亞麻木酚素干預(yù)下ApoE基因敲除小鼠肝臟轉(zhuǎn)錄組分析*

謝懿德,楊奕櫻,徐昌君,陳宏宇,胡 碟,胡明補(bǔ),夏一霞,胡英潭,于 瑩

(貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽(yáng) 550025)

高脂血癥(Hyperlipidemia,HLP)是一種脂質(zhì)代謝異常的疾病,是誘發(fā)冠心病、腦血栓、動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素。近年來(lái),臨床上用于治療高脂血癥的藥物主要包括他汀類(lèi)、膽固醇吸收抑制劑、膽酸螯合劑類(lèi)、貝特類(lèi)、煙酸類(lèi)等藥物。雖然這些藥物療效顯著,但已發(fā)現(xiàn)具有一定的不良反應(yīng),如肝腎損傷、橫紋肌溶解、誘發(fā)糖尿病等[1]。越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始關(guān)注臨床療效良好、且不良反應(yīng)小的天然降血脂生物活性物質(zhì),如苦菜黃酮[2]、葡萄多酚[3]、黑木耳多糖[4]、火麻籽多肽[5]、亞麻木酚素[6]等。

亞麻木酚素是一種存在于亞麻籽種皮中的活性物質(zhì),被認(rèn)為是一種植物雌激素,具有多種藥理作用。研究表明,亞麻木酚素在改善高脂血癥方面具有良好的作用。Prasad[7]實(shí)驗(yàn)表明,對(duì)高膽固醇膳食飼養(yǎng)的家兔給予亞麻木酚素干預(yù),明顯降低了血漿中丙二醛、總膽固醇(Total cholesterol,TC)和低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的水平,并增加了高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)的水平。Zhang等[8]以高膽固醇血癥患者為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比亞麻木酚素治療組患者血中甘油三酯(Triglyceride,TG)、TC、HDL-C、LDL-C均顯著降低。Pan等[9]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)12周試驗(yàn)較安慰劑組,每天接受360 mg亞麻木酚素干預(yù)的2型糖尿病患者的TC、LDL-C、HDL-C和血糖均顯著下降。我們前期實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),亞麻木酚素組中HDL-C含量增加,LDL-C、TG、TC含量降低,推測(cè)亞麻木酚素具有一定的調(diào)節(jié)血脂的作用。但關(guān)于亞麻木酚素降血脂的分子機(jī)制研究報(bào)道較少。

肝臟是脂質(zhì)代謝的重要器官,一方面可以通過(guò)極低密度脂蛋白受體攝取富含TG的脂質(zhì)顆粒,另一方面可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上通過(guò)微粒體三酰甘油轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,將PL(Phospholipid,PL)、TC、Apo(Apolipoprotein,Apo)、TG形成極低密度脂蛋白分泌出肝細(xì)胞,從而維持血漿中TG、TC等脂質(zhì)平衡[10]。分析高脂血癥小鼠肝臟中基因表達(dá)的變化對(duì)于研究高脂血癥小鼠血脂變化機(jī)理具有重要作用。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,組學(xué)技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用到人類(lèi)疾病的研究中。哥倫比亞大學(xué)的研究人員[11]基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及組織特異性基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù),有效地提高了罕見(jiàn)遺傳病的檢測(cè)效率。瑞典的研究團(tuán)隊(duì)[12]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)人類(lèi)血細(xì)胞開(kāi)展了全面的表達(dá)分析,有助于人們更好地了解免疫系統(tǒng)疾病。Styrkarsdottir等[13]利用基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),聯(lián)合分析了基因型與髖關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎患病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。組學(xué)技術(shù)使得我們可以在分子水平上獲得大量與疾病相關(guān)的基因,利于疾病分子機(jī)制的研究。

本文利用野生型C57BL/6J小鼠和ApoE-/-高脂血癥小鼠,以亞麻木酚素作為干預(yù)藥物,利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析了亞麻木酚素干預(yù)下高脂血癥小鼠肝臟基因表達(dá)的情況,鑒定了關(guān)鍵差異表達(dá)基因和富集的信號(hào)通路,為深入研究亞麻木酚素改善高脂血癥小鼠的作用機(jī)制提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞麻木酚素(40%),西安圣青生物科技有限公司;高脂飼料(40 kcal 1%脂肪、1.25%膽固醇、0.5%膽酸鈉,貨號(hào)D12109C),重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司;辛伐他汀,上海源葉生物科技有限公司;TRIzol,美國(guó)Invitrogen公司;DNase I,美國(guó)Promega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 2100,美國(guó)安捷倫公司;Illumina HiSeq2000測(cè)序儀,美國(guó)Illumina公司;H1850-R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集

8周齡的野生型C57BL/6J SPF級(jí)雄性小鼠和ApoE-/- SPF級(jí)雄性小鼠購(gòu)買(mǎi)于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào):No.110324210102443554)。分籠喂養(yǎng),自由飲水。普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分成4組:正常對(duì)照組(CG,野生型C57BL/6J小鼠10只),模型組(HG,ApoE-/-小鼠10只),辛伐他汀干預(yù)組(SG,2 mg/kg,ApoE-/-小鼠10只),亞麻木酚素干預(yù)組(FLG,0.6 g/kg,ApoE-/-小鼠10只)。給藥方式采取每天灌胃,正常組給予等容量生理鹽水灌胃。干預(yù)4周后,12 h禁食不禁水。小鼠麻醉后頸椎脫臼處死,解剖后迅速取出肝臟。肝臟裝于EP管中,經(jīng)液氮速凍處理后放置于-80 ℃冰箱保存,以備轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)。

1.3.2 小鼠肝臟RNA提取和轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)測(cè)序

采用TRIzol試劑提取小鼠肝臟總RNA,并用DNase I消化基因組DNA,再使用Oligo(dT)磁珠分離mRNA。將mRNA消化成短片段,以mRNA片段為模板合成cDNA。純化cDNA,進(jìn)行末端修復(fù)和單核苷酸腺嘌呤添加,然后將短片段連接到接頭上。選擇合適大小的片段,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。構(gòu)建好的文庫(kù)用Agilent 2100生物分析儀質(zhì)檢合格后,使用Illumina HiSeq 2000測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序,以上內(nèi)容在深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行。

1.3.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行控制評(píng)估,通過(guò)去接頭、低質(zhì)量數(shù)據(jù)過(guò)濾篩選等步驟,得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)(clean reads)。將clean reads與參考基因組注釋信息(http://www.phytozome.net/)進(jìn)行比對(duì)[14],基因的表達(dá)水平通過(guò)RSEM來(lái)計(jì)算[15]。差異基因的表達(dá)量用DESeq2軟件進(jìn)行計(jì)算,Q值(校正的P值)≤0.05為閾值,將滿足此條件的差異表達(dá)基因DEGs(Differentially expressed genes,DEGs)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)GO(Gene ontology,GO)分類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.geneontology.org/),將DEGs分類(lèi)富集到相應(yīng)的特定生物功能的類(lèi)別中。首先把所有候選基因向GO數(shù)據(jù)庫(kù)的各個(gè)條目映射,計(jì)算每個(gè)條目的基因數(shù),然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn),找出與本物種所有背景基因相比,在候選基因中顯著富集的GO條目。使用R的基礎(chǔ)函數(shù)phyper(https://stat.ethz.ch/R-manual/R-devel/library/stats/html/Hypergeometric.html)計(jì)算P值。然后對(duì)P值進(jìn)行多重檢驗(yàn)較正,校正軟件包是qvalue(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/qvalue.html)。最后以Q值≤0.05為閾值,滿足此條件的GO term定義為在候選基因中顯著富集的GO term。利用KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genome.jp/kegg/)對(duì)DEGs進(jìn)行代謝途徑或信號(hào)通路富集分析[16]。以KEGG Pathway為單位,應(yīng)用超幾何檢驗(yàn),找出與整個(gè)基因組背景相比,在候選基因中顯著性富集的Pathway。該分析與GO功能富集分析使用同樣的方法。最后Q值≤0.05的Pathway定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的Pathway。通過(guò)Pathway顯著性富集能確定候選基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.4 數(shù)據(jù)釋放

本研究結(jié)果的數(shù)據(jù)已提交保存在CNSA(China Nucleotide Sequence Archive ,CNSA)中(https://db.cngb.org/cnsa/),注冊(cè)號(hào)CNP0003322。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)概況

為了研究亞麻木酚素對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝功能的影響,我們利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)各組小鼠肝臟的差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析。構(gòu)建了12個(gè)小鼠肝臟cDNA文庫(kù),利用Illumina HiSeq2000技術(shù)測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估和基礎(chǔ)分析。結(jié)果表明,測(cè)序樣品平均產(chǎn)出6.65G數(shù)據(jù),樣品比對(duì)基因組的平均比對(duì)率為94.64%,比對(duì)到參考基因組唯一位置的比對(duì)率均大于81%,Q20值均大于96%,Q30值均大于91%(表1),這表明測(cè)序的數(shù)量和質(zhì)量達(dá)到了后續(xù)分析的要求。

表1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)過(guò)濾及參考基因組比對(duì)結(jié)果

2.2 差異表達(dá)基因分析

為了進(jìn)一步了解不同小鼠肝臟中差異表達(dá)基因情況,我們分析了不同樣本間顯著差異表達(dá)基因,包括上調(diào)基因和下調(diào)基因,基因差異表達(dá)分析時(shí)以Q值(校正的P值)≤0.05為閾值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明,亞麻木酚素組和模型組之間的DEGs最多,有372個(gè)(234個(gè)上調(diào),138個(gè)下調(diào)),說(shuō)明亞麻木酚素的干預(yù)產(chǎn)生了一定的效果;亞麻木酚素組和辛伐他汀組之間的DEGs最少,只有7個(gè)(4個(gè)上調(diào),3個(gè)下調(diào)),說(shuō)明亞麻木酚素干預(yù)和辛伐他汀干預(yù)效果類(lèi)似(圖1)。

注:X軸代表每組差異比對(duì)方案;Y軸代表相應(yīng)的差異基因(DEGs)數(shù)量;黑色代表上調(diào)的DEGs數(shù),灰色代表下調(diào)的DEGs數(shù)。

為了進(jìn)一步分析亞麻木酚素干預(yù)和辛伐他汀干預(yù)效果的情況,我們將辛伐他汀組/模型組和亞麻木酚素組/模型組的差異表達(dá)基因進(jìn)行了比較分析,列出了兩組間相同的上調(diào)和下調(diào)的前十個(gè)基因(表2)。結(jié)果表明,亞麻木酚素組/模型組差異基因上調(diào)幅度大于辛伐他汀組/模型組,下調(diào)幅度小于辛伐他汀組/模型組。這些共同上調(diào)表達(dá)的差異基因包括羥基-δ-5-類(lèi)固醇脫氫酶(Hydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase,Hsd3b5)、?；o酶A硫代酯酶1(Acyl-CoA thioesterase 1,Acot1)、超長(zhǎng)鏈脂肪酸的伸長(zhǎng)蛋白(Elongation of very long chain fatty acids-like 3,Elovl3)等與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因,說(shuō)明在亞麻木酚素干預(yù)下,小鼠肝臟中與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生了顯著變化。

表2 差異表達(dá)基因列表

2.3 差異表達(dá)基因的GO分類(lèi)及富集分析

利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行亞麻木酚素組和模型組之間差異表達(dá)基因的富集分析,將排名前20的生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能的分組進(jìn)行匯總(圖2)。結(jié)果表明,生物學(xué)過(guò)程的分組包括脂肪酸代謝過(guò)程、脂質(zhì)代謝正調(diào)控、脂質(zhì)生物合成的負(fù)調(diào)控等,細(xì)胞組分的分組包括細(xì)胞外間隙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞器膜等,分子功能的分組包括單加氧酶活性、氧化還原酶活性、類(lèi)固醇羥化酶等。其中與脂質(zhì)代謝相關(guān)的富集分組中的差異表達(dá)基因是我們重點(diǎn)關(guān)注的內(nèi)容。

注:X軸代表候選基因數(shù)目,Y軸代表GO term。

2.4 差異表達(dá)基因的KEGG代謝途徑富集分析

利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行亞麻木酚素組和模型組之間差異表達(dá)基因代謝通路的富集分析,將排名前20的信號(hào)通路進(jìn)行匯總(圖3)。結(jié)果表明,凝血級(jí)聯(lián)途徑、ECM受體互作途徑和PPAR信號(hào)通路是富集差異表達(dá)基因最多的三個(gè)路徑。其中PPAR信號(hào)通路被認(rèn)為與血脂調(diào)節(jié)密切相關(guān),該通路中的差異表達(dá)基因有脂肪酸結(jié)合蛋白(Fatty acid binding protein,Fabp)、細(xì)胞色素P450家族(Cytochrome P450,Cyp)、長(zhǎng)鏈?；o酶A合成酶(Acyl-CoA synthetase long-chain,Acsl)、烯酰輔酶A 水合酶/3-羥?；o酶A脫氫酶(Enoyl-Coenzyme A,hydratase/3-hydroxyacyl Coenzyme A dehydrogenase,Ehhadh)、脂肪酸去飽和酶(Fatty acid desaturase,Fads)、乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶(Acetyl-Coenzyme A acyltransferase,Acaa)、固醇載體蛋白質(zhì)(Sterol carrier protein,Scp)、磷脂轉(zhuǎn)移蛋白(Phospholipid transfer protein,Pltp),這些基因?qū)⑹俏覀兾磥?lái)研究的重點(diǎn)(圖4)。

注:X軸代表富集比例;Y軸代表KEGG Pathway;氣泡的大小表示注釋到某個(gè)KEGG Pathway上的基因數(shù)目;顏色代表富集顯著性值(Qvalue),顏色越深代表顯著性值越小。

圖4 PPAR信號(hào)通路

3 討論與結(jié)論

肝臟在脂質(zhì)代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用,肝臟中關(guān)鍵基因的表達(dá)可以反應(yīng)出脂質(zhì)代謝的情況。轉(zhuǎn)錄組技術(shù)已被廣泛用于研究基因表達(dá)的變化。楊鶴利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析了肝臟中差異表達(dá)基因,以探究薏苡脂的降脂效果[17]。劉浩利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析了金釵石斛總生物堿對(duì)高膽固醇血癥小鼠肝臟脂肪代謝的影響[18]。馬菲菲利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)肝臟的差異表達(dá)進(jìn)行分析,研究了絞股藍(lán)總皂苷治療小鼠高脂血癥過(guò)程中肝臟免疫相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控[19]。本研究對(duì)亞麻木酚素干預(yù)的ApoE-/-小鼠肝臟進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,結(jié)果表明,亞麻木酚素組和模型組之間,共有372個(gè)差異表達(dá)基因,其中包括234個(gè)顯著上調(diào)基因,138個(gè)顯著下調(diào)基因。這些關(guān)鍵的差異基因包括Hsd3b5、Acot1、Elovl3等與脂質(zhì)代謝相關(guān)的基因。GO富集分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集在脂肪酸代謝過(guò)程等生物過(guò)程、細(xì)胞外間隙等細(xì)胞組分以及單加氧酶活性等分子功能。KEGG信號(hào)通路富集分析表明,差異表達(dá)基因在PPAR信號(hào)通路被富集,該通路被認(rèn)為與血脂調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是由脂肪酸及其衍生物激活的核激素受體。PPARs作為脂肪傳感器調(diào)節(jié)脂肪代謝酶的轉(zhuǎn)錄,參與膽固醇的合成與分解、脂肪酸氧化等多種生物學(xué)過(guò)程,調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝及脂肪形成,從而調(diào)節(jié)血脂水平[20]。Tu等研究發(fā)現(xiàn),紅樹(shù)莓提取物通過(guò)激活PPARα通路調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá),從而降低高脂小鼠的血脂水平[21]。蒲施臣[22]研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯通過(guò)PPAR等信號(hào)通路中靶點(diǎn)的基因表達(dá)對(duì)脂質(zhì)代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)。Shi等[23]研究發(fā)現(xiàn),芝麻酚通過(guò)激活PPAR信號(hào)通路顯著上調(diào)了影響脂肪酸氧化、膽固醇流出和分解代謝等相關(guān)基因和蛋白的表達(dá),從而達(dá)到抑制誘導(dǎo)細(xì)胞中脂質(zhì)堆積和肝臟脂肪變性的效果。本研究表明,亞麻木酚素在調(diào)控高脂血癥小鼠血脂水平時(shí),PPAR信號(hào)通路的多個(gè)基因的表達(dá)被激活,如Fabp、Cyp、Acsl、Ehhadh、Fads、Acaa、Scp、Pltp等,推測(cè)亞麻木酚素是通過(guò)PPAR信號(hào)通路調(diào)節(jié)小鼠血脂水平的。

綜上所述,本研究以亞麻木酚素作為干預(yù)藥物,探討了其對(duì)高脂血癥小鼠肝臟差異表達(dá)基因及信號(hào)通路的影響,根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果我們推測(cè)亞麻木酚素可能通過(guò)PPAR信號(hào)通路調(diào)節(jié)小鼠肝臟中脂質(zhì)代謝關(guān)鍵基因,進(jìn)而達(dá)到調(diào)節(jié)血脂的效果。未來(lái)需要進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果,用更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)揭示亞麻木酚素通過(guò)PPAR信號(hào)通路調(diào)節(jié)血脂的分子機(jī)制。