電針對術(shù)后認知功能障礙模型大鼠炎癥反應(yīng)和鐵死亡影響的研究

秦曉宇，張斌森，張笑佳，逯曉婷，劉鴻鑫，王春愛

1.730030 甘肅省蘭州市，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院

2.200120 上海市，同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院麻醉科

3.730030 甘肅省蘭州市，甘肅省中醫(yī)方藥挖掘與創(chuàng)新轉(zhuǎn)化重點實驗室

4.730030 甘肅省蘭州市，甘肅省中藥新產(chǎn)品創(chuàng)制工程實驗室

5.730030 甘肅省蘭州市，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院

6.730050 甘肅省蘭州市，甘肅省中醫(yī)院麻醉疼痛醫(yī)學(xué)中心

7.730050 甘肅省蘭州市，甘肅省中西醫(yī)結(jié)合麻醉臨床醫(yī)學(xué)研究中心

術(shù)后認知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是一種術(shù)后常見的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。數(shù)據(jù)顯示，60 歲以上非心臟手術(shù)患者POCD 發(fā)生率高達56%，且隨年齡的增長逐漸增高［1-2］。POCD 嚴重影響了患者的術(shù)后康復(fù)和生活質(zhì)量，增加了患者的經(jīng)濟負擔(dān)以及疾病的發(fā)病率和死亡率［3］。目前，國際和國內(nèi)多學(xué)科專家共識指出，降低POCD 發(fā)生的主要措施仍以圍手術(shù)期預(yù)防為主［4-5］。POCD 藥物治療本身存在不良反應(yīng)，和麻醉藥物作用還可能增加手術(shù)風(fēng)險。研究表明，電針對POCD 患者認知功能改善療效確切，且不良反應(yīng)更少，成本更低［6］，然而具體機制尚不明確。鐵死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的鐵依賴性程序性細胞死亡方式，參與誘導(dǎo)POCD 神經(jīng)損傷并誘發(fā)炎癥反應(yīng)［7］。炎癥是導(dǎo)致POCD 的重要病理因素，麻醉/手術(shù)后促炎和抗炎細胞因子大量表達，進一步加重神經(jīng)元細胞死亡［8］。而能否通過電針抑制鐵死亡途徑及其調(diào)控促炎和抗炎細胞因子間的失衡進而減輕POCD 鮮有報道。因此，本研究以老年P(guān)OCD 大鼠模型為研究對象，觀察電針百會、內(nèi)關(guān)穴對術(shù)后學(xué)習(xí)記憶功能、促炎和抗炎細胞因子以及鐵死亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 本研究時間為2022年1月—2023年2月。取18～20月齡SPF 級健康雌性SD 大鼠72 只，體質(zhì)量350～450 g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（甘）2020-0001。飼養(yǎng)期間大鼠自由攝食水，室內(nèi)溫度22～24 ℃，相對濕度40%～70%，12 h光/暗環(huán)境循環(huán)。本研究通過甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準（2021-200）。

1.1.2 主要實驗儀器和耗材：針灸針（北京科苑達醫(yī)療器械有限公司，規(guī)格：0.25 mm×25 mm），電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），醫(yī)用縫合針（杭州華威醫(yī)療用品有限公司），Morris 水迷宮系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司），離心機（德國Eppendorf 公司），酶標(biāo)儀（美國Molecular 公司），搖床（美國SCILOGEX 公司），轉(zhuǎn)印槽（美國Bio-Rad 公司），透射電子顯微鏡（日本日立公司）。

1.1.3 主要藥品和試劑：丙泊酚（江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，貨號：國藥準字H20123138），大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白介素（interleukin，IL）6、IL-10 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），鐵含量檢測試劑盒（美國Abcam 公司，貨號：ab83366），脂質(zhì)過氧化物（lipid peroxidation，LPO）試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，貨號：A106-1-2），酰基輔酶A 合成酶長鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4）、鐵蛋白重鏈1（ferritin heavy chain 1，F(xiàn)TH1）、GAPDH 抗體（美國Immunoway公司，貨號分別為：YT8070、ab75972、YM3029），溶血磷脂酰膽堿?；D(zhuǎn)移酶3（lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3）抗體（美國Abcam 公司，貨號：ab232958）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按照隨機數(shù)字表法分為3 組：對照組（n=24）、模型組（n=24）和電針組（n=24）。術(shù)后觀察大鼠并進行行為學(xué)檢測，根據(jù)術(shù)后3、7 d 兩個觀察時間點將每組大鼠分為2 個亞組（對照組術(shù)后3 d 亞組、對照組術(shù)后7 d 亞組，模型組術(shù)后3 d 亞組、模型組術(shù)后7 d 亞組，電針組術(shù)后3 d亞組、電針組術(shù)后7 d 亞組），每組12 只。

1.2.2 POCD 大鼠模型建立：參考文獻［9-10］的方法，采用剖腹探查手術(shù)建立POCD 模型。對照組捆綁固定和腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，其余組大鼠腹腔注射150 mg/kg 丙泊酚麻醉。待大鼠翻正反射消失、夾尾實驗無反應(yīng)后，剔除腹部毛發(fā)，對擬進行手術(shù)部位碘伏消毒。用手術(shù)刀沿大鼠劍突下方約1 cm 處的腹部正中白線做約3 cm 切口，然后剪開大鼠腹肌和腹膜，暴露腹腔內(nèi)臟。隨后按照肝臟、脾臟、胃、腸道、腎臟順序依次探查。每次探查時間為3 min，共探查3 次，間隔時間為7 min。在每次探查間隔時間內(nèi)，從腹腔內(nèi)取出約10 cm 的小腸，用0.9%氯化鈉溶液預(yù)浸泡的紗布覆蓋，用手指輕微搓揉腸管約3 min，然后將其送回腹腔。整個手術(shù)探查時間約為30 min。探查結(jié)束后，用4-0 手術(shù)縫線逐層縫合肌肉和皮膚，并用無菌輔料覆蓋腹部。Morris 水迷宮行為學(xué)檢測結(jié)果與對照組比較差異顯著，即為建模成功。

1.2.3 給電針組大鼠穿上自制鼠衣，然后繃帶捆綁固定。選取大鼠百會和雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴，取穴位置參照《實驗動物常用穴位名稱與定位 第2 部分：大鼠》［11］。一次性無菌針灸針在百會穴位置向后斜刺2 mm，內(nèi)關(guān)穴位置直刺1 mm。在疏密波，20/100 Hz 頻率，1 mA 電流強度條件下刺激20～30 min。于造模前2 d 開始干預(yù)，1 次/d，連續(xù)5 d。對照組和模型組大鼠在電針組大鼠刺激期間做同樣捆綁固定。

1.2.4 實驗過程中4 只大鼠被排除，包括對照組術(shù)后3 d亞組1 只大鼠認知功能訓(xùn)練過程中發(fā)現(xiàn)視物不清，模型組術(shù)后7 d 亞組、電針組術(shù)后3 d 亞組、電針組術(shù)后7 d亞組各1只大鼠造模后次日死亡。最終共納入68只大鼠。

1.2.5 Morris 水迷宮裝置檢測大鼠行為學(xué)表現(xiàn)：術(shù)前通過定位航行實驗對大鼠進行認知功能訓(xùn)練，將大鼠頭朝池壁放入水中，記錄大鼠逃避潛伏期。若在120 s 內(nèi)找到平臺，則平臺上停留10 s；若在120 s 內(nèi)未找到平臺（潛伏期記為120 s），則引導(dǎo)至平臺上并停留15 s。訓(xùn)練共歷時5 d，每天定于固定時間段訓(xùn)練4 次（即分別將大鼠從不同象限放入水中），大鼠每兩次訓(xùn)練時間間隔為15～20 min。于術(shù)后3、7 d 行定位航行實驗檢測（方法同上）。定位航行實驗結(jié)束后，撤出平臺，將大鼠于同一象限放入水中，行空間探索實驗。記錄120 s 內(nèi)大鼠的游泳路徑和穿越原平臺位置次數(shù)。

1.2.6 行為學(xué)實驗完成后，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg 腹腔注射麻醉大鼠。待大鼠翻正反射、夾尾反應(yīng)消失后打開腹腔，暴露腹主動脈，采用無菌采血管取血。將血液室溫下靜置30 min，于低溫離心機中3 000 r/min 離心15 min（離心半徑8 cm），取血清于凍存管中。然后斷頭取腦，于冰上迅速分離海馬組織。按照試劑盒說明書逐步操作。使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長下測定吸光度（OD值），根據(jù)標(biāo)準曲線計算血清、海馬樣品中IL-6、IL-10、TNF-α 的水平。每個亞組取5 只大鼠的海馬組織檢測IL-6、IL-10、TNF-α。

1.2.7 取大鼠海馬組織裂解勻漿，4℃，3 000 r/min 離心20 min（離心半徑8 cm），取上清液。應(yīng)用組織鐵含量檢測試劑盒檢測海馬組織中Fe2+的濃度。具體步驟按照試劑盒說明書進行。

1.2.8 取大鼠海馬組織，按照試劑盒說明書逐步操作，在586 nm 波長下通過酶標(biāo)儀測定OD 值，計算各組大鼠LPO 相對含量。

1.2.9 免疫印跡法（Western blot）檢測海馬ACSL4、LPCAT3 和FTH1 蛋白表達水平：每組選取5 只大鼠，取海馬組織100 mg，加入裂解液提取總蛋白，采用BCA 法測定樣品蛋白濃度。根據(jù)目的蛋白分子量配置相應(yīng)濃度分離膠。將樣品蛋白加入上樣孔中（量依據(jù)BCA濃度計算所得），以80 V 電壓開始電泳，待Marker散開后調(diào)至120 V。電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，置于5%脫脂奶粉中封閉120～150 min。加入稀釋好的一抗，4 ℃搖床孵育過夜。加TBST 稀釋好的二抗，室溫搖床孵育1.5 h。加入ECL 發(fā)光液，機器曝光成像，Image J 軟件中分析條帶灰度值。

1.2.10 透射電鏡觀察海馬區(qū)神經(jīng)細胞超微結(jié)構(gòu)：取灌注后的大鼠海馬組織，在2.5%戊二醛中固定過夜。經(jīng)脫水、包埋后，將樣品切成超薄切片（厚度60～80 nm）。用醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色。水洗，充分干燥后在透射電鏡下觀察細胞超微結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni 檢驗。不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較采用Dunn's 檢驗。術(shù)前不同時間認知功能訓(xùn)練計量資料多組間比較采用雙因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)檢測結(jié)果

2.1.1 術(shù)后3 d、7 d 大鼠組別與時間對大鼠術(shù)前認知功能訓(xùn)練逃避潛伏期均不存在交互作用（P交互＞0.05），訓(xùn)練時間對逃避潛伏期主效應(yīng)均顯著（P時間＜0.05），組別對逃避潛伏期主效應(yīng)均不顯著（P組間＞0.05），見表1、表2。

表1 術(shù)后3 d 各亞組大鼠術(shù)前認知功能訓(xùn)練逃避潛伏期比較（s）Table 1 Comparison of cognitive function training escape latency in 3 d postoperative subgroups

表2 術(shù)后7 d 各亞組大鼠術(shù)前認知功能訓(xùn)練逃避潛伏期比較（s）Table 2 Comparison of cognitive function training escape latency in 7 d postoperative subgroups

2.1.2 術(shù)后3 d 各亞組逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限停留時間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中模型組術(shù)后3 d 亞組逃避潛伏期高于對照組術(shù)后3 d亞組、電針組術(shù)后3 d 亞組，穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限停留時間低于對照組術(shù)后3 d亞組、電針組術(shù)后3 d亞組，電針組術(shù)后3 d 亞組穿越平臺次數(shù)低于對照組術(shù)后3 d亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。大鼠術(shù)后3 d 平均游泳速度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。術(shù)后7 d 各亞組逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限停留時間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中模型組術(shù)后7 d 亞組逃避潛伏期高于對照組術(shù)后7 d 亞組、電針組術(shù)后7 d 亞組，穿越平臺次數(shù)低于對照組術(shù)后7 d亞組，目標(biāo)象限停留時間低于對照組術(shù)后7 d 亞組、電針組術(shù)后7 d 亞組。大鼠術(shù)后7 d 平均游泳速度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表3 大鼠術(shù)后3 d 學(xué)習(xí)記憶情況比較Table 3 Comparison of learning and memory of rats in 3 d postoperative subgroups

表4 大鼠術(shù)后7 d 學(xué)習(xí)記憶情況比較Table 4 Comparison of learning and memory of rats in 7 d postoperative subgroups

2.2 大鼠術(shù)后炎癥反應(yīng)情況

2.2.1 術(shù)后3 d 各亞組血清IL-6、TNF-α、IL-10 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中模型組術(shù)后3 d 亞組IL-6、TNF-α 高于對照組術(shù)后3 d 亞組、電針組術(shù)后3 d 亞組，電針組術(shù)后3 d 亞組TNF-α 高于對照組術(shù)后3 d 亞組，IL-10 高于對照組術(shù)后3 d 亞組、模型組術(shù)后3 d 亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表5。術(shù)后7 d 各亞組血清IL-6、TNF-α、IL-10 含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中模型組術(shù)后7 d亞組IL-6 高于對照組術(shù)后7 d 亞組，TNF-α 高于對照組術(shù)后7 d 亞組、電針組術(shù)后7 d 亞組，電針組術(shù)后7 d亞組IL-10 高于對照組術(shù)后7 d 亞組、模型組術(shù)后7 d亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表6。

表5 術(shù)后3 d 各亞組大鼠血清IL-6、TNF-α 及IL-10 水平比較（pg/mL）Table 5 Comparison of serum IL-6，TNF-α and IL-10 levels in 3 d postoperative subgroups

表6 術(shù)后7 d 各亞組大鼠血清IL-6、TNF-α 及IL-10 水平比較（pg/mL）Table 6 Comparison of serum IL-6，TNF-α and IL-10 levels in 7 d postoperative subgroups

2.2.2 術(shù)后3 d 各亞組海馬IL-6、TNF-α、IL-10 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），其中模型組術(shù)后3 d 亞組IL-6、TNF-α 高于對照組術(shù)后3 d 亞組、電針組術(shù)后3 d 亞組，電針組術(shù)后3 d 亞組IL-6、TNF-α 高于對照組術(shù)后3 d 亞組，IL-10 高于對照組術(shù)后3 d 亞組、模型組術(shù)后3 d 亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表7。模型組術(shù)后7 d 亞組IL-6、TNF-α 高于對照組術(shù)后7 d 亞組、電針組術(shù)后7 d 亞組，電針組術(shù)后7 d亞組IL-10 高于對照組術(shù)后7 d 亞組、模型組術(shù)后7 d亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表8。

表7 術(shù)后3 d 各亞組大鼠海馬IL-6、TNF-α 及IL-10 水平比較（pg/mL）Table 7 Comparison of IL-6，TNF-α and IL-10 levels in hippocampus in 3 d postoperative subgroups

表8 術(shù)后7 d 各亞組大鼠海馬IL-6、TNF-α 及IL-10 水平比較（pg/mL）Table 8 Comparison of IL-6，TNF-α and IL-10 levels in hippocampus in 7 d postoperative subgroups

2.3 大鼠術(shù)后鐵死亡指標(biāo)的檢測結(jié)果

術(shù)后3 d 各亞組大鼠海馬Fe2+、LPO、ACSL4、FTH1 和LPCAT3 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中模型組術(shù)后3 d 亞組Fe2+、LPO、ACSL4、LPCAT3 高于對照組術(shù)后3 d 亞組、電針組術(shù)后3 d 亞組，電針組術(shù)后3 d 亞組高于對照組術(shù)后3 d亞組，模型組術(shù)后3 d 亞組FTH1 低于對照組術(shù)后3 d亞組、電針組術(shù)后3 d 亞組，電針組術(shù)后3 d 亞組低于對照組術(shù)后3 d 亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表9。大鼠術(shù)后7 d 各亞組大鼠海馬Fe2+、LPO、ACSL4、FTH1 和LPCAT3 相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；其中模型組術(shù)后7 d 亞組Fe2+、LPO、ACSL4、LPCAT3 高于對照組術(shù)后7 d 亞組、電針組術(shù)后7 d 亞組，F(xiàn)TH1 低于對照組術(shù)后7 d 亞組、電針組術(shù)后7 d 亞組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表10。術(shù)后3、7 d 各亞組大鼠ACSL4、FTH1 和LPCAT3蛋白條帶圖見圖1、圖2。

圖1 術(shù)后3 d 觀察亞組大鼠海馬ACSL4、FTH1 和LPCAT3 蛋白條帶圖Figure 1 The protein bands of ACSL4，F(xiàn)TH1 and LPCAT3 in 3 d postoperative subgroups

圖2 術(shù)后7 d 觀察亞組大鼠海馬ACSL4、FTH1 和LPCAT3 蛋白條帶圖Figure 2 The protein bands of ACSL4，F(xiàn)TH1 and LPCAT3 in 7 d postoperative subgroups

表10 術(shù)后7 d 各亞組大鼠海馬Fe2+、LPO、ACSL4、FTH1 和LPCAT3 相對表達水平比較Table 10 Comparison of relative expression levels of Fe2+，LPO，ACSL4，F(xiàn)TH1，and LPCAT3 in 7 d postoperative subgroups

2.4 大鼠術(shù)后海馬組織超微結(jié)構(gòu)變化

對照組術(shù)后3 d、7 d 亞組海馬組織視野內(nèi)細胞核形態(tài)規(guī)則、表面光滑，雙核膜結(jié)構(gòu)清晰，核周隙正常，核內(nèi)染色質(zhì)未見凝集；胞質(zhì)內(nèi)部分線粒體自噬；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，未見明顯擴張，見圖3A、圖3 d。模型組術(shù)后3、7 d 亞組海馬組織視野內(nèi)細胞核雙核膜結(jié)構(gòu)清晰，核周隙未見明顯增寬，形態(tài)不規(guī)則，表面凹凸不平；核內(nèi)染色質(zhì)濃縮邊集；胞質(zhì)內(nèi)少量線粒體膜破裂，膜結(jié)構(gòu)消失；部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴張；并可見部分髓鞘斷裂，排列紊亂，見圖3B、圖3E。電針組術(shù)后3、7 d 亞組海馬組織視野內(nèi)細胞核形態(tài)規(guī)則，表面光滑，雙核膜結(jié)構(gòu)清晰，核周隙未見明顯增寬，染色質(zhì)分布較均勻；胞質(zhì)內(nèi)部分線粒體膜破裂，嵴結(jié)構(gòu)消失或減少，基質(zhì)電子密度降低呈空泡化，并可見少量線粒體自噬；部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可見輕度擴張；并可見少量自噬體；胞質(zhì)內(nèi)還可見少量電子密度中等的均質(zhì)性無界膜的脂滴，見圖3C、圖3F。

圖3 大鼠海馬組織超微結(jié)構(gòu)Figure 3 Ultrastructure of rat hippocampal tissues

3 討論

POCD 患者主要癥狀包括術(shù)后精神錯亂、焦慮、人格改變以及記憶力和認知能力減退。其屬于中醫(yī)“癡呆”“健忘”“呆病”等范疇，病位在腦，與心肝脾腎緊密相關(guān)。“髓減腦衰，神機失用”是其主要病機。因腎精不足、氣血虧虛或情志所傷，髓海失充，腦失所養(yǎng)；或瘀血、實邪痹阻腦絡(luò)，清竅失養(yǎng)，腦髓空虛而發(fā)病［12］。

鐵死亡是近年來提出的一種以鐵依賴性LPO 和脂質(zhì)活性氧（reactive oxygen species，ROS）堆積為特點的新型細胞死亡方式，其發(fā)生主要是由于細胞鐵代謝紊亂、氨基酸抗氧化系統(tǒng)不平衡以及LPO 堆積導(dǎo)致的。Fe3+在鐵死亡過程中至關(guān)重要，鐵代謝紊亂會使Fe2+過多的累積在細胞內(nèi)，F(xiàn)e2+通過芬頓反應(yīng)導(dǎo)致ROS 積累，引起細胞氧化應(yīng)激損傷。FTH 是一種鐵載體蛋白，能夠?qū)e3+轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)，從而維持細胞內(nèi)Fe3+的平衡，并具有鐵氧化酶活性，以防止鐵介導(dǎo)的ROS 產(chǎn)生［13］。研究表明，麻醉/手術(shù)后細胞或腦鐵含量顯著增加，F(xiàn)TH 表達下降，海馬神經(jīng)元細胞活力下降，且伴隨著認知功能損傷［14-15］。LPO 積累是細胞發(fā)生鐵死亡的另一因素，需要多種關(guān)鍵酶的激活，如ACSL4 和LPCAT3［16］。ACSL4 是多不飽和脂肪酸代謝的重要同工酶，決定了細胞鐵死亡的敏感性。人神經(jīng)母細胞瘤細胞經(jīng)七氟醚處理后，胞內(nèi)Fe2+和ACSL4 水平明顯升高；沉默ACSL4 能夠明顯抑制七氟醚誘導(dǎo)的細胞鐵死亡過程［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后大鼠海馬Fe2+、ACSL4 和LPO 水平顯著升高，F(xiàn)TH1 水平顯著降低；且經(jīng)電針處理后，海馬Fe2+、ACSL4 和LPO 水平顯著降低，F(xiàn)TH1 水平顯著升高，并伴隨著大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能的改善。

線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變亦是細胞發(fā)生鐵死亡的典型標(biāo)志。在形態(tài)學(xué)上，主要表現(xiàn)為線粒體萎縮缺失、雙層膜密度增加、嵴減少或消失、外膜破裂等［18］。本研究通過透射電鏡觀察海馬超微結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)POCD 大鼠海馬神經(jīng)元細胞胞質(zhì)內(nèi)線粒體膜破裂，膜結(jié)構(gòu)消失，表明麻醉/手術(shù)創(chuàng)傷可導(dǎo)致老年大鼠海馬神經(jīng)元鐵代謝紊亂、脂質(zhì)代謝異常和線粒體結(jié)構(gòu)改變，神經(jīng)元細胞發(fā)生鐵死亡，進一步引起認知功能障礙；電針可通過神經(jīng)元鐵死亡途徑緩解POCD。

麻醉/手術(shù)還會影響炎癥細胞因子表達水平。手術(shù)后手術(shù)部位炎癥細胞因子增加，大腦獨特的炎癥細胞（如小膠質(zhì)細胞）響應(yīng)促炎因子而被激活，并促進神經(jīng)炎癥的進展［19］。IL-6 作為免疫系統(tǒng)中重要的信號分子，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元和突觸功能，包括突觸傳遞和突觸可塑性，這是學(xué)習(xí)和記憶的重要細胞機制［20］。正常情況下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的IL-6 表達水平通常較低，但在一些與認知功能和行為學(xué)改變相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中IL-6 表達水平則明顯升高［21］。促炎細胞因子TNF-α 在免疫和炎癥以及控制細胞增殖、分化和凋亡中亦起重要作用［22-23］。在炎癥反應(yīng)中，誘導(dǎo)TNF-α可產(chǎn)生多種外源性和內(nèi)源性信號，刺激其他炎癥細胞因子的產(chǎn)生，如IL-1、IL-6、IL-8、集落刺激因子（colony stimulating factor，CSF）、干擾素（interferon，IFN）和轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β。IL-10 是一種細胞因子合成抑制因子（cytokine synthesis inhibitory factor，CSIF），可調(diào)節(jié)細胞的生長與分化，參與炎性和免疫反應(yīng)。在炎癥和細胞死亡中起核心作用的促炎細胞因子，如IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α 和IFN-γ 的表達均受IL-10 的免疫調(diào)節(jié)負向調(diào)控［24］。POCD 中樞神經(jīng)炎癥假說認為，外周炎癥因子的變化可能影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，隨后引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，手術(shù)后大鼠血清和海馬炎性因子IL-6、IL-10 和TNF-α 水平明顯升高，促炎和抗炎細胞因子之間的失衡也是POCD 發(fā)展的一個重要病因機制。

電針是將針刺入穴位，并通過針引入電流，從而將電和針結(jié)合起來，以增強針刺的強度和效果［25］。本研究團隊前期通過系統(tǒng)評價的方法證實，電針可以有效緩解老年患者和胃腸道腫瘤切除患者術(shù)后認知功能損傷［6，26］。本研究選取百會和內(nèi)關(guān)穴，設(shè)置參數(shù)為20/100 Hz 疏密波型，對大鼠進行圍術(shù)期5 d 的電針刺激，相關(guān)結(jié)果有效地降低了大鼠術(shù)后認知功能損傷。百會穴和內(nèi)關(guān)穴是臨床實踐中電針預(yù)防POCD 最常選擇的兩個穴位。百會穴為督脈要穴，有疏散風(fēng)寒、溫經(jīng)通陽、升陽固脫、鎮(zhèn)驚息風(fēng)、清熱開竅等作用，為回陽救逆之要穴；內(nèi)關(guān)穴為八脈交會穴之一，手厥陰心包經(jīng)之絡(luò)穴，針之可調(diào)和陰陽、理氣通脈、養(yǎng)心清腦、回陽救逆［27］。

綜上所述，神經(jīng)元細胞鐵死亡和炎癥細胞因子之間的失衡可能是POCD 發(fā)生的重要機制，電針百會穴和內(nèi)關(guān)穴可通過調(diào)控神經(jīng)元細胞鐵死亡和炎癥細胞因子水平有效緩解POCD。本研究為電針改善POCD 提供了新的思路和方法，但電針的腦保護作用機制仍需要進一步驗證和更深入的研究。

作者貢獻：秦曉宇、王春愛負責(zé)選題，進行研究構(gòu)思和設(shè)計；秦曉宇負責(zé)研究的實施和推進，數(shù)據(jù)收集、統(tǒng)計分析并起草了論文；秦曉宇、張斌森、張笑佳、逯曉婷、劉鴻鑫負責(zé)動物實驗、數(shù)據(jù)收集和數(shù)據(jù)整理；秦曉宇、張斌森、張笑佳負責(zé)實驗指標(biāo)檢測；王春愛負責(zé)文章的質(zhì)量控制和審查，對文章整體負責(zé)。

本文無利益沖突。