòu)基本完整，細(xì)胞形態(tài)接近正常，可見散在的炎性細(xì)胞，見圖1。

圖1 6 組大鼠咽部黏膜病理變化（HE 染色，×200）Figure 1 Pathological changes of pharyngeal mucosa among 6 groups

2.2 甘草不同成分對(duì)大鼠血清炎性因子的影響

6 組大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-2、IL-4、IL-10 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，氣管插管組大鼠血清中的TNF-α、IL-2 水平升高，IL-4、IL-10 水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與氣管插管組相比，總多糖組IL-4 水平升高，總皂苷組大鼠血清TNF-α 和IL-2 水平下降，IL-4 和IL-10 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；利多卡因組和總黃酮組大鼠血清TNF-α 水平低于氣管插管組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 6 組大鼠血清炎性因子的比較（±s）Table 1 Comparison of serum inflammatory factors among 6 groups

表1 6 組大鼠血清炎性因子的比較（±s）Table 1 Comparison of serum inflammatory factors among 6 groups

注：TNF-α=腫瘤壞死因子α，IL=白介素；a 表示與對(duì)照組比較P＜0.05，b 表示與氣管插管組比較P＜0.05。

IL-10（ng/L）對(duì)照組100.35±0.061.11±0.10111.40±10.09 115.72±7.83氣管插管組100.81±0.09a1.72±0.15a66.75±11.43a 67.93±8.76a利多卡因組100.69±0.08b1.60±0.0981.76±16.39 80.35±11.93總多糖組100.72±0.091.62±0.0885.82±12.00b 78.77±13.35總皂苷組100.50±0.05b1.43±0.10b98.09±18.49b 94.71±9.74b總黃酮組100.69±0.11b1.64±0.0982.72±15.4581.51±9.01 F 值42.9344.2011.4727.74 P 值＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05組別只數(shù)TNF-α（μg/L）IL-2（μg/L）IL-4（ng/L）

2.3 甘草不同成分對(duì)氧化應(yīng)激的影響

6 組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、SOD、T-AOC水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，氣管插管組大鼠血清中的MDA水平升高，SOD和T-AOC水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。利多卡因組和總多糖組大鼠血清MDA、SOD、T-AOC 水平與氣管插管組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與氣管插管組相比，總皂苷組和總黃酮組大鼠血清MDA 水平下降，SOD 和T-AOC 水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 6 組大鼠血清氧化應(yīng)激水平的比較（±s）Table 2 Comparison of serum oxidative stress level among 6 groups

表2 6 組大鼠血清氧化應(yīng)激水平的比較（±s）Table 2 Comparison of serum oxidative stress level among 6 groups

注：MDA=丙二醛，T-AOC=總抗氧化能力，SOD=超氧化物歧化酶；a 表示與對(duì)照組比較P＜0.05，b 表示與氣管插管組比較P＜0.05。

SOD（U/mL）對(duì)照組101.90±0.1917.22±1.547.10±0.88氣管插管組102.94±0.23a9.68±1.14a4.38±0.73a利多卡因組102.75±0.1911.21±1.935.24±0.74總多糖組102.68±0.1810.96±1.994.75±0.76總皂苷組102.21±0.23b15.50±1.56b6.03±0.95b總黃酮組102.62±0.18b12.34±1.56b5.45±0.65b F 值37.5731.5015.15 P 值＜0.05＜0.05＜0.05組別只數(shù)MDA（nmoL/L）T-AOC（U/mL）

2.4 甘草不同成分對(duì)應(yīng)激激素水平的影響

6 組大鼠血清應(yīng)激激素Cor、E、NE 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。氣管插管組大鼠血清Cor、E 和NE 水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。利多卡因組和總皂苷組大鼠血清中Cor、E 和NE 水平低于氣管插管組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？偠嗵墙M和總黃酮組大鼠血清Cor、E 和NE 水平與氣管插管組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 6 組大鼠血清應(yīng)激激素水平的比較（±s）Table 3 Comparison of serum stress hormone level among 6 groups

表3 6 組大鼠血清應(yīng)激激素水平的比較（±s）Table 3 Comparison of serum stress hormone level among 6 groups

注：Cor=皮質(zhì)醇，NE=去甲腎上腺素，E=腎上腺素；a 表示與對(duì)照組比較P＜0.05，b 表示與氣管插管組比較P＜0.05。

組別只數(shù) Cor（μg/mL）NE（ng/L）E（pg/mL）對(duì)照組10100.28±7.80 140.66±13.01 135.97±11.52氣管插管組 10 157.40±11.11a 206.16±18.84 a 201.53±10.40 a利多卡因組 10141.11±8.04b 187.01±13.36b 187.93±11.98b總多糖組10 145.33±17.77 192.14±8.97 192.98±9.19總皂苷組10 130.15±10.06b 164.54±14.09b 162.10±5.92b總黃酮組10143.70±8.67 192.48±16.28 190.42±6.77 F 值31.4227.1615.15 P 值＜0.05＜0.05＜0.05

2.5 甘草不同成分對(duì)TLR2 和TLR4 表達(dá)的影響

6 組大鼠咽部黏膜組織TLR2、TLR4 蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。氣管插管組TLR2 和TLR4 表達(dá)的AOD 高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。利多卡因組、總多糖組、總皂苷組和總黃酮組大鼠咽部組織TLR2 表達(dá)的AOD 與氣管插管組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?？傇碥战M大鼠咽部組織TLR4 表達(dá)的AOD 明顯低于氣管插管組（P＜0.05），而利多卡因組、總多糖組和總黃酮組大鼠咽部組織TLR4 表達(dá)的AOD 與氣管插管組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2、表4。

圖2 6 組大鼠咽部組織TLR2 和TLR4 表達(dá)免疫組化染色圖（×200）Figure 2 Immunohistochemical staining of TLR2 and TLR4 expression in pharyngeal tissues among 6 groups

表4 6 組大鼠咽部組織TLR2、TLR4 蛋白表達(dá)AOD 比較（±s）Table 4 Comparison of AOD expressed by TLR2 and TLR4 protein in the pharyngeal tissues among 6 groups

表4 6 組大鼠咽部組織TLR2、TLR4 蛋白表達(dá)AOD 比較（±s）Table 4 Comparison of AOD expressed by TLR2 and TLR4 protein in the pharyngeal tissues among 6 groups

注：TLR2=Toll 樣受體2，TLR4=Toll 樣受體4；a 表示與對(duì)照組比較P＜0.05，b 表示與氣管插管組比較P＜0.05。

組別只數(shù)TLR2TLR4對(duì)照組60.048±0.005 0.049±0.010氣管插管組60.093±0.017a 0.081±0.009a利多卡因組60.084±0.012 0.075±0.004總多糖組60.090±0.013 0.074±0.007總皂苷組60.084±0.010 0.056±0.006b總黃酮組60.086±0.010 0.071±0.011 F 值11.4913.95 P 值＜0.05＜0.05

3 討論

在接受全身麻醉的患者中，氣管內(nèi)插管對(duì)于保持氣道通暢至關(guān)重要，在臨床上應(yīng)用廣泛，其侵入性操作帶來(lái)的機(jī)械刺激易引起咽喉部黏膜屏障破壞，誘發(fā)機(jī)體出現(xiàn)炎性反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)等，從而引起咽喉部疼痛及咳嗽等呼吸道并發(fā)癥。雖然可以通過(guò)選擇直徑較小的氣管導(dǎo)管，使用適當(dāng)?shù)臍夤軐?dǎo)管套囊壓力［12］，靜脈注射或局部應(yīng)用利多卡因［13］，包括利多卡因堿化氣管導(dǎo)管套囊，以及類固醇等抗炎藥［4］降低POST 的發(fā)生率，但上述措施均不令人滿意。此外，喉鏡的放置通常伴有嚴(yán)重的交感神經(jīng)刺激，這對(duì)心血管疾病患者極為危險(xiǎn)。目前已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多技術(shù)來(lái)減少圍術(shù)期應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生的可能性，例如對(duì)喉黏膜進(jìn)行局部麻醉、靜脈給予局部麻醉藥、短效阿片類藥物或β 腎上腺素能拮抗劑［14］。然而，這些方法無(wú)法有效抑制應(yīng)激反應(yīng)。近年來(lái)，中醫(yī)藥技術(shù)廣泛應(yīng)用于氣管插管呼吸道并發(fā)癥的防治。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，甘草具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用［15-18］，廣泛應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)疾病。

以往研究表明，氣管導(dǎo)管與人或豬的氣管黏膜接觸導(dǎo)致機(jī)械性損傷，表現(xiàn)為咽喉痛（人）、氣管炎、中性粒細(xì)胞活化［19-21］，同時(shí)彈性蛋白酶、活性氧（ROS）、IL-1β、TNF-α 和細(xì)胞間黏附分子1 表達(dá)增加［21］。甘草的抗炎活性及其在炎癥性疾病中的應(yīng)用自古以來(lái)就有記載［22］。有學(xué)者認(rèn)為甘草的抗炎作用主要由皂苷類和黃酮類化合物介導(dǎo)［23］，甘草中的三萜皂苷類化合物是其具有特異性標(biāo)志的成分，其中甘草酸和甘草次酸是甘草根的主要成分［23］，二者在藥理學(xué)上表現(xiàn)出相似的特征。KAGEYAMA 等［24］認(rèn)為甘草酸的抗炎作用與糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素相似。黃酮類化合物是甘草中僅次于三萜皂苷類的第二大化合物。甘草類黃酮顯示出良好的抗炎作用，在肺炎、肝炎、潰瘍性結(jié)腸炎、胃炎和其他炎癥性疾病中顯示出治療效果［25］。本研究發(fā)現(xiàn)氣管插管組大鼠咽部黏膜脫落，黏膜下層結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重并伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血清中促炎因子TNF-α 和IL-2 水平顯著升高，抗炎因子IL-4 和IL-10 水平降低。總皂苷組大鼠咽部黏膜及黏膜下層結(jié)構(gòu)破壞減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。大鼠血清中促炎因子TNF-α 和IL-2水平下降，抗炎因子IL-4 和IL-10 水平升高。這些結(jié)果提示總皂苷對(duì)氣管插管引起的氣道損傷和炎性反應(yīng)有一定的抑制作用，這一結(jié)果與梁曦等［9］研究結(jié)果一致。

甘草的抗氧化活性是其廣泛使用的主要原因之一。三萜皂苷類化合物甘草酸的抗輻射、神經(jīng)保護(hù)、抑制線粒體通透性變化、防止缺血再灌注損傷及緩解肝損傷等多種活性與其清除自由基、對(duì)抗氧化應(yīng)激的作用密切相關(guān)［23］。有學(xué)者將甘草的抗氧化活性歸因于黃酮類化合物［26］。MDA 是一種能間接反映機(jī)體ROS 代謝狀態(tài)和對(duì)組織的氧化損傷程度的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的中間產(chǎn)物［27］，也是機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激的重要標(biāo)志；SOD 作為抗氧化劑，能減少ROS 在體內(nèi)的積聚，減少M(fèi)DA 的產(chǎn)生［28］，從而減輕氧化應(yīng)激損傷；T-AOC 可反映機(jī)體內(nèi)總體的抗氧化水平［29］。本研究發(fā)現(xiàn)：氣管插管組大鼠血清中MDA 水平明顯增加，SOD 和T-AOC 水平明顯下降。給予甘草提取物預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)總皂苷組和總黃酮組MDA 水平降低，SOD 和T-AOC 水平升高，表明總皂苷和總黃酮對(duì)氣管插管引起的氧化應(yīng)激損傷均有一定的抑制作用，這一研究結(jié)果與王軍等［30］研究一致。

氣管插管等應(yīng)激反應(yīng)促使交感-腎上腺髓質(zhì)和下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸興奮為主的一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，促使機(jī)體兒茶酚胺和糖皮質(zhì)激素分泌增加［31］。因此，血漿中Cor、E 和NE 濃度能夠評(píng)估應(yīng)激反應(yīng)的程度。楊開銀等［10］通過(guò)臨床研究發(fā)現(xiàn)甘草噴霧劑能降低氣管拔管后24 h 內(nèi)血清E 和NE 水平。本研究發(fā)現(xiàn)利多卡因組和總皂苷組大鼠血清中Cor、E 和NE 水平較氣管插管組顯著降低，表明甘草抑制氣管插管時(shí)的應(yīng)激反應(yīng)可能與總皂苷相關(guān)。

TLR 是參與非特異性反應(yīng)的蛋白分子［32］，TLR 有多重亞型，其中TLR4 被認(rèn)為是無(wú)菌炎癥的主要介質(zhì)［33］，促進(jìn)炎性因子的合成和釋放是其主要的生物學(xué)功能。有研究表明，促炎介質(zhì)HMGB1 在細(xì)胞外與TLR 結(jié)合，進(jìn)而激活核因子（NF）-κB 通路，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，加劇炎性因子釋放［34］，從而介導(dǎo)組織傷過(guò)程。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氣管插管組TLR2 和TLR4 表達(dá)的AOD 高于對(duì)照組，表明氣管插管誘導(dǎo)的氣道損傷可以激活TLR2和TLR4 蛋白表達(dá)?？傇碥战M大鼠咽部組織TLR4 表達(dá)的AOD 明顯低于氣管插管組，提示TLR4 在甘草預(yù)防全身麻醉氣管插管所致的呼吸道損傷中發(fā)揮重要作用。

綜上，本研究通過(guò)觀察甘草不同成分對(duì)大鼠氣管插管模型咽部組織病理形態(tài)學(xué)、炎性因子、氧化應(yīng)激、應(yīng)激激素和TLR 等相關(guān)指標(biāo)的影響，分別考察甘草不同成分對(duì)氣管插管引起的氣道損傷的作用。結(jié)果表明總皂苷成分可通過(guò)減輕炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激和抑制TLR4 表達(dá)改善氣管插管大鼠呼吸道損傷，故初步確定甘草預(yù)防全身麻醉氣管插管呼吸道損傷的有效成分為總皂苷。

作者貢獻(xiàn)：張杰和薛建軍構(gòu)思并設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)，指導(dǎo)研究實(shí)施與修改稿件；張杰、丁聲雙、郭敏、薛陽(yáng)負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)實(shí)施和血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)；張杰和郭敏撰寫論文初稿。丁聲雙和徐紫清進(jìn)行HE 染色和免疫組化；丁聲雙和侯懷晶統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)；所有作者審閱并批準(zhǔn)了最終稿件。

本文無(wú)利益沖突。