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    角叉菜膠構建大鼠慢性非細菌性前列腺炎模型的影響因素

    2023-11-16 02:32:54蘇旭珍項瑞君張春雷常德輝
    武警醫(yī)學 2023年10期
    關鍵詞:角叉菜膠精囊雄性

    蘇旭珍,張 強,項瑞君,張春雷,張 斌,常德輝

    前列腺炎是臨床常見病、多發(fā)病之一,其中慢性前列腺炎在前列腺炎中的占比高達90%[1],以慢性非細菌性前列腺炎(chronic non-bacterial prostatitis,CNP)占比為主。臨床主要表現(xiàn)為陰囊潮濕、會陰部疼痛不適、陰莖疼痛及性交射精痛,同時伴尿頻、尿急、尿痛、尿不盡等癥狀[2,3]。CNP病因復雜,發(fā)病機制尚未研究清楚[4],所以建立穩(wěn)定、理想的動物CNP模型對研究其發(fā)病機制有重要意義?,F(xiàn)有動物CNP模型研究中,角叉菜膠注射于大鼠局部構建CNP模型在化學法構建CNP模型中較為常用。但是國內(nèi)外文獻關于構建模型的鼠種、角叉菜膠注射部位以及注射濃度均無統(tǒng)一標準,導致構建的模型缺乏統(tǒng)一標準。本研究重點觀察鼠種、角叉菜膠注射部位及注射濃度對角叉菜膠構建大鼠CNP的影響,以形成穩(wěn)定、重復性好的CNP大鼠模型構建方法,為后期研究CNP發(fā)病機制、構建穩(wěn)定可靠的動物模型提供實驗參考。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 選用解放軍聯(lián)勤保障部隊第940醫(yī)院實驗動物中心提供的無特定病原體級(specific pathogen free, SPF)雄性大鼠60只(SD 30只,Wistar 30只),體重220~280 g, 10周齡,許可證號:SCXY(軍)2012-0020。動物飼養(yǎng)于解放軍聯(lián)勤保障部隊第940醫(yī)院實驗動物房,給予嚙齒類動物標準顆粒飼料(實驗動物中心提供)及自來水自由飲用,12 h循環(huán)明暗光照,恒定溫度(24±2 ℃)、濕度(40%~70%)。實驗方案由解放軍聯(lián)勤保障部隊第940醫(yī)院動物倫理委員會批準(審批編號:2021KYLL141)。

    1.2 實驗儀器與試劑 角叉菜膠(Sigma,美國,生產(chǎn)批號:C1013-25G);0.9%氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司,生產(chǎn)批號:C22051805);10%水合氯醛(蘭州大學第一醫(yī)院,生產(chǎn)批號:H04000035);青霉素G鈉鹽(北京博奧森生物技術有限公司,生產(chǎn)批號:D21004);10%甲醛固定液(南昌雨露實驗器材有限公司,生產(chǎn)批號:190515);蘇木精-伊紅(HE)組套染色液(南昌雨露實驗器材有限公司,生產(chǎn)批號:190601);一次性注射器(山東威高集團醫(yī)用高分子制品股份有限公司,生產(chǎn)批號:20220221);病理圖像采集系統(tǒng)(OLYMPUS 公司,日本,型號:BX53-DP26)。

    1.3 方法

    1.3.1 分組與模型制備 (1)角叉菜膠生理鹽水溶液制備:稱取0.1 g、0.3 g角叉菜膠兩份,分別定容成10 ml的角叉菜膠生理鹽水溶液,配置成1%、3%的角叉菜膠生理鹽水溶液留置備用。制備全程在潔凈工作臺制備并儲存于無菌離心管中。(2)分組:將30只SD雄性大鼠隨機分成5組,每組6只,A組為正常對照組,B組為1%角叉菜膠溶液注于前列腺組,C組為3%角叉菜膠溶液注于前列腺組,D組為1%角叉菜膠溶液注于精囊組,E組為3%角叉菜膠溶液注于精囊組;將30只Wistar雄性大鼠隨機分成5組,每組6只,其中F組為正常對照組,G組為1%角叉菜膠溶液注于前列腺組,H組為3%角叉菜膠溶液注于前列腺組,I組為1%角叉菜膠溶液注于精囊組,J組為3%角叉菜膠溶液注于精囊組。(3)模型制備:綜合參考以往的造模方式[5,6],大鼠分籠適應性飼養(yǎng)7 d后取出用10%水合氯醛腹腔注射(劑量:0.3 ml/100 g)麻醉,血管鉗夾持大鼠腹部皮膚無反應后將大鼠移至無菌臺,剔除腹毛,用聚維酮碘消毒大鼠腹部皮膚,紗布保護手術區(qū)域,下腹部沿腹中線剪開3 cm長的縱行切口,逐層打開腹腔充分暴露前列腺左右腹側(cè)葉及雙側(cè)精囊,輕輕固定注射部位,前列腺左右腹側(cè)葉各注射2針(每針0.05 ml,共計0.20 ml/只)或精囊左右側(cè)各注射1針(每針0.10 ml,共計0.20 ml/只),每次注射結束后無菌紗布按壓注射點,防止角叉菜膠溶液外滲,造成后期腹腔嚴重粘連。注射完畢后將臟器歸位,觀察無明顯出血后逐層關閉腹腔,聚維酮碘再次消毒清理血漬,防止大鼠互相撕咬。肌肉注射青霉素G鈉鹽(劑量25萬U/kg),1次/d,連續(xù)3 d。每天觀察大鼠狀態(tài)及進食量,21 d后稱重,同法麻醉解剖取前列腺后處死大鼠。

    1.3.2 檢測指標與方法 摘除大鼠前列腺完整組織后稱取濕重,計算前列腺指數(shù)。公式為:前列腺指數(shù)=前列腺組織總濕重/大鼠體重(單位:mg/g)。將前列腺完整組織置于組織固定液做組織HE染色,通過光學顯微鏡觀察截圖,病理組織HE染色炎癥細胞計數(shù),參照王先進等[7]評判標準。

    2 結 果

    2.1 解剖學觀察 正常對照組大鼠前列腺組織比較飽滿,色澤紅潤,彈性較好,與周圍組織未見粘連。實驗組大鼠前列腺組織暗淡無光,彈性欠佳,與周圍組織粘連明顯,其中SD雄性大鼠較Wistar雄性大鼠炎癥反應更加明顯,部分SD大鼠出現(xiàn)了腹膜炎、腹水,甚至出現(xiàn)死亡情況。就解剖整體肉眼觀評價,SD大鼠對注射角叉菜膠炎癥反應更加敏感。

    2.2 前列腺指數(shù)測定 各實驗組大鼠的前列腺指數(shù)(mg/g)分別為:B組2.27±0.05、C組2.43±0.07、D組2.32±0.04、E組2.45±0.04、G組2.30±0.02、H組2.49±0.04、I組2.37±0.04、J組2.50±0.04;與正常組大鼠(A組2.03±0.06、F組2.07±0.04)比較,實驗組大鼠前列腺指數(shù)均顯著增大,具有明顯差異(P<0.05)。

    2.3 組織病理學 病理切片顯微鏡下觀察顯示,正常組大鼠前列腺可見大小一致的前列腺腺泡腔,腺泡腔壁均勻一致,腔內(nèi)皺壁豐富且形態(tài)規(guī)則;前列腺間質(zhì)無明顯腫脹,分界較清晰,無或者伴少量炎癥細胞浸潤。實驗組大鼠部分前列腺組織或整個腺體組織前列腺腺泡腔散亂,無固定形態(tài),腔內(nèi)皺壁欠規(guī)則或消失。前列腺間質(zhì)明顯腫脹且分界不明顯,大量炎癥細胞浸潤,血管明顯擴張,前列腺病理改變明顯。各組大鼠前列腺病理HE染色炎癥細胞計數(shù)(單位:個/HP,表1)。

    表1 各組大鼠前列腺病理HE染色炎癥細胞計數(shù)

    3 討 論

    現(xiàn)有動物CNP模型的研究中,角叉菜膠注射于大鼠局部構建CNP模型在化學法構建CNP模型中較為常用?;瘜W試劑角叉菜膠是一種誘導非特異性炎癥的經(jīng)典試劑,角叉菜膠局部注射構建CNP大鼠模型是制備CNP模型的常用方法,通過查閱文獻[5,6,8-20]了解雄性大鼠鼠種、注射部位、注射濃度及劑量卻不盡相同(表2),但沒有相關研究表明各種方法的優(yōu)劣之處。在雄性大鼠鼠種的選擇上,既往報道可以用SD、Wistar、lewis大鼠等構建CNP模型,其中SD、Wistar雄性大鼠較為常用,本實驗選擇SD、Wistar雄性大鼠構建CNP模型做比較;在注射部位選擇時,既往報道有選取雙側(cè)精囊、前列腺左右腹側(cè)葉、前列腺背側(cè)葉,筆者前期實驗操作發(fā)現(xiàn)前列腺背側(cè)葉解剖暴露比較困難,并且有報道顯示背側(cè)葉和腹側(cè)葉對造模影響不太顯著;既往研究顯示注射濃度最常用的有1%、3%,也有選擇5%的情況。

    本研究結果顯示:(1)SD大鼠前列腺病理HE染色混合炎癥細胞計數(shù)變化明顯,并且在Wistar正常大鼠前列腺組織中檢測到炎癥細胞,考慮與鼠種有關,這樣很難區(qū)分是否是由于局部注射角叉菜膠造成的,并且在后續(xù)的實驗中觀察到實驗組與正常組變化較SD大鼠不太顯著,所以就化學試劑局部注射構建CNP模型鼠種選擇時建議選擇SD雄性大鼠。(2)選擇雙側(cè)精囊、前列腺左右腹側(cè)葉局部注射對比,發(fā)現(xiàn)在雙側(cè)精囊注射化學試劑構建CNP模型時,大鼠死亡率比較高,并且有個別大鼠出現(xiàn)腹部急性期炎癥變化,但是前列腺局部炎癥浸潤范圍較廣。選擇前列腺左右腹側(cè)葉注射,發(fā)現(xiàn)大鼠死亡率明顯下降,并且建模成功率較高,但是只有注射進針部位周圍出現(xiàn)了慢性炎癥浸潤,可以選擇多點注射擴大炎癥范圍來彌補這一不足。(3)本研究前期實驗發(fā)現(xiàn),在配置5%生理鹽水角叉菜膠溶液時溶解比較困難,并且由于過于黏稠,注射時有一定困難。對比發(fā)現(xiàn)3%生理鹽水角叉菜膠溶液較1%的建模效果更明顯。前期實驗研究發(fā)現(xiàn),前列腺左右腹側(cè)葉注射時如果單個注射點注射量過大,退針后由于局部張力過大漏液,后期會出現(xiàn)腹腔嚴重粘連,對解剖取材造成一定困難。建議選擇適宜的量多點注射,并且在退針后可用清潔紗布局部輕輕沾取漏液,避免后期腹腔炎癥。另外,在前期的實驗觀察中建議選擇適宜鼠齡的SD雄性大鼠,鼠齡較小,前列腺體積小,可能會影響造模效果。操作抓取大鼠時不可對大鼠尾巴造成損傷,即使長時間抓捏,也會造成大鼠后期斷尾情況,所以建議抓取大鼠時注意保護大鼠尾巴。建議實驗操作后預防性注射抗生素,以降低實驗大鼠死亡率。

    本研究初步明確了大鼠鼠種、角叉菜膠注射部位、注射濃度對建立模型的影響,通過組合最優(yōu)因素,為形成穩(wěn)定、良好的動物CNP模型提供了參考。后期我們將繼續(xù)關注相關研究進展,從宏觀和微觀等角度,器官及細胞等水平探索CNP大鼠模型與臨床的聯(lián)系,為后期研究致病機制及相關治療靶點提供新的思路和方法。

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