基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討石吊蘭治療結(jié)核的作用機(jī)制*

舒燕霞,劉 趣,徐文芬▲,孫慶文,李云超,陳 亮

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025;2貴州中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部,貴州 貴陽(yáng) 550025)

結(jié)核病(Tuberculosis,TB),又被人們俗稱為癆病,是一種由結(jié)核桿菌引起的具有極高傳染性的疾病,已被納入全球十大高感染、高致死率傳染病列表之一[1-2]。自1997年以來(lái),WHO每年都會(huì)發(fā)布一份全球結(jié)核病報(bào)告,據(jù)最新報(bào)告,30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家的新發(fā)病例占全球所有病例的86%,其中我國(guó)的病例數(shù)排名第二,占8.5%,每年死亡率高達(dá)13萬(wàn),遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他感染病數(shù)的總和[3],因此,對(duì)結(jié)核病的治療是我國(guó)乃至全球急需關(guān)注的公共衛(wèi)生和社會(huì)問(wèn)題。目前,結(jié)核病最有效的治療手段為藥物化療,其雖能延緩耐藥菌株的產(chǎn)生和增強(qiáng)病人的依從性,但不足以從根源上阻斷或逆轉(zhuǎn)其病理發(fā)展[4-5]。近年來(lái),隨著中藥及其復(fù)方藥物制劑的深入研究,其多組分、多靶點(diǎn)、協(xié)同效果及毒副作用小等特點(diǎn)已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。石吊蘭,是20世紀(jì)70年代上海武夷地段醫(yī)院為治療淋巴結(jié)核從民間發(fā)掘出來(lái)的中草藥,系苦苣苔科吊石苣苔屬植物吊石苣苔LysionotuspauciflorusMaxim.的干燥地上部分,現(xiàn)為2020版《中國(guó)藥典》一部收載品種,亦為民間常用藥,常用于治療肺結(jié)核、淋巴結(jié)核、慢性支氣管炎、風(fēng)濕疼痛等癥[6-8]。有研究指出,石吊蘭中僅石吊蘭素及其類似物具有抗結(jié)核活性[9-11],可見(jiàn)對(duì)于該藥材抗結(jié)核的活性成分研究較為薄弱。因此,探尋石吊蘭抗結(jié)核的潛在活性成分,并闡明其作用機(jī)制至關(guān)重要。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從整體角度預(yù)測(cè)藥物與疾病之間的相互作用,并探索一種特定治療效果的潛在機(jī)制,這與中醫(yī)藥理論的整體觀念不謀而合。近年來(lái),網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已用于中藥材及復(fù)方制劑活性化合物的篩選、藥物作用機(jī)制及毒理機(jī)制研究[12-15],分子對(duì)接則是通過(guò)受體蛋白與配體藥物分子之間的相互作用來(lái)預(yù)測(cè)其結(jié)合模式和親合力的一種理論模擬方法[16]。鑒于此,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù),從分子水平探討石吊蘭抗結(jié)核的有效成分,預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路,并將篩選出的核心靶點(diǎn)與其活性成分進(jìn)行分子對(duì)接,初步驗(yàn)證該藥材治療結(jié)核的活性成分及作用機(jī)制,為其治療結(jié)核的相關(guān)后續(xù)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 石吊蘭活性成分和相應(yīng)靶點(diǎn)的收集與篩選

通過(guò)中國(guó)知網(wǎng)(CNKI,https://www.cnki.net/)、萬(wàn)方(https://www.wanfangdata.com.cn/ index.html)、PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)等數(shù)據(jù)庫(kù)搜集石吊蘭的化學(xué)成分。根據(jù)搜集到的化學(xué)成分,在InDraw編輯器中畫出成分結(jié)構(gòu)式,或借助PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取其SMILES式,根據(jù)Swiss ADME(http://www.swissadme.ch/)數(shù)據(jù)庫(kù),以胃腸道吸收(GI)的設(shè)置為“High”,類藥性(DL)滿足五個(gè)原則Lipinski[17]、Ghose[18]、Veber[19]、Egan[20]、Muegge[21]中的任意兩個(gè)及兩個(gè)以上為標(biāo)準(zhǔn)篩選石吊蘭潛在活性成分。利用Swiss Target Prediction(http:swisstar-getprediction.ch/)服務(wù)器,以Probability>0為篩選條件,結(jié)合SEA Search Server(https://sea.bkslab.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取活性成分的相關(guān)靶點(diǎn),再通過(guò)Uniprot(https://www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫(kù)獲取靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)的基因,去重后即得石吊蘭活性成分的靶點(diǎn)基因。

1.2 結(jié)核相關(guān)靶點(diǎn)基因的篩選

以“tuberculosis”“l(fā)ymphatic tuberculosis”為檢索詞,挖掘GeneCards(https://www.genecards.org)數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM(http://www.omim.org)數(shù)據(jù)庫(kù)中結(jié)核的疾病靶點(diǎn)基因,并進(jìn)入Drugbank(https://www.drugbank.ca)數(shù)據(jù)庫(kù)尋找臨床一線西藥治療結(jié)核的作用靶點(diǎn)。在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)中,relevance score值越高則代表該靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系越密切,由于靶點(diǎn)過(guò)多,則設(shè)定relevance score大于其中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為結(jié)核的潛在靶點(diǎn),合并3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn),刪除重復(fù)值即得結(jié)核疾病靶點(diǎn)庫(kù)。

1.3 藥物-疾病交集靶點(diǎn)的獲取

將石吊蘭活性成分靶點(diǎn)和結(jié)核疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線作圖工具,繪制交集靶點(diǎn)的韋恩圖,得到成分-疾病交集靶點(diǎn)基因。

1.4 “藥物-成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

對(duì)“1.1項(xiàng)”下的石吊蘭活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)建立網(wǎng)絡(luò)文件,并編輯其屬性文件。將兩個(gè)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件中,構(gòu)建“藥物-成分-交集靶點(diǎn)”可視化網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖的節(jié)點(diǎn)(node)分別為藥物、成分、靶點(diǎn),各節(jié)點(diǎn)之間的相互關(guān)系以邊(edge)表示。

1.5 蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選

將“1.3項(xiàng)”交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String(https://string-db.org)數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)定物種(Organism)為“Homo sapiens”,選擇中等置信度(medium confidence)為“0.400”,即獲得PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。在“Exports”中下載tsv.格式文件,將其導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件,應(yīng)用插件CytoNCA對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析,根據(jù)網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)連接度(Degree)、介度(Betweenness)及緊密度(Closenesss)的參數(shù)進(jìn)行篩選,第1次以Degree大于等于中位數(shù)為篩選條件,第2次則以Degree、Betweenness、Closenesss均大于等于其中位數(shù)進(jìn)行篩選,合并并刪除重復(fù)項(xiàng)后即得核心靶點(diǎn),并根據(jù)Degree值調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)大小和顏色深淺,繪制其網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.6 GO功能與KEGG通路富集分析

Metascape(http://metascape.org/gp/index.html)平臺(tái)擁有全面的注釋功能并且每月更新基因注釋的數(shù)據(jù)資料[22]。將石吊蘭治療結(jié)核的靶點(diǎn)錄入Metascape平臺(tái),設(shè)置P<0.05,對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析,根據(jù)P-value值篩選其主要的信號(hào)通路及生物學(xué)過(guò)程,再采用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)平臺(tái)對(duì)前10條功能注釋目錄和前20條信號(hào)通路目錄進(jìn)行可視化。

1.7 “活性成分-結(jié)核靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“1.6項(xiàng)”KEGG的前20條信號(hào)通路所富集的靶點(diǎn)分別與“1.1項(xiàng)”石吊蘭各活性成分的靶點(diǎn)進(jìn)行交集,各交集靶點(diǎn)合并,刪除重復(fù)項(xiàng),建立網(wǎng)絡(luò)文件,編輯其屬性文件。將兩個(gè)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件中,構(gòu)建“活性成分-結(jié)核靶點(diǎn)-信號(hào)通路”的可視化網(wǎng)絡(luò)。

1.8 “活性成分-核心靶點(diǎn)”分子對(duì)接驗(yàn)證

在Zinc(http://zinc.docking.org/substances/home/)、PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取配體活性成分3D結(jié)構(gòu)的mol 2或sdf.格式文件,通過(guò)Open Babel 3.1.1軟件將小分子的sdf.格式轉(zhuǎn)化為mol 2格式。在PDB(https://www.rcsb.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載靶蛋白3D結(jié)構(gòu)的pdb.格式,通過(guò)PyMOL 2.4.1軟件將蛋白質(zhì)中水分子和非活性配體移除,并將結(jié)果導(dǎo)入到AutoDock Tools 1.5.7軟件進(jìn)行加氫、加電荷、檢測(cè)配體分子的中心節(jié)點(diǎn)以及進(jìn)行可旋轉(zhuǎn)鍵的搜尋與定義,輸出為pdbqt.格式。在Grid模塊設(shè)置對(duì)接搜索空間,通過(guò)Autodock vina運(yùn)行對(duì)接過(guò)程,結(jié)合能Affinity<0表明受體和配體具有自發(fā)結(jié)合潛力,Affinity≤-5.0 kcal·mol-1說(shuō)明成分與靶點(diǎn)對(duì)接效果較好,且其值越小兩者的結(jié)合活性越高[23-24],最后利用PyMOL 2.4.1軟件將對(duì)接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 石吊蘭活性成分及靶點(diǎn)基因的獲取

將石吊蘭所含的化學(xué)成分,經(jīng)Swiss ADME數(shù)據(jù)庫(kù),以胃腸道吸收(GI)為“High”,類藥性(DL)滿足五個(gè)原則Lipinski[17]、Ghose[18]、Veber[19]、Egan[20]、Muegge[21]中的任意兩個(gè)及兩個(gè)以上為篩選條件,共獲得25種潛在活性成分,包括石吊蘭素、去甲基蘇打基亭、香草酸、咖啡酸、槲皮素等,另有5種苯乙醇苷類成分有潛在活性[25-26],一并納入分析,見(jiàn)表1。將此30個(gè)成分依次導(dǎo)入Swiss Target Prediction服務(wù)器,以Probability>0為指標(biāo),結(jié)合SEA Search Server數(shù)據(jù)庫(kù)獲取成分靶點(diǎn),合并后刪除重復(fù)值,共得到510個(gè)靶點(diǎn)。

表1 石吊蘭藥材中潛在活性成分

2.2 結(jié)核相關(guān)靶點(diǎn)與交集靶點(diǎn)的獲取

從Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得結(jié)核靶點(diǎn)677個(gè)(relevance score≥2.65)、淋巴結(jié)核靶點(diǎn)652個(gè)(relevance score≥2.26),將上述靶點(diǎn)進(jìn)行合并,刪去重復(fù)項(xiàng),即得與結(jié)核相關(guān)的Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)。在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中得到結(jié)核靶點(diǎn)104個(gè)、淋巴結(jié)核177個(gè),合并兩組靶點(diǎn)后刪去重復(fù)值,得到210個(gè)結(jié)核相關(guān)靶點(diǎn)。整合兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)疾病靶點(diǎn),并結(jié)合Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn),合并后刪除重復(fù)值,最終得到1050個(gè)結(jié)核相關(guān)靶點(diǎn)。將1050個(gè)疾病靶點(diǎn)與510個(gè)藥物靶點(diǎn)通過(guò)Venny 2.1.0網(wǎng)站在線分析,獲得119個(gè)交集靶點(diǎn),見(jiàn)圖1。

圖1 藥物-疾病交集靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

選擇石吊蘭的30個(gè)活性成分和119個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件,根據(jù)Degree值調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)大小,構(gòu)建“藥物-成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),見(jiàn)圖2,具體的關(guān)鍵成分信息見(jiàn)表2;圖2中共150個(gè)節(jié)點(diǎn),457條邊代表該藥材活性成分與靶點(diǎn)之間的相互作用,活性成分節(jié)點(diǎn)越大,表明該成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)越多、靶點(diǎn)與成分之間的相互作用越強(qiáng)、成分越核心,體現(xiàn)了石吊蘭多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

“V”字形:石吊蘭;菱形:活性成分;圓形:成分靶點(diǎn)。

表2 “藥物-活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中30個(gè)潛在活性成分信息

表3 石吊蘭治療結(jié)核的KEGG富集分析結(jié)果(前20名)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選

將119個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)置中等置信度(medium confidence)為“0.400”,即得PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖,見(jiàn)圖3;網(wǎng)絡(luò)包含119個(gè)節(jié)點(diǎn)、1684條邊、平均節(jié)點(diǎn)度值為28.3,節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn),邊代表蛋白間的相互作用,邊越多表示靶點(diǎn)間相互作用越強(qiáng)、關(guān)聯(lián)度越大。將PPI的tsv.格式文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件,應(yīng)用插件CytoNCA對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析,根據(jù)119個(gè)靶點(diǎn)的Degree,計(jì)算119個(gè)Degree的中位數(shù)為25,第1次以Degree≥25為篩選條件得到59個(gè)靶點(diǎn);計(jì)算所篩選出的59個(gè)靶點(diǎn)的Degree、Betweenness、Closenesss的中位數(shù)分別為37、95.0575、0.5856,第2次分別以Degree、Betweenness、Closenesss大于等于其中位數(shù)為條件進(jìn)行篩選,分別得到34、26、30個(gè)靶點(diǎn),合并刪除重復(fù)項(xiàng)后共得到36個(gè)核心靶點(diǎn)。利用Cytoscape 3.9.1軟件繪制其相互作用網(wǎng)絡(luò),設(shè)置節(jié)點(diǎn)的大小和顏色反映度值的大小,節(jié)點(diǎn)越大、顏色越紅,所對(duì)應(yīng)的度值越大;邊的粗細(xì)反映結(jié)合率評(píng)分的高低,邊越粗,其結(jié)合率的評(píng)分就越高,見(jiàn)圖4。可以推測(cè),石吊蘭藥材可能是通過(guò)MAPK1、STAT3、CASP3、TNF、SRC等靶點(diǎn)發(fā)揮治療結(jié)核作用的。

圖3 石吊蘭成分靶點(diǎn)-結(jié)核靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 石吊蘭36個(gè)核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能與KEGG通路富集分析

利用Metascape數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)石吊蘭治療結(jié)核的119個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG信號(hào)通路分析(P<0.05),其中GO富集分析包括353條生物過(guò)程(biological process,BP),涉及對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)(response to molecule of bacterial origin)、脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、激酶活性的正調(diào)控過(guò)程(positive regulation of kinase activity)等;114條分子功能(molecular function,MF)主要與蛋白激酶活性(protein kinase activity)、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、醇基為受體(phosphotransferase activity,alcohol group as acceptor)、激酶活性(kinase activity)等相關(guān);91條細(xì)胞組分(cellular component,CC)主要涉及囊泡腔(vesicle lumen)、裂解液泡(lytic vacuole)、溶酶體(lysosome)等。將GO富集分析結(jié)果按P值由小到大排序,選取P值最小的前10名,借助微生信在線工具對(duì)其進(jìn)行可視化,見(jiàn)圖5。由結(jié)果可以推測(cè)多個(gè)靶點(diǎn)的功能與結(jié)核的產(chǎn)生密不可分。

圖5 石吊蘭抗結(jié)核靶點(diǎn)的GO富集分析

KEGG通路分析共獲得156個(gè)條目,結(jié)果表明,基因主要富集于癌癥通路(Pathways in cancer)、甲型流感(Influenza A)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、乙型肝炎(Hepatitis B)、結(jié)核(Tuberculosis)等通路,根據(jù)P-value<0.05篩選出前20條通路,利用微生信平臺(tái)繪制其氣泡圖,見(jiàn)圖6。橫坐標(biāo)為通路基因所占總輸入基因的比率(gene ratio),縱坐標(biāo)為通路名稱,氣泡顏色由淺到深代表P-value值從大到小,P-value越小,差異越顯著;氣泡越大代表該通路的基因數(shù)(Count)越多,故氣泡圖中橫坐標(biāo)較大的大圓點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的通路為與結(jié)核靶點(diǎn)相關(guān)性較強(qiáng)的通路,提示石吊蘭的有效成分可能通過(guò)作用于該靶點(diǎn)、參與多個(gè)通路來(lái)達(dá)到調(diào)治結(jié)核的目的。

圖6 石吊蘭治療結(jié)核靶點(diǎn)KEGG信號(hào)通路分析(前20名)

2.6 “石吊蘭活性成分-結(jié)核靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.9.1軟件,將“2.5項(xiàng)”KEGG分析的前20條信號(hào)通路所富集的靶點(diǎn)分別與“2.1項(xiàng)”石吊蘭各活性成分的靶點(diǎn)進(jìn)行交集,構(gòu)建“石吊蘭活性成分-結(jié)核靶點(diǎn)-信號(hào)通路”網(wǎng)絡(luò),根據(jù)Degree值調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)大小,Degree值越大節(jié)點(diǎn)越大,其對(duì)結(jié)核疾病的影響也就越大,見(jiàn)圖7。圖中包括123個(gè)節(jié)點(diǎn)、684條邊,由圖可知,石吊蘭治療結(jié)核是通過(guò)該藥材中的30個(gè)活性成分作用于20個(gè)主要通路和73個(gè)靶點(diǎn)基因的結(jié)果。

菱形:活性成分;圓形:結(jié)核靶點(diǎn);“V”字形:信號(hào)通路。

2.7 “活性成分-核心靶點(diǎn)”分子對(duì)接驗(yàn)證

根據(jù)圖4所得的36個(gè)核心靶點(diǎn),選擇節(jié)點(diǎn)相對(duì)較大、顏色較深,且邊較粗的前5個(gè)核心靶點(diǎn)(STAT3、MAPK1、AKT1、SRC和TNF)作為受體蛋白,因其相互作用力較強(qiáng)、結(jié)合率的評(píng)分較高,故擇之。將石吊蘭30個(gè)活性化合物分別與該 5個(gè)核心靶點(diǎn)STAT3(PBD ID:5e1e)、MAPK1(PBD ID:4qte)、AKT1(PBD ID:3os5)、SRC(PBD ID:2pfh)、TNF(PBD ID:6q01)進(jìn)行分子對(duì)接,最終得到150組活性成分-核心靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果,將其結(jié)合能(Affinity)導(dǎo)入GraphPad Prism 8.0.1軟件進(jìn)行熱圖分析,見(jiàn)圖8。成分與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能和形成氫鍵的數(shù)量是評(píng)價(jià)分子對(duì)接結(jié)果的重要依據(jù),一般認(rèn)為結(jié)合能Affinity<0表明受體和配體具有自發(fā)結(jié)合潛力,且結(jié)合能越低、氫鍵數(shù)量越多,結(jié)合構(gòu)象就越穩(wěn)定,靶點(diǎn)與分子作用的可能性就越大[27]。由熱圖可知,150組石吊蘭活性成分-核心靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)合能Affinity均<-5.0 kcal·mol-1,表明本研究中所預(yù)測(cè)的活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間具有較強(qiáng)的結(jié)合能力,初步驗(yàn)證了該活性成分與核心靶點(diǎn)可能是石吊蘭治療結(jié)核的主要作用靶點(diǎn)。

圖8 分子對(duì)接結(jié)果熱圖

利用PyMol 2.4.1軟件,將“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中度值排名前6的活性成分分別與5個(gè)核心靶點(diǎn)對(duì)接的結(jié)果進(jìn)行可視化,部分對(duì)接模式見(jiàn)圖9。氫鍵是促使配體結(jié)合到活性位點(diǎn)的主要作用力[28]。如圖所示,活性成分石吊蘭素可與蛋白AKT1(PBD ID:3os5)的活性位點(diǎn)ASN-296、HIS-297、TYR-335形成氫鍵;去甲氧基蘇打基亭可與蛋白TNF(PBD ID:6q01)的活性位點(diǎn)GLY-47、GLN-49、PHE-62、THR-9形成氫鍵;3′,5,7-二羥基-4′,6,8-三甲氧基黃酮可與蛋白STAT3(PBD ID:5e1e)的活性位點(diǎn)ARG-879、ASP-1021形成氫鍵;槲皮素可與蛋白SRC(PBD ID:2pfh)的ARG-296、HIS-163、GLU-193等5個(gè)活性位點(diǎn)形成氫鍵;5,7-二羥基-6,8,4′-三甲氧基黃酮醇可與蛋白STAT3(PBD ID:5e1e)的活性位點(diǎn)ARG-879、LEU-959、ASP-1021形成氫鍵;而5,7,3′,4′-四羥基-6,8-二甲氧基黃酮?jiǎng)t與蛋白MAPK1(PBD ID:4qte)的活性位點(diǎn)LYS-54、MET-108形成氫鍵;且上述對(duì)接結(jié)合能均<-8.0 kcal·mol-1,表明其結(jié)合構(gòu)象較穩(wěn)定,結(jié)合能力較強(qiáng)。

圖9 “核心成分-核心靶點(diǎn)”分子對(duì)接模式圖

3 討論

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選石吊蘭藥材中抗結(jié)核的活性成分,探討其作用靶點(diǎn)、相關(guān)信號(hào)通路及抗結(jié)核的作用機(jī)制,并對(duì)其活性成分與相關(guān)核心靶點(diǎn)進(jìn)行了分子對(duì)接。結(jié)果根據(jù)類藥性五原則篩選獲得石吊蘭素、去甲氧基蘇打基亭、3′,5,7-二羥基-4′,6,8-三甲氧基黃酮、槲皮素、5,7-二羥基-6,8,4′-三甲氧基黃酮醇、5,7,3′,4′-四羥基-6,8-二甲氧基黃酮等30個(gè)潛在的活性成分。其中,石吊蘭素經(jīng)體外試驗(yàn)研究表明,給藥量為20 mg·mL-1時(shí)有顯著抗結(jié)核桿菌作用,且無(wú)明顯的毒副反應(yīng),臨床上常用于輔助治療淋巴結(jié)核、肺結(jié)核、骨結(jié)核等[9-11,29]。槲皮素能影響細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)揮抗菌作用,還可通過(guò)抑制菌體細(xì)胞核酸合成、結(jié)合DNA妨礙轉(zhuǎn)錄過(guò)程的正常進(jìn)行而發(fā)揮抑菌作用[30-31]。而去甲氧基蘇打基亭、3′,5,7-二羥基-4′,6,8-三甲氧基黃酮、5,7-二羥基-6,8,4′-三甲氧基黃酮醇等成分的抗結(jié)核作用需進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)外驗(yàn)證分析。

本研究共獲得石吊蘭活性成分-結(jié)核靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)119個(gè),在核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)中,Degree值較大的有STAT3(信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3)、MAPK1(絲裂原活化蛋白激酶1)、AKT1(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1)、TNF(腫瘤壞死因子)、SRC(類固醇受體輔助活化因子)等靶點(diǎn),這些靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間相互作用力強(qiáng),具有豐富的關(guān)聯(lián)性,是疾病發(fā)生發(fā)展的橋梁,可能是石吊蘭抗結(jié)核的主要潛在靶點(diǎn)。結(jié)核主要是由結(jié)核分枝桿菌促使活性氧(ROS)釋放、上調(diào)大量炎癥因子、促進(jìn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、升高氧化應(yīng)激水平等引起的,故抑制炎癥、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化功能可治療結(jié)核[32-33]。STAT3的上游激活因子IL-6可通過(guò)改變STAT3的蛋白質(zhì)構(gòu)象、促進(jìn)其磷酸化,進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路、調(diào)控炎癥細(xì)胞因子表達(dá)來(lái)控制結(jié)核的發(fā)生[34-35]。MAPK1可調(diào)控眾多細(xì)胞代謝過(guò)程如細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等參與免疫反應(yīng),發(fā)揮抗炎、抗菌等作用[36]。AKT1是PI3K/Akt/mTOR通路中重要的下游分子,可參與細(xì)胞因子激活等免疫通路;TNF-α與特異性受體結(jié)合,可激活多條信號(hào)通路,調(diào)控細(xì)胞凋亡或存活、誘發(fā)炎癥等反應(yīng);SRC則能顯著降低THP-1巨噬細(xì)胞中H37Rv水平,促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌多耐藥和泛耐藥菌株的存活[37-39]。

GO功能注釋結(jié)果顯示,從生物過(guò)程富集結(jié)果來(lái)看,石吊蘭抗結(jié)核主要體現(xiàn)為對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)、脂多糖的反應(yīng)、激酶活性的正調(diào)控等過(guò)程;分子功能主要與蛋白激酶活性、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、醇基為受體、激酶活性等相關(guān);細(xì)胞組分則涉及囊泡腔、裂解液泡、溶酶體等。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,石吊蘭抗結(jié)核的主要通路有癌癥通路、甲型流感、糖尿病中AGE-RAGE通路、乙型肝炎通路、結(jié)核通路等。排名較前的即為與該疾病相關(guān)的癌癥、結(jié)核等信號(hào)通路,體現(xiàn)石吊蘭治療結(jié)核具有較強(qiáng)的靶向性。當(dāng)機(jī)體感染流感病毒后,可激活細(xì)胞內(nèi)的PI3K/Akt、MAPK等通路,使其下游分泌TNF-α、IL-17等因子引起炎癥反應(yīng)[40];AGE和RAGE的結(jié)合可使RAGE活化,并通過(guò)p38 Ras及MAP途徑激活下游的NF-κB信號(hào)通路,促進(jìn)IL-2、IL-1β、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌,從而加重機(jī)體炎性反應(yīng)[41];乙型肝炎病毒感染則可誘導(dǎo)TNF-α、IL-1、IL-6等炎性細(xì)胞因子分泌而引起慢性炎癥[42]。

本研究將石吊蘭30個(gè)活性化合物分別與5個(gè)核心靶點(diǎn)STAT3、MAPK1、AKT1、SRC、TNF進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)果顯示,150組配體化合物-受體蛋白對(duì)接結(jié)合能均<-5.0 kcal·mol-1,其中≤-9.0 kcal·mol-1的有51組,占34%,表明本研究中所預(yù)測(cè)的活性成分可與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白穩(wěn)定結(jié)合并發(fā)揮其治療結(jié)核的作用,進(jìn)一步證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性。綜上所述,石吊蘭藥材中的石吊蘭素、去甲氧基蘇打基亭、3′,5,7-二羥基-4′,6,8-三甲氧基黃酮、槲皮素等可通過(guò)作用于STAT3、MAPK1、AKT1、SRC、TNF等靶點(diǎn)基因,進(jìn)而對(duì)癌癥、甲型流感、糖尿病中AGE-RAGE、乙型肝炎等信號(hào)通路產(chǎn)生調(diào)控作用,從而發(fā)揮其對(duì)結(jié)核的治療作用。其作用機(jī)制涉及多個(gè)靶點(diǎn)基因及信號(hào)通路,與中藥多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的治病特點(diǎn)相契合。本課題組將以此結(jié)果為理論基礎(chǔ),對(duì)石吊蘭的活性成分及治療結(jié)核的藥理機(jī)制進(jìn)行深入研究,為該藥材抗結(jié)核的新藥開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供思路和理論依據(jù)。