Caveolin-1 蛋白及其對血腦屏障通透性改變調(diào)節(jié)作用研究

王娟，白雪，王廷華，李雙陽

1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 四川瀘州 646000

2 西南醫(yī)科大學(xué) 四川瀘州 646000

3 四川大學(xué)華西醫(yī)院 四川成都 610041

中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括感染、創(chuàng)傷、腦卒中及神經(jīng)退行性病變等，嚴(yán)重影響人類健康和社會發(fā)展，治療也仍是世界重大醫(yī)學(xué)難題。血腦屏障完整性的改變通常是各神經(jīng)系統(tǒng)疾病臨床癥狀出現(xiàn)前最先出現(xiàn)的病理改變[1]。本綜述通過探討Caveolin-1 調(diào)節(jié)腦損傷后血腦屏障通透性改變，以期為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療靶點提供一定依據(jù)。

血腦屏障是由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain microvascular endothelial cells，BMEC）、內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞、基膜等組分構(gòu)成。能夠有效的調(diào)控中樞與外周血液的物質(zhì)交換，阻止血液中的親水極性和大分子進(jìn)入大腦，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[2]。但同時也使大部分治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）疾病的藥物無法穿過BBB，使藥物無法在腦內(nèi)達(dá)到有效治療濃度。作為血液成分進(jìn)入腦組織的第一道屏障，內(nèi)皮細(xì)胞是血腦屏障的核心組分，具有特殊的結(jié)構(gòu)和分子特性，其通透性改變主要與腦血管內(nèi)皮細(xì)胞及其緊密連接、控制物質(zhì)外排的P 糖蛋（P-glycoprotein，P-gp）轉(zhuǎn)運體、內(nèi)皮細(xì)胞間隙的孔穴以及胞吞、胞飲等作用密切相關(guān)[3]。

圖 血腦屏障結(jié)構(gòu)與組成示意圖（抽象示意圖，根據(jù)文獻(xiàn)所繪制）

Caveolin-1 概述

小窩（caveolae）是存在于許多哺乳動物質(zhì)膜上60- 80nm 的瓶狀凹陷結(jié)構(gòu)，它們存在于多種細(xì)胞類型中，在脂肪細(xì)胞、肌肉和內(nèi)皮細(xì)胞中尤為豐富，具有特殊的脂筏結(jié)構(gòu)，含有豐富的膽固醇、鞘磷脂以及許多跨膜蛋白，它是內(nèi)皮細(xì)胞胞吞、內(nèi)吞和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要位點，其中包括三個成員：CAV1、CAV2 和CAV3，分別編碼具有相似結(jié)構(gòu)的蛋白：Caveolin-1（CAV1）、caveolin-2（CAV2） 和caveolin 3（CAV3）[4-5]。Caveolin-1 是小窩的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，是一個178-aa 的質(zhì)膜蛋白，它在細(xì)胞質(zhì)中采用具有N 端和C 端的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，其中心結(jié)構(gòu)域包含在質(zhì)膜中，在一些神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，但主要是存在于大腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中[6-7]。

Caveolin-1 作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的負(fù)調(diào)控或正調(diào)控，主要取決于所研究的細(xì)胞類型和特定的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。一方面，Caveolin-1 可參與維持血腦屏障完整性，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[8]。研究表明，內(nèi)源性Cav-1 在缺血后最初幾天，可以促進(jìn)新生血管形成、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和瘢痕形成，具有潛在的保護(hù)作用[9]。在Bend.3 細(xì)胞氧糖剝奪模型中，顱內(nèi)慢病毒注射靶向Cav1 的短發(fā)夾RNA 降低Caveolin-1 的表達(dá)，能抑制苦參堿的神經(jīng)保護(hù)功能，破壞神經(jīng)功能的完整性[10]。在大腦中動脈阻塞（MCAO）大鼠模型中，Cav-1 可通過抑制TJ 蛋白表達(dá)的降解來改善血管源性水腫[11]。同時另一方面，Cav-1 在腦出血后早期腦血腦屏障損傷中起著有害作用，Cav-1 敲除的小鼠腦出血后1 天的腦損傷體積更小，神經(jīng)功能缺損更輕，腦水腫更少，神經(jīng)元死亡更少[12]。

圖2 小窩結(jié)構(gòu)（實驗室拍攝的透射電鏡照片）

Caveolin-1 調(diào)節(jié)血腦屏障通透性改變

1 調(diào)節(jié)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Brain Microvascular Endothilial Cells，BMECs）是血腦屏障的基本骨架和關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，是體循環(huán)和腦實質(zhì)之間交換分子的主要界面。相鄰ECs 之間的緊密連接（TJs）復(fù)合物保證了腦內(nèi)皮的物理緊密性[13]。研究發(fā)現(xiàn)，Cav-1 在內(nèi)皮細(xì)胞機(jī)制轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，Cav-1 的缺乏會降低內(nèi)皮細(xì)胞沿血流方向排列的能力，同時cave-1 與血流誘導(dǎo)的血管舒張、血管重塑、NO 生成受損等密切有關(guān)。Elizabeth Le Master 等研究發(fā)現(xiàn)，Cav-1 可能通過調(diào)控CD36 的表達(dá)，調(diào)節(jié)oxLDL 的攝取和oxLDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮硬化，Cav-1 基因缺失可以消除oxLDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮硬化[14]。內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）是血管壁一氧化氮（NO）的主要來源，eNOS 在血管內(nèi)皮中表達(dá)，NO不僅是最重要的內(nèi)皮源性血管舒張因子，參與調(diào)節(jié)基線血管張力和功能性充血，而且在神經(jīng)功能的維持中發(fā)揮重要作用[15]。缺氧應(yīng)激導(dǎo)致eNOS 活性受損和NO 生物利用度降低，使eNOS 和BH4 解耦聯(lián)，無法催化L-精氨酸產(chǎn)生NO，而與氧（O2）相互作用產(chǎn)生超氧化物，從而影響血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)與功能穩(wěn)態(tài)。在內(nèi)皮細(xì)胞中，Cav-1 磷酸化負(fù)調(diào)控eNOS 的活性，在缺血缺氧誘導(dǎo)CAV1 與eNOS 競爭性結(jié)合增加，特異地導(dǎo)致eNOS 在絲氨酸1177 位點磷酸化的減少，并導(dǎo)致NO生成的減少，從而出現(xiàn)腦灌注不足，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和CBF 失調(diào)，加重缺血缺氧損傷，進(jìn)一步損害血腦屏障[16-18]。

2 調(diào)節(jié)緊密連接

緊密連接蛋白主要由跨膜蛋白、胞質(zhì)附著蛋白、細(xì)胞骨架蛋白三類組成，Esther Sasson 等人研究血腦屏障緊密連接納米結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，在小鼠發(fā)育過程中，滲透性TJs 首先對大分子具有限制性，然后才對小分子具有限制性，在這一成熟過程中，claudin-5 蛋白排列緊密，同時，claudin-5 和ZO1 蛋白是以離散簇的中斷線組織，形成珠狀結(jié)構(gòu)，防止有害物質(zhì)通過[19]。缺氧會引起內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接的破壞觸發(fā)血腦屏障（BBB）損傷并誘導(dǎo)血管源性水腫。Yan Xue 等人研究表明，缺氧通過激活NRF1 誘導(dǎo)Cav-1 表達(dá)上調(diào)，下調(diào)了緊密連接蛋白，阻斷cav -1 介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運可改善缺氧內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)TJs 的完整性，有效抑制血腦屏障通透性和腦水含量的增加[20]。

基 質(zhì) 金 屬 蛋 白 酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一組鋅離子依賴性蛋白酶，主要的功能為降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），可影響緊密連接（TJ）的重塑和降解。在BBB 完整性中的起著重要作用[21]。MMP-9 主要在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。MMP-2的表達(dá)細(xì)胞主要有小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞。急性腦損傷時，MMP-9 和MMP-2 的高表達(dá)加重了血腦屏障的破壞、腦水腫[22]。腦缺血再灌注過程中，Caveolin-1 可以通過抑制RNS的產(chǎn)生和MMPs 的活性，阻止TJ 蛋白的降解，保護(hù)BBB 的完整性[23-24]。在體外培養(yǎng)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMECs）敲除Cav-1 和體內(nèi)敲除Cav-1 小鼠（KO）中，Cav-1 敲除顯著增加了BMECs 中MMPs 的活性，介導(dǎo)了血腦屏障的損傷[25]。NMDA 是一種谷氨酸類似物，可以激活n-甲基-d-天冬氨酸受體（NMDAR），NMDA 暴露抑制了TJ 蛋白 occludin 和 claudin-5 的表達(dá)，誘導(dǎo)ZO-1，Cav-1 和ERK1/2 磷酸化的下調(diào)，用ERK1/2 抑制劑可防止 NMDA 誘導(dǎo)的緊密連接 ZO-1功能障礙以及腦中的 Cav-1 的表達(dá)。靶向Caveolin-1相關(guān)的ERK1/2 信號可能是治療由緊密連接蛋白表達(dá)減少引起的血腦屏障功能障礙的方法[26]。研究表明，激活ERK1/2 信號通路有利于降低缺血大鼠腦組織中MMP-9 的活性，減少神經(jīng)細(xì)胞死亡[27]。

3 調(diào)節(jié)P-糖蛋白（P-gp）轉(zhuǎn)運體

P-糖蛋白（P-gp）是ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體家族中重要的外排轉(zhuǎn)運體，能轉(zhuǎn)運內(nèi)源性代謝產(chǎn)物或外源性異物誘導(dǎo)作用，對維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有重要作用。越來越多的證據(jù)表明，ABC 運輸?shù)鞍譸 -糖蛋白（Pgp）是血腦屏障的主要成分，腦源性代謝物通過血腦屏障的腦-血運輸障礙是各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的主要發(fā)病機(jī)制[28]。一項隨機(jī)對照實驗表明，與對照組相比，輕度AD 受試者的頂顳葉、額葉、后扣帶皮層和海馬區(qū)血腦屏障p -糖蛋白活性顯著降低[29]。同時如在腫瘤患者的治療過程中，P-糖蛋白（P-gp）的存在，使治療藥物排出細(xì)胞外，使藥物達(dá)不到有效生物利用度及多藥耐藥的存在。從外排轉(zhuǎn)運系統(tǒng)出發(fā)探討Cave-1 調(diào)控P-糖蛋白（P-gp）介導(dǎo)血腦屏障通透性改變，調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。

研究發(fā)現(xiàn)，P-gp 除主要表達(dá)于腦腫瘤毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的腔膜面外，也部分表達(dá)于膠質(zhì)細(xì)胞的足突，共同發(fā)揮藥物外排功能。熒光雙染證實P-gp 與Caveolin-1 在細(xì)胞膜上存在共表達(dá)現(xiàn)象，內(nèi)皮細(xì)胞的腔膜面以及部分腔膜面與基底面的交界處存在 P-gp和Cav1 的共表達(dá)區(qū)域，說明 Cav1 可能參與了對 P-gp在細(xì)胞膜上的物質(zhì)轉(zhuǎn)運作用的功能調(diào)節(jié)[30]。cave-1是Src 等非受體酪氨酸激酶的底物，Src 激酶在小穴介導(dǎo)的內(nèi)吞作用啟動早期被激活。cave-1 的酪氨酸磷酸化發(fā)生在酪氨酸-14 處，可誘導(dǎo)小泡囊泡和/或融合[31-32]。Cav1 是一種調(diào)節(jié)P-gp 功能的支架蛋白，Src 激酶的激活導(dǎo)致Cav1 的Tyr14 快速磷酸化，誘導(dǎo)P-gp 的內(nèi)化，從而降低血腦屏障的皮質(zhì)醇外泄功能[33]。Yanling Fan 等人研究發(fā)現(xiàn)，Rack1 作為信號樞紐，可以介導(dǎo)Src 與P-gp 結(jié)合，從而促進(jìn)Src 磷酸化Cav1，消除Cav1 對P-gp 的抑制作用[34]。

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種多效細(xì)胞因子，能促進(jìn)細(xì)胞生長、存活和血管生成，VEGF 在大腦和/或大腦微血管系統(tǒng)中的過表達(dá)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理相關(guān)，包括阿爾茨海默病、腦瘤、缺血和腦損傷。Hawkins Brian T and Sykes Destiny B 等人研究發(fā)現(xiàn)，使用tyr14 磷酸化特異性抗體，發(fā)現(xiàn)將腦毛細(xì)血管暴露于VEGF 或Src 激活肽YEEIP 增加了腦毛細(xì)血管中酪氨酸-14 小泡蛋白-1 的磷酸化，增加了小洞穴蛋白-1 與p -糖蛋白的關(guān)聯(lián)，并對培養(yǎng)的腦內(nèi)皮細(xì)胞中p -糖蛋白的轉(zhuǎn)運活性起到負(fù)調(diào)控作用，腦室內(nèi)注射VEGF 增加了p -糖蛋白底物嗎啡和維拉帕米的腦分布[35]。綜上所述，P-糖蛋白是血腦屏障重要的外排轉(zhuǎn)運體，cave-1 通過不同信號通路調(diào)節(jié)p -糖蛋白的轉(zhuǎn)運活性，調(diào)節(jié)血腦屏障通透性。

4 調(diào)節(jié)胞吞轉(zhuǎn)運作用

胞吞作用又稱內(nèi)吞作用或入胞作用，它是質(zhì)膜內(nèi)陷，包裹細(xì)胞外物質(zhì)，形成胞吞泡，然后脫離細(xì)胞膜將其裹進(jìn)并輸入細(xì)胞內(nèi)的過程。根據(jù)胞吞物質(zhì)大小可分為吞噬作用和胞飲作用兩種類型。細(xì)胞對固體顆粒的攝入過程稱為吞噬作用，對液體及溶解在液體中的溶質(zhì)的攝入過程稱為胞飲作用[36]。胞吞轉(zhuǎn)運途徑是必需大分子物質(zhì)（如多肽激素、金屬載體、脂蛋白等）入腦的主要途徑，在胚胎發(fā)育和成年生理狀態(tài)下，低水平的胞吞轉(zhuǎn)運抑制血腦屏障通透性，而在多種病理條件下其水平升高則對血腦屏障的破壞具有重要的促進(jìn)作用[37]。

Hamid Salimi 等人研究表明委內(nèi)瑞拉和西方馬腦炎病毒病毒通過小洞穴蛋白-1（Cav-1）介導(dǎo)的胞吞作用（Cav-MT）通過完整的血腦屏障向中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行血行播散[38]。蜘蛛毒液（PNV）誘導(dǎo)血腦屏障（BBB）的破壞，PNV 富含影響谷氨酸處理和干擾離子通道生理的神經(jīng)毒性肽。小泡蛋白-1 是控制小泡形成的中心蛋白。研究表明pnv 誘導(dǎo)的血腦屏障打開與形成小泡框架的小泡蛋白-1α 的高表達(dá)有關(guān)，與內(nèi)化和增強(qiáng)的胞吞過程有關(guān)[39]。聚焦超聲（FUS）聯(lián)合一定劑量的微泡治療可通過上調(diào)小泡蛋白-1 的表達(dá)水平，進(jìn)而上調(diào)小泡的數(shù)量，通過小泡介導(dǎo)的跨細(xì)胞途徑增強(qiáng)血腦屏障的通透性[40]。

5 調(diào)節(jié)白細(xì)胞粘附作用

白細(xì)胞粘附分子可以抑制血液免疫細(xì)胞的粘附和轉(zhuǎn)運入腦，趨化因子和趨化因子受體在免疫細(xì)胞的募集和激活上起著重要的調(diào)控作用，腦缺血后調(diào)控外周免疫細(xì)胞浸潤入腦，例如單核/巨噬細(xì)胞。CC 趨化因子受體2（CCR2）是趨化因子受體中的重要一員，與其配體CC 趨化因子配體2（CCL2）在神經(jīng)炎癥中發(fā)揮著重要的作用[41]。在腦實質(zhì)中產(chǎn)生的趨化因子CCL2 如何招募位于血腦屏障（BBB）高度不透水的內(nèi)皮后的白細(xì)胞，一直是一個悖論。Shujun Ge 等人研究表明CCL2 在炎癥發(fā)作時沉積在腦微血管壁側(cè)，可以通過血腦屏障傳遞促進(jìn)白細(xì)胞的募集，Caveolin-1參與了ccl2 的這種運輸，小泡蛋白-1 的siRNA 敲除，導(dǎo)致CCL2 轉(zhuǎn)運顯著增加，增加血腦屏障通透性[42]。

各種藥物調(diào)節(jié)Caveolin-1 介導(dǎo)血腦屏障通透性改變

Caveolin-1 作為調(diào)節(jié)血腦屏障通透性改變的重要靶點，許多學(xué)者通過研究藥物干預(yù)Caveolin-1 的表達(dá)影響血腦屏障通透性改變。研究表明，抑制Cav-1活化后可減輕N- 甲基-D 天冬氨酸（NMDA）誘導(dǎo)HBEC-5i 中緊密連接蛋白ZO-1 的破壞，從而減輕緊密連接屏障的通透性[43]。雌二醇能增加局灶性腦缺血（MCAO）大鼠Caveolin-1、VEGF 的表達(dá)，改善模型大鼠的神經(jīng)功能缺失癥狀[44]。三七有效成分三七皂苷通過下調(diào)MMP2、9，上調(diào)半暗帶zo1 和claudin5的表達(dá)和重新分配環(huán)抱素和caveolin，降低了BBB 滲漏和腦梗死體積，減弱了卒中后大鼠神經(jīng)功能缺損[45]。氧化苦參堿能夠通過下調(diào)CAV1 和MMP9 表達(dá)改善腦缺血再灌注損傷后血腦屏障完整性[46]。養(yǎng)血清腦丸治療的高血壓大鼠，TJ 蛋白表達(dá)降低，而小窩的主要蛋白 Caveolin-1 的表達(dá)增加，能保持內(nèi)皮完整，減輕能量代謝紊亂抑制大鼠海馬和皮層的血管周圍水腫[47]。苦碟子注射液能抑制腦內(nèi)皮細(xì)胞中的Caveolin-1 和 Src 活性，改善血流量，減少梗塞體積和神經(jīng)功能缺陷，保護(hù)血腦屏障通透性[48]。Caveolin-1磷酸化氧化應(yīng)激導(dǎo)致血管通透性加重，去偶聯(lián)的槲皮素可以通過抑制Caveolin-1 磷酸化而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，起到預(yù)防氧化應(yīng)激狀態(tài)下血管通透性改變的作用[49]。人參皂苷是人參根中主要的具有生物活性化合物，張高嬌等研究表明沉默Cav-1 后人參皂苷Rb1 可以改善MCAO 小鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分，減少MCAO 小鼠腦梗死體積與腦含水量，增加Bcl-2/Bax 的比率，具有腦保護(hù)作用[50]。

總 結(jié)

血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能完整是治療腦缺血缺氧的重要突破口，經(jīng)過以上研究表明，Cave-1 可通過作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、緊密連接蛋白，聯(lián)合控制物質(zhì)外排的P 糖蛋白、胞吞轉(zhuǎn)運、白細(xì)胞黏附等多個方面一起調(diào)控血腦屏障通透性。其中Cave-1 與VEGF 關(guān)系密切，病理性升高的 VEGF 可通過通過下游 PI3K/AKT 通路增強(qiáng)血管通透性和滲漏，并破壞血腦屏障的完整性，促進(jìn)血腦屏障泄露，其中蛋白激酶 B（AKT）可特異性磷酸化內(nèi)皮一氧化氮氧合酶（endothial nitric oxide synapse，eNOS），而在靜息狀態(tài)下，eNOS 鈣結(jié)合域在內(nèi)皮細(xì)胞中特異性與小窩蛋白 Caveolin-1 結(jié)合而失活，當(dāng)缺血缺氧發(fā)生時，eNOS Ser1177 位點磷酸化從 Caveolin-1 解離并催化 L-精氨酸產(chǎn)生一氧化氮（NO）介導(dǎo)血管內(nèi)皮響應(yīng)血流量調(diào)節(jié)。同時，VEGFR-2 是 VEGF 在 CEC 效應(yīng)的主要受體介質(zhì)，VEGF 結(jié)合 VEGFR-2 同時可激活細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶Src，Src 是 Caveolin-1 活化的關(guān)鍵激酶，既Src 介導(dǎo)的Caveolin-1 Tyr14 磷酸化會增加其對 eNOS 的競爭性結(jié)合，減少后者 Ser1177 磷酸化并提高 Thr495 磷酸化，抑制 eNOS 對腦血流變化的內(nèi)皮響應(yīng)，減少 NO 的生成，從而出現(xiàn)腦灌注不足、CEC 功能障礙和 CBF 失調(diào)、轉(zhuǎn)運功能障礙的惡性循環(huán)，在后期的實驗研究中可以進(jìn)一步探討。

表1 各種藥物調(diào)節(jié)Caveolin-1 保護(hù)血腦屏障通透性

圖3 Cave-1 調(diào)控血腦屏障通透性主要機(jī)制示意圖