牙周炎經(jīng)TLR4/NF-κB影響2型糖尿病中醫(yī)證候的實驗研究

郭楠 林耿冰

糖尿病已成為繼心血管疾病、腫瘤之后的第三大威脅人類健康的非傳染病，在我國成年人群中已成為一個流行病，20 歲及以上成年人發(fā)病占成年人口的9.7%，其中60.7%的糖尿病未被確診，尤其是2 型糖尿?。╠iabetes mellitus type 2，T2DM），約占糖尿病的95%[1-2]。牙周疾病影響全球約90%的人口[3]。其中牙周炎是我國成年人失牙的主要原因，其與糖尿病均為高度流行的慢性疾病，都是公共衛(wèi)生的重大挑戰(zhàn)。牙周炎與糖尿病之間具有雙向聯(lián)系，表現(xiàn)為糖尿病與牙周炎的發(fā)生和進展增加有關(guān)，牙周炎與糖尿病患者的血糖控制較差有關(guān)[4]。本研究通過糖尿病動物模型分析慢性牙周炎對2 型糖尿病虛證-血瘀證中醫(yī)證候演變的影響。病證結(jié)合是中西醫(yī)最好的結(jié)合模式，同時遵循“方證相關(guān)”的原則[5]；因此本研究可為伴慢性牙周炎的糖尿病患者進行中醫(yī)治療提供新的思路或方劑依據(jù)，為之后進行相關(guān)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2022 年6—12 月選用30 只8 周齡雄性健康的清潔級白色封閉群大鼠（sprague dawley，SD），體質(zhì)量為180 ～220 g。SD 大鼠由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供[動物合格證號SXK（閩）2022-0032]。

1.2 方法

將SD 大鼠隨機分為糖尿病組及糖尿病合并牙周炎組，每組15 只，兩組大鼠均以高脂飼料喂養(yǎng)2 周。

1.2.1 糖尿病組動物模型

根據(jù)參照文獻中的方法[2]，大鼠高脂飼料喂養(yǎng)的方式飼養(yǎng)2 周后，禁食12 h 后，一次性腹腔內(nèi)注射1%鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）30 mg/kg，注射后第3 天尾靜脈采血檢測大鼠的空腹血糖（fasting plasma glucose，F(xiàn)PG），F(xiàn)PG ≥11.1 mmol/L 為糖尿病建模成功。與糖尿病合并牙周炎組動物模型大鼠同時同樣以7.5 mL/kg 腹腔注射麻藥，待麻醉蘇醒后放回籠內(nèi)。

1.2.2 糖尿病合并牙周炎組動物模型

在構(gòu)建糖尿病動物模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用氯胺酮（浙江九旭藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20023609，規(guī)格：10 mL：0.1 g）、阿托品（重慶迪康長江制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H50021127，規(guī)格：0.3 mg）和安定（貴州光正制藥有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字H37022025，規(guī)格：2 mL：10 mg×10 支/盒）各1 支，以生理鹽水稀釋至10 mL，按照7.5 mL/kg 進行腹腔注射麻醉。大鼠麻醉后，用探針將上頜雙側(cè)第一磨牙牙齦與牙面分離，使用4-0 絲線結(jié)扎牙頸部，并接種Pg 菌液，2 d 重復(fù)接種1 次，1 周后大鼠牙周出現(xiàn)牙齦炎癥狀，牙齦紅腫，探診易出血，可探及較深的牙周袋，表明牙周炎大鼠建模成功。

1.2.3 建模成功后操作

建模成功后12 周時，兩組大鼠均處以安樂死，收集血液，迅速解剖大鼠后取主動脈。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 外觀表征

每天對大鼠進行一般情況的檢查。記錄毛色（光澤/枯黃）、精神（萎靡/倦怠/嗜睡）、體質(zhì)量、食物攝入量、飲水量、糞色（黃/黑/正常）、拉尾排便（+）、拉尾排尿（+）、運動（靈活/少動）、抓握力（有力/微弱）、舌質(zhì)（淡紅/暗紅/紫）、舌苔（薄/少/無）、臀尾色澤變化（粉紅/淡白/暗）、尾溫（熱/正常/涼）等。

1.3.2 生化指標(biāo)

包括FPG、總膽固醇（total cholestero，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）、 高 密 度 脂 蛋 白（high-density lipoprotein，HDL）。

1.3.3 血液流變學(xué)分析

使用血流流變快測儀（上海保圣實業(yè)發(fā)展有限公司，型號：Fasco--3010D）檢測全血低、中、高切（1、30、200 s-1）黏度，血漿黏度，纖維蛋白原含量等。

1.3.4 血清細(xì)胞因子及血液相關(guān)酶

酶聯(lián)免疫吸附劑測定法檢測C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、腫瘤壞死因子α（α-tumor necrosis factor，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）和白細(xì)胞介素-1（interleukin 1，IL-1）。

1.3.5 組織病理學(xué)分析

主動脈組織用10%福爾馬林固定（北京索萊寶有限公司，規(guī)格：500 mL），蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，簡稱HE 染色法），光鏡下觀察，進行組織病理學(xué)評價。

1.3.6 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse tran-scriptase PCR，RT-PCR）檢測

主動脈局部Toll 樣受體-4（toll like receptor-4，TLR-4）、 核 因 子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB） 蛋白、TNF-α、IL-6 的mRNA 表達水平；Westernblot 檢測TLR-4、NF-κB、人核因子κB 抑制蛋白α（inhibitory subunit of NF kappa B alpha）IκBα、磷酸化IκB 激酶-α（phosphorylation iκB kinase-αP-iκBα，p-IκBα）蛋 白表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以（±s）表示，進行t檢驗；計數(shù)資料以n（%）表示，進行χ2檢驗或Fisher 確切概率法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠證候分析比較

根據(jù)大鼠外觀表征，糖尿病合并牙周炎組與糖尿病組主要表現(xiàn)出氣陰兩虛型、陰虛熱盛型、痰濕內(nèi)阻型、瘀血停滯型和陰陽兩虛型。兩組大鼠證候分型進行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 糖尿病合并牙周炎組與糖尿病組大鼠證候分析比較[例（%）]

2.2 兩組大鼠血糖、血脂水平比較

糖尿病合并牙周炎組大鼠FPG、TC、TG、LDL 水平高于糖尿病組，HDL 水平低于糖尿病組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 糖尿病合并牙周炎組與糖尿病組大鼠血糖、血脂比較（mmol/L，±s）

表2 糖尿病合并牙周炎組與糖尿病組大鼠血糖、血脂比較（mmol/L，±s）

組別 FPG TC TG LDL HDL糖尿病組（n ＝15） 6.92±2.21 1.04±0.28 2.34±0.85 1.62±0.25 0.21±0.04糖尿病合并牙周炎組（n ＝15） 14.53±4.16 2.71±0.36 5.72±0.97 2.02±0.52 0.14±0.03 t 值 6.257 14.182 10.150 2.685 5.422 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.012 ＜0.001

2.3 兩組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)比較

兩組大鼠全血低、中、高切黏度，血漿黏度，纖維蛋白原比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 糖尿病合并牙周炎組與糖尿病組大鼠血液流變指標(biāo)比較（±s）

表3 糖尿病合并牙周炎組與糖尿病組大鼠血液流變指標(biāo)比較（±s）

組別 全血低切黏度（mPa/s）纖維蛋白原（g/L）糖尿病組（n ＝15） 9.47±1.09 6.02±1.28 4.68±0.53 9.43±0.12 2.98±0.26糖尿病合并牙周炎組（n ＝15） 11.28±2.17 7.14±1.64 5.12±0.64 10.11±0.21 3.76±0.28 t 值 2.887 2.085 2.051 10.889 7.906 P 值 0.007 0.046 0.049 ＜0.001 ＜0.001全血中切黏度（mPa/s）全血高切黏度（mPa/s）血漿黏度（mPa/s）

2.4 兩組血清細(xì)胞因子及血液相關(guān)酶比較

兩組大鼠CRP、IL-1、IL-6、TNF-α 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 糖尿病合并牙周炎組與糖尿病組大鼠血清細(xì)胞因子及血液相關(guān)酶比較（±s）

表4 糖尿病合并牙周炎組與糖尿病組大鼠血清細(xì)胞因子及血液相關(guān)酶比較（±s）

組別 CRP（mg/L） IL-1（ng/L） IL-6（ng/L） TNF-α（ng/L）糖尿病組（n ＝15） 23.35±2.18 0.23±0.15 103.32±74.01 0.91±0.32糖尿病合并牙周炎組（n ＝15） 26.29±2.45 0.35±0.16 223.12±88.56 1.19±0.38 t 值 3.472 2.119 4.020 2.183 P 值 0.002 0.043 ＜0.001 0.038

2.5 RT-PCR 檢測和Westernblot 檢測結(jié)果比較

兩組大鼠主動脈局部TLR-4、NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA 表達水平和TLR-4、NF-κB、IκBα、p-IκBα 蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表5、表6。

表5 糖尿病合并牙周炎組與糖尿病組大鼠主動脈局部TLR-4、NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA 表達水平比較（±s）

表5 糖尿病合并牙周炎組與糖尿病組大鼠主動脈局部TLR-4、NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA 表達水平比較（±s）

組別 TLR-4 NF-κB TNF-α IL-6糖尿病組（n ＝15） 11.42±1.09 0.26±0.12 116.54±46.76 0.86±0.29糖尿病合并牙周炎組（n ＝15） 14.12±1.16 0.36±0.13 175.78±51.43 1.11±0.32 t 值 6.570 2.189 3.301 2.242 P 值 ＜0.001 0.037 0.003 0.033

表6 糖尿病合并牙周炎組與糖尿病組大鼠TLR-4、NF-κB、IκBα、p-IκBα 蛋白表達水平比較（±s）

表6 糖尿病合并牙周炎組與糖尿病組大鼠TLR-4、NF-κB、IκBα、p-IκBα 蛋白表達水平比較（±s）

組別 TLR-4 NF-κB IκBα p-IκBα糖尿病組（n ＝15） 23.35±2.18 0.23±0.15 0.63±0.02 0.53±0.01糖尿病合并牙周炎組（n ＝15） 26.29±3.09 0.35±0.16 0.61±0.01 0.56±0.02 t 值 3.011 2.119 3.464 5.196 P 值 0.006 0.043 0.002 ＜0.001

3 討論

糖尿病已成為全世界最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，而牙周炎不但是糖尿病重要的并發(fā)癥，且有研究顯示，糖尿病與牙周炎的發(fā)生和進展增加有關(guān)，牙周感染與糖尿病患者的血糖控制較差有關(guān)，兩者呈互相促進作用[5-6]。為了探討牙周炎通過TLR4/NF-κB 通路促進2 型糖尿病的機制，本研究采用動物模型進行探討，這主要是因大鼠在牙周解剖、牙菌斑的形成和組成、牙周病變的組織病理學(xué)和基本免疫生物學(xué)方面與人類有許多類似之處，因此牙周疾病的研究結(jié)果外推至人群可信。

本研究中糖尿病組大鼠主要表現(xiàn)出氣陰兩虛型、陰虛熱盛型、痰濕內(nèi)阻型、瘀血停滯型和陰陽兩虛型，糖尿病合并牙周炎組大鼠主要表現(xiàn)出氣陰兩虛型、陰虛熱盛型、痰濕內(nèi)阻型、瘀血停滯型，且糖尿病合并牙周炎組大鼠瘀血停滯型和陰虛熱盛型比例呈現(xiàn)上升趨勢，印證了中醫(yī)病機階段性演變規(guī)律，則表現(xiàn)為中醫(yī)氣陰兩虛證→氣陰兩虛兼痰濁證→氣陰兩虛兼痰濁、血瘀證的變化[7]。

本研究結(jié)果顯示，兩組大鼠FPG、TC、TG、LDL、HDL、全血低切黏度、全血中切黏度、全血高切黏度、血漿黏度、纖維蛋白原、CRP、IL-1、IL-6、TNF-α、TLR-4、NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA 表達水平和TLR-4、NFκB、IκBα、p-IκBα 蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示兩組大鼠不但血糖異常，且血脂紊亂，而導(dǎo)致糖尿病大鼠全血黏稠度增加，導(dǎo)致IκB 激酶磷酸化，從而引起大量的IκBα 降解和NF-κB 激活，因此本研究糖尿病合并牙周炎組NF-κB 水平增加，IκBα 水平降低。研究顯示，磷酸化的IκB 激酶與TC、TG 和LDL 含量呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)，與HDL 呈負(fù)相關(guān)，提示高血糖引起的脂代謝異?？赡軈⑴cIκBα 的降解和NF-κB 的活化[8]。糖尿病的發(fā)生是炎癥反應(yīng)的結(jié)果，因此如CRP、IL-1、IL-6、TNF-α 等各類炎癥因子水平均有所升高。各類炎癥因子是炎性反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的中心介質(zhì)，研究顯示其均能通過各種通路上調(diào)NF-κB 或IκBα 的降解，加速毛細(xì)血管周細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，使無細(xì)胞的毛細(xì)血管比例增加，加重糖尿病的發(fā)生及損失，因此其含量越高患者的內(nèi)皮損傷越嚴(yán)重，最終使CRP、IL-1、IL-6、TNF-α 水平更高，各種炎癥因子又通過趨化、活化淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生免疫損傷，同時作用于胰島細(xì)胞或微血管等導(dǎo)致組織損失，致病情越加嚴(yán)重[9]。

TLR4/NF-κB 主要在機體外源性和內(nèi)源性免疫應(yīng)答中通過致炎機制而發(fā)揮臨床作用。本研究發(fā)現(xiàn)TLR4 表達增加，TLR4 的胞外富含亮氨酸的重復(fù)基序識別相應(yīng)的病原相關(guān)分子模式（pathogenassociated molecular patterns，PAMP）或損傷相關(guān)分子模式（damage-associatedmolecular pattern，DAMP）形成二聚體后通過含Toll/IL-1 受體結(jié)構(gòu)域（Toll/IL-1 receptor homologousregion，TIR）的連接蛋白與髓樣分化蛋白88 相結(jié)合，繼而活化后募集IL-1 受體相關(guān)激酶，同時可募集腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6，經(jīng)泛素化作用使由轉(zhuǎn)化生長因子-β 激活性激酶1（TGF-betaactivated kinase 1，TAK1）和TAK1 結(jié)合蛋白組成的復(fù)合體活化。TAK1 蛋白復(fù)合體可磷酸化IκB 激酶復(fù)合體，繼而執(zhí)行NF-κB 抑制劑激酶的功能，介導(dǎo)NF-κB 抑制劑發(fā)生泛素化、磷酸化降解[10]。NF-κB 轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞核，并與特定的基因位點結(jié)合，從而促使目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄、釋放下游的細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1。研究顯示[11]，采用人牙周膜成纖維細(xì)胞模擬牙周炎發(fā)生發(fā)展過程，顯示經(jīng)脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）處理后NF-κB、TNF-α 和IL-1β 的mRNA 和蛋白表達增高，與本研究類似。TLR4能夠識別因創(chuàng)傷和炎癥產(chǎn)生CRP 等作用發(fā)揮級聯(lián)反應(yīng)進而產(chǎn)生炎癥因子而參與機體炎癥作用。動物研究報道顯示，TLR4 可在牙周炎的牙齦組織中檢測出，小鼠成骨細(xì)胞在LPS 刺激后數(shù)量減少，活力降低，但TLR4 和NF-κB 的mRNA 含量可顯著升高[12]。NF-κB 受上游信號（如IκB激酶）激活，進而使血清中TNF-α、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等水平升高，最終反饋調(diào)節(jié)、提高NF-κB 的活化能力，其一旦活化后，該信號通路可誘導(dǎo)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞增殖分化，調(diào)控成骨分化信號通路和骨基質(zhì)的形成以實現(xiàn)對骨發(fā)育、骨改建的調(diào)節(jié)，同時可促使破骨細(xì)胞生成增多并加強其活性從而使牙槽骨吸收，從而誘導(dǎo)牙周炎發(fā)生[13-14]。

綜上所述，牙周炎可通過TLR4/NF-κB 信號通路參與糖尿病發(fā)生發(fā)展；本實驗結(jié)果顯示，糖尿病合并牙周炎大鼠氣陰兩虛型和陰虛熱盛型比例呈現(xiàn)上升趨勢，表明氣陰兩虛證→氣陰兩虛兼痰濁證→氣陰兩虛兼痰濁、血瘀證的中醫(yī)病機階段性演變。基于TLR4/NF-κB 通路對牙周炎與糖尿病相互作用的病理機制分析，進而加強對糖尿病患者的牙周管理、對癥治療、指導(dǎo)口腔衛(wèi)生等干預(yù)措施，從而有效預(yù)防及聯(lián)合治療糖尿病牙周炎。