GelMA的合成、表征及在3D生物打印領(lǐng)域的研究進(jìn)展

夏培斌，余劉洋，王超威，閆立論，劉志遠(yuǎn)，張 鐳，程 杰，崔景強(qiáng)

（1.河南省醫(yī)用高分子材料技術(shù)與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 長(zhǎng)垣 453400；2. 河南駝人醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司，河南 長(zhǎng)垣 453400；3.甘肅省醫(yī)療器械檢驗(yàn)檢測(cè)所，甘肅 蘭州 730070）

3D生物打印是生物制造、添加劑制造、組織工程和再生醫(yī)學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物。使用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件，使用機(jī)器人計(jì)算機(jī)輔助制造過(guò)程堆疊和組裝連續(xù)的生物和/或非生物材料層來(lái)設(shè)計(jì)并生產(chǎn)活的3D結(jié)構(gòu)，目的是人工開(kāi)發(fā)活組織和器官的等價(jià)物，以用于組織工程、再生醫(yī)學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和生物學(xué)的研究[1]。

生物墨水在決定生物制造過(guò)程的能力和打印結(jié)構(gòu)的分辨率方面起著關(guān)鍵作用。GelMA具有優(yōu)異的生物相容性、可調(diào)的物理特性以及易于化學(xué)或生物修飾的特性，因此成為制造各種組織或器官生物的生物墨水的一個(gè)有吸引力的選擇。GelMA是一種基于明膠的工程材料，已被證明可用于組織工程、藥物輸送、細(xì)胞培養(yǎng)和3D打印等領(lǐng)域[2]。明膠側(cè)鏈上的大量氨基可被甲基丙烯酸酐（MA）中的甲基丙烯?；〈?，形成改性明膠，該化學(xué)修飾一般只涉及摩爾比不到5%的氨基酸殘基，這意味著大多數(shù)的功能性氨基酸基序不會(huì)受到顯著影響。GelMA不僅保持了良好的生物相容性、較低的免疫原性和促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，而且在光引發(fā)劑的存在下，在紫外光的照射下，具有形成熱穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)的特性。基于GelMA水凝膠的生物墨水，為3D打印組織器官的研究提供了良好的平臺(tái)。

本文總結(jié)了GelMA水凝膠的合成和性能表征，以及其在3D生物打印組織工程領(lǐng)域的研究及應(yīng)用進(jìn)展，以期為GelMA在生物醫(yī)學(xué)3D打印領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 GelMA水凝膠的合成方法

已經(jīng)報(bào)道的制備GelMA的方法，基本都是在Bulcke等[3]首次報(bào)道的方法上進(jìn)行微小改變后的方法（圖1）。合成方法：將明膠加入磷酸鹽緩沖液中，50℃下攪拌至完全溶解，然后以一定的速率加入MA，反應(yīng)3h?；旌先芤河?PBS 稀釋以停止反應(yīng)，透析5～7d，以完全去除具有潛在細(xì)胞毒性的低分子量雜質(zhì)。將透析液冷凍干燥后冷藏待用。調(diào)節(jié)反應(yīng)物中MA的加入量，可以實(shí)現(xiàn)不同程度的甲基丙烯?；〈?。

圖1 GelMA的合成原理（A）及水凝膠的制備（B）[4]Fig.1 Schematic of GelMA (A) and the fabrication of its hydrogels (B）

2 GelMA水凝膠的表征

2.1 取代度

取代度是指官能化氨基與原始可用氨基之間的比率。不同的取代度對(duì)GelMA水凝膠的物理及生物特性都有顯著影響。表征GelMA取代度的方法主要有2種，一種是傳統(tǒng)方法即三硝基苯磺酸（TNBS）法，另一種是1H-NMR法。

TNBS法是用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)標(biāo)記游離氨基的比色法，通過(guò)與已知甘氨酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比較，從而對(duì)游離氨基進(jìn)行定量。1H-NMR法通過(guò)計(jì)算改性氨基與原始氨基的峰面積之比，來(lái)評(píng)估甲基丙烯酰胺改性明膠的取代度。

2.2 相轉(zhuǎn)變溫度

GelMA在應(yīng)用于3D打印組織工程時(shí)，相轉(zhuǎn)變溫度在打印過(guò)程中至關(guān)重要。高于相轉(zhuǎn)變溫度打印，墨水黏度低，在擠壓打印中不成形，只有在低于相轉(zhuǎn)變溫度4℃左右時(shí)，水凝膠經(jīng)擠出剪切后，會(huì)通過(guò)物理交聯(lián)迅速自愈合，再經(jīng)紫外光固化即可具有良好的機(jī)械性能。

2.3 凝膠孔隙率及孔徑

在大多數(shù)應(yīng)用中，水凝膠的基本功能與凝膠內(nèi)的孔隙大小和孔隙分布有關(guān)，材料應(yīng)滿足一定的要求[5]。實(shí)際應(yīng)用中，需要高孔隙率來(lái)支持氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向細(xì)胞擴(kuò)散，并從基質(zhì)中排出代謝廢物。此外，孔隙的相互連通性對(duì)促進(jìn)細(xì)胞遷移和血管生成等也很重要[6]。水凝膠是由親水性聚合物在水中或生物液體中膨脹而形成的交聯(lián)的大分子網(wǎng)絡(luò)，在植入后，水凝膠孔隙可允許局部血管生成，這是血管化組織的關(guān)鍵要求。因此，控制支架孔隙率和孔徑大小在工程組織性能的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。

2.4 黏彈性

生物打印技術(shù)已被用于生產(chǎn)基于GelMA的具有受控結(jié)構(gòu)的3D構(gòu)造，從而應(yīng)用于各種組織工程。在基于擠出的3D生物打印中，應(yīng)該考慮的重要參數(shù)之一是生物墨水的黏度。黏度是生物油墨的基本特性，會(huì)影響印刷質(zhì)量和加工以及細(xì)胞活力[7]，對(duì)印刷適用性和生物功能有很大影響。通常，用于3D生物打印的聚合物溶液應(yīng)該具有高黏度和高觸變指數(shù)，以便在處理后能保持其形狀。

2.5 溶脹性

作為3D生物打印組織工程的支架，印刷膠體構(gòu)造物的相容性在經(jīng)歷冷凍干燥和再膨脹后，不會(huì)表現(xiàn)出明顯的形態(tài)學(xué)變化，這為它們的臨床可譯性提供了新的機(jī)會(huì)?；谒z的生物材料通常面臨與儲(chǔ)存性和滅菌相關(guān)的挑戰(zhàn)，這些挑戰(zhàn)可以通過(guò)將這些材料加工成冷凍干燥的結(jié)構(gòu)來(lái)克服，從而使其能夠“現(xiàn)成”應(yīng)用。

2.6 降解性

不受控制的快速降解是GelMA在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的主要挑戰(zhàn)[8]。組織支架的基本職責(zé)，是在整個(gè)結(jié)構(gòu)的預(yù)期使用壽命內(nèi)保持細(xì)胞增殖和所需的細(xì)胞分布。許多情況下，支架的壽命應(yīng)一直持續(xù)到降解完成。因此，在再生醫(yī)學(xué)水凝膠的設(shè)計(jì)中，一個(gè)要考慮的重要因素，是支架在生物降解和愈合過(guò)程中的功能依賴性在支架和新生組織之間的轉(zhuǎn)變。

2.7 力學(xué)性能

由于不同的自然組織對(duì)機(jī)械應(yīng)力的反應(yīng)不同，理想的植入材料應(yīng)與目標(biāo)組織的力學(xué)性能密切匹配。作為修復(fù)和再生各種器官和組織的材料，GelMA的機(jī)械性能的可調(diào)性至關(guān)重要?；|(zhì)環(huán)境的力學(xué)性能已被證明會(huì)影響細(xì)胞的功能和分化。

3 3D生物打印組織工程的研究進(jìn)展

組織工程提供了巨大的潛力，以克服器官移植短缺和藥物篩選。在研究分子現(xiàn)象時(shí)會(huì)涉及一些生物功能，如組織形態(tài)發(fā)生、傷口愈合、炎癥反應(yīng)等。然而，傳統(tǒng)的微加工技術(shù)無(wú)法創(chuàng)建復(fù)雜的多尺度結(jié)構(gòu)，如血管內(nèi)皮與周?chē)Y(jié)締組織和薄壁細(xì)胞之間的界面[9]等。為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，生物打印成為一種能夠在工程組織構(gòu)建中創(chuàng)建高度有序的三維血管網(wǎng)絡(luò)的技術(shù)，以促進(jìn)氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和廢物的運(yùn)輸。

3.1 血管

由創(chuàng)傷或疾病引起的血管損傷具有嚴(yán)重的發(fā)病和死亡風(fēng)險(xiǎn)。雖然人造血管移植物已成功應(yīng)用于臨床，但它們目前只適用于大直徑血管（6mm）。在世界范圍內(nèi)，小直徑血管的置換仍然面臨著重大的臨床挑戰(zhàn)。

Zhou等人設(shè)計(jì)了一種由明膠甲基丙烯酰（Gel-MA）、聚乙二醇二丙烯酸酯、海藻酸鹽、裂解酶的VSMCs等組成的新型生物墨水，利用先進(jìn)的同軸3d生物繪圖儀平臺(tái)，創(chuàng)建了可仿生2種不同的細(xì)胞層[血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）和血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）]的新型、可調(diào)節(jié)的小直徑血管。分別在血管基質(zhì)和管腔中，對(duì)通常與血管生成現(xiàn)象相關(guān)的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和分化簇31標(biāo)記物進(jìn)行染色，結(jié)果直觀地證實(shí)了細(xì)胞的增殖，并通過(guò)基因分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行了定量驗(yàn)證，結(jié)果表明制備的小直徑血管有良好的新生血管表達(dá)。

Jia等人[10]報(bào)告了一種多功能3D生物打印血管。首先設(shè)計(jì)了一種特殊細(xì)胞響應(yīng)型的生物墨水，該墨水由GelMA、海藻酸鈉及四臂聚（-乙二醇）四丙烯酸酯（PEGTA）組成，與多層同軸擠壓系統(tǒng)結(jié)合使用，可實(shí)現(xiàn)直接3D生物打印。這種混合生物墨水顯示出良好的生物學(xué)特性，支持被包裹的內(nèi)皮細(xì)胞和干細(xì)胞在生物打印結(jié)構(gòu)中的擴(kuò)散和增殖，可促進(jìn)生物相關(guān)的、高度組織的、可灌注血管的形成。這種新型3D生物打印技術(shù)可用于制造可灌注血管，性能優(yōu)于傳統(tǒng)的微制造或犧牲模板方法。

Lee等人[11]提出了一種高度生物相容的重組人彈性蛋白生物墨水，可用于復(fù)雜軟組織的3D生物打印。該生物墨水由GelMA及甲基丙烯酰胺取代的重組人彈性蛋白（MeTro）組成，可在可見(jiàn)光下交聯(lián)。兩種生物聚合物的協(xié)同結(jié)合，使得高分辨率打印具有很大的細(xì)胞活力，打印的心肌細(xì)胞具有內(nèi)皮屏障功能和心肌細(xì)胞的自發(fā)性搏動(dòng)，這是心肌組織在體內(nèi)的重要功能。此外，在皮下移植大鼠體內(nèi)的研究中，打印的結(jié)構(gòu)引起最小的炎癥反應(yīng)，并被證明在體內(nèi)可有效地生物降解。

3.2 仿生器官

隨著人口老齡化的加速，移植器官的來(lái)源不足已經(jīng)成為一項(xiàng)亟需解決的社會(huì)問(wèn)題，生物3D打印是解決該問(wèn)題的最佳途徑。在政策與資本的推動(dòng)下，3D打印技術(shù)得到蓬勃發(fā)展，但是受限于生物材料技術(shù)的發(fā)展，生物活性仿生組織器官3D打印技術(shù)的發(fā)展遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后。通過(guò)一種快速和直接的方法，發(fā)展具有血管網(wǎng)絡(luò)的工程組織或器官是組織再生的一個(gè)重要方向。近幾年，大尺寸器官的體外重建及長(zhǎng)期功能化培養(yǎng)，成為一個(gè)研究重點(diǎn)。總的來(lái)說(shuō)，器官打印及替換是生物3D打印研究的長(zhǎng)期目標(biāo)，需要科研工作者開(kāi)展進(jìn)一步的深入研究。

Mao等人[12]設(shè)計(jì)制造了一種具有內(nèi)齒輪狀結(jié)構(gòu)的新型肝組織，該組織具有更大的體表面積，以促進(jìn)肝臟功能的恢復(fù)。該方法將GelMA與去細(xì)胞化的肝細(xì)胞外基質(zhì)（dECM）結(jié)合，制備了肝臟特異性生物墨水，并將人誘導(dǎo)的肝細(xì)胞（hiHep細(xì)胞）封裝成負(fù)載細(xì)胞的生物墨水，采用基于DLP的生物打印技術(shù)制備了肝臟顯微組織。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在GelMA生物墨水中加入肝臟dECM后，hiHep細(xì)胞在肝臟微組織中可擴(kuò)散得更遠(yuǎn)，具有更好的肝細(xì)胞特異性功能（白蛋白和尿素分泌）。這將是一種潛在的肝組織工程產(chǎn)品，可幫助恢復(fù)肝臟功能。

Marie等人[13]利用GelMA水凝膠，混合Huh7和HepaRG這2個(gè)肝細(xì)胞系，通過(guò)開(kāi)發(fā)的三維擠壓生物打印過(guò)程，打印了一個(gè)復(fù)雜的肝臟模型。打印的結(jié)構(gòu)顯示了長(zhǎng)期的生存能力（28d）、增殖能力、相關(guān)的肝細(xì)胞表型和功能，與使用標(biāo)準(zhǔn)DMSO處理的2D結(jié)構(gòu)性能相當(dāng)或更好。

3.3 皮膚修復(fù)

對(duì)于現(xiàn)有的生物打印技術(shù)來(lái)說(shuō)，制造適合移植的器官仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，原因主要是無(wú)法再現(xiàn)器官?gòu)?fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)、機(jī)械特性和生物功能。全層皮膚缺損的治療在臨床中仍然是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。三維生物打印技術(shù)為制造皮膚替代品提供了一種很有前途的方法。Jin等人[14]成功制備了脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（ADM）和GelMA的生物墨水，并提出了一種新的3D結(jié)構(gòu)以模擬天然全層皮膚，其中20%的GelMA以HaCaTs為表皮層，1.5%的ADM以成纖維細(xì)胞為真皮層，10%的GelMA mesh以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）為血管網(wǎng)絡(luò)和框架。結(jié)果表明，該3D生物打印功能皮膚模型（FSM）不僅能促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活，還能支持體外表皮重建。在體內(nèi)移植后，F(xiàn)SM可維持細(xì)胞活力至少1周。此外，F(xiàn)SM可促進(jìn)創(chuàng)面愈合和上皮再生，刺激真皮ECM分泌和血管生成，可提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量。

Zhou等人[15]利用新設(shè)計(jì)的基于GelMA水凝膠的仿生生物墨水，以及基于數(shù)字光處理（DLP）的3D打印技術(shù)，開(kāi)發(fā)了一種打印功能性活膚（FLS）的新方法。FLS具有相互連接的微通道，可促進(jìn)細(xì)胞的遷移、增殖和新組織的形成。該生物墨水具有快速的凝膠動(dòng)力學(xué)、可調(diào)諧的力學(xué)性能、良好的生物相容性和組織黏附性。基于DLP的3D打印技術(shù)，提供了一種快速精確定位簇狀人皮膚成纖維細(xì)胞（HSFs）和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的方法，具有較高的細(xì)胞活力，可形成FLS。FLS通過(guò)模擬天然皮膚的生理結(jié)構(gòu)，可促進(jìn)皮膚再生和新生血管的高效形成，并具有較強(qiáng)的機(jī)械和生物黏附性能，易于操作和植入創(chuàng)面。體內(nèi)研究結(jié)果表明，活體皮膚具有即時(shí)防御功能，在促進(jìn)大型動(dòng)物皮膚附肢真皮再生方面具有突出的表現(xiàn)。

4 結(jié)語(yǔ)

GelMA以天然高分子明膠為原料，通過(guò)化學(xué)改性制備。光交聯(lián)甲基丙烯?；〈囊?，使得在光引發(fā)劑存在的情況下，GelMA暴露在光照射下時(shí)可方便和快速地凝膠化。雖然GelMA水凝膠的研究報(bào)道很多，但在臨床應(yīng)用中，保證3D生物打印植入人體后細(xì)胞能增殖分化，仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。此外，GelMA的明膠來(lái)源、合成方法、植入后的安全性評(píng)價(jià)等，仍沒(méi)有健全的標(biāo)準(zhǔn)。展望未來(lái)，隨著研究工作的不斷深入，基于GelMA水凝膠的生物材料一定會(huì)在3D生物打印領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。