分光光度法測(cè)定竹葉提取物中總黃酮含量的改進(jìn)*

吳 陽(yáng),范秀章,李榮華

(貴州省分析測(cè)試研究院,貴州 貴陽(yáng) 550014)

竹葉為中醫(yī)一味傳統(tǒng)的清熱解毒藥材,在中國(guó)民間廣為使用。近年來(lái)人們圍繞竹葉開展了大量工作,研究表明竹葉提取物中黃酮類化合物藥理活性明顯[1-3]。但針對(duì)竹葉提取物總黃酮含量的實(shí)際檢測(cè)工作中發(fā)現(xiàn)采用的方法存在一些疑問(wèn):

第一,竹葉提取物為混合物,其中含有很多雜質(zhì),檢測(cè)過(guò)程中試劑溶液本身呈黃色(顏色深淺由樣品含量決定),檢測(cè)波長(zhǎng)下有吸收,導(dǎo)致選用硝酸鋁-醋酸鉀顯色體系,測(cè)定結(jié)果偏高;第二,現(xiàn)有黃酮含量測(cè)定方法均以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,但竹葉黃酮中不含蘆丁,其主要成分為碳苷黃酮[4-5],分子量均比蘆丁小,分子結(jié)構(gòu)差異也較大,采用蘆丁作為比較標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果不準(zhǔn)確;第三,在選用現(xiàn)有黃酮測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)[6]如DB 34/T 2743—2016進(jìn)行竹葉黃酮含量測(cè)定過(guò)程中,測(cè)定值比實(shí)際偏低,由于標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好,考慮可能是顯色劑用量不夠,樣品顯色不夠徹底,導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。

本文針對(duì)以上特點(diǎn),選用氫氧化鈉環(huán)境下,氯化鋁-亞硝酸鈉顯色體系,以竹葉黃酮中典型碳苷異葒草苷作為標(biāo)準(zhǔn)品,同時(shí)增加顯色劑用量,對(duì)竹葉提取物中總黃酮含量的測(cè)定作了粗淺的分析與探討。改進(jìn)后的方法提高了結(jié)果的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看到:在濃度0～40 mg/L范圍內(nèi),蘆丁、異葒草苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(r2)分別為0.9999,0.9998,平均加標(biāo)回收率為97.93%、99.65%,RSD為1.35%、0.7%(n=6)。說(shuō)明該改進(jìn)方法滿足檢測(cè)要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘆丁(C27H30O16,CAS號(hào):153-18-4,純度≥99.0%),異葒草苷(C21H20O11)購(gòu)于成都德思特生物科技有限公司,亞硝酸鈉,氯化鋁,氫氧化鈉,實(shí)驗(yàn)試劑為分析純;實(shí)驗(yàn)室用水為 GB/T 6682規(guī)定的三級(jí)水。

實(shí)驗(yàn)用試樣竹葉提取物購(gòu)買于浙江圣氏生物科技有限公司,紫外檢測(cè)總黃酮含量≥ 24.0%。

1.2 儀器與設(shè)備

723S型可見分光光度計(jì),上海棱光技術(shù)有限公司;Agilent1200高效液相色譜儀,美國(guó)安捷倫公司,Agilent XSE205DU型電子天平,梅特勒-托利多;比色管等試驗(yàn)儀器。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

稱取5 g(精確至0.0001 g)樣品粉末于100 ℃烘箱烘至恒重,得出樣品水分。

1.3.2 試劑溶液的制備

亞硝酸鈉溶液(5%):5 g亞硝酸鈉,用水完全溶解定容至100 mL;氯化鋁溶液(10%):10 g氯化鋁,用水?dāng)嚢枞芙舛ㄈ葜?00 mL;氫氧化鈉溶液(4%):4 g氫氧化鈉,用水?dāng)嚢枞芙舛ㄈ葜?00 mL;乙醇溶液(60%):600 mL無(wú)水乙醇加水定容至1 L。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

蘆丁、異葒草苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:分別準(zhǔn)確稱取10 mg(精確到0.1 mg)蘆丁和異葒草苷標(biāo)準(zhǔn)樣品于50 mL容量瓶中,加60%乙醇溶液溶解后,定容至標(biāo)線,搖勻。此溶液中標(biāo)準(zhǔn)樣品含量為200 mg/L,于4 ℃冰箱中避光保存。

1.3.4 蘆丁、異葒草苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:

分別吸取蘆丁、異葒草苷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.0 mL、0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.3 mL、1.5 mL、1.8 mL、2.0 mL于一組10 mL比色管中,加乙醇溶液至總體積為4 mL,加亞硝酸鈉溶液0.3 mL,混勻,靜置8 min;再加入氯化鋁0.8 mL,搖勻,靜置10 min,加入氫氧化鈉4.5 mL,用乙醇溶液定容至刻度,搖勻,靜置10 min。用1 cm比色皿,測(cè)定510 nm波長(zhǎng)處的吸光度。以濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.5 試樣溶液的制備

稱取0.05 g樣品(精確到0.1 mg)于50 mL容量瓶中,用乙醇溶液溶解后,定容至標(biāo)線,搖勻。

1.3.6 試樣的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取0.5 mL待測(cè)液于10 mL比色管中,加乙醇溶液至總體積為4 mL,加亞硝酸鈉溶液0.3 mL,混勻,靜置8 min;再加入氯化鋁0.8 mL,搖勻,靜置10 min,加入氫氧化鈉4.5 mL,用乙醇溶液定容至刻度,搖勻,靜置10 min。用1 cm比色皿,測(cè)定510 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

以未加氫氧化鈉試劑的溶液為空白,測(cè)定其吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總黃酮的濃度。

1.3.7 結(jié)果計(jì)算

竹葉黃酮中總黃酮含量(以干基計(jì)),以百分率表示,按下式計(jì)算:

式中:X—竹葉黃酮中總黃酮的百分含量;c—由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出待測(cè)樣品溶液的總黃酮濃度mg/L;c0—由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的空白溶液的總黃酮濃度(mg/L);10—待測(cè)液稀釋倍數(shù);m—竹葉黃酮的質(zhì)量(g);0.05—竹葉黃酮試樣液總體積(L);H—竹葉黃酮試樣水分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)。

2 結(jié)果分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別測(cè)定蘆丁、異葒草苷系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。兩個(gè)系列標(biāo)準(zhǔn)工作液吸光度值列于表1,線性方程和相關(guān)系數(shù)列于表2。

表1 蘆丁、異葒草苷系列標(biāo)準(zhǔn)工作液測(cè)定結(jié)果

表2 蘆丁、異葒草苷標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程、相關(guān)系數(shù)

結(jié)合表1、表2數(shù)據(jù)可知,將方法改進(jìn)后,兩標(biāo)準(zhǔn)品均線性關(guān)系良好。通常認(rèn)為當(dāng)線性相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.99時(shí),濃度與吸光度之間有顯著的線性相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,兩者線性相關(guān)性皆良好,但從吸光度值看,異葒草苷靈敏度更高。

2.2 方法精密度試驗(yàn)

取同一份制備好的試樣溶液,共6份,分別采用蘆丁、異葒草苷標(biāo)準(zhǔn)曲線,對(duì)竹葉提取物試樣按“1.3.6”方法進(jìn)行顯色操作,測(cè)定其濃度,計(jì)算其黃酮含量與RSD,結(jié)果見表3。

表3 方法精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 加標(biāo)回收試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取竹葉提取物試樣0.0300 g,按“1.3.5”制備試樣溶液,加入質(zhì)量濃度為200 mg/L的蘆丁或異葒草苷標(biāo)準(zhǔn)溶液,按“1.3.6”項(xiàng)的操作方法進(jìn)行顯色,進(jìn)行2個(gè)濃度點(diǎn)的三水平加標(biāo)回收試驗(yàn),測(cè)得總黃酮濃度及回收率,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表4。

表4 樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)

由表4可知,以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),回收率在97% ～ 99.17%之間,平均回收率為97.93%;以異葒草苷為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),回收率在96.90% ～ 104.2%之間,平均回收率為99.65%。表明蘆丁與異葒草苷均可作為標(biāo)準(zhǔn)品,但是異葒草苷準(zhǔn)確度更高。

2.4 高效液相色譜法

稱取購(gòu)買到的竹葉提取物樣品,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)竹葉黃酮的成分分析,采用高效液相色譜儀,對(duì)試樣進(jìn)行11種黃酮類混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量的測(cè)定,并進(jìn)行加和計(jì)算黃酮總量。

由圖1,表5可知,采用高效液相色譜法對(duì)市售竹葉黃酮進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)行加和計(jì)算得到的總黃酮含量為7.3405 mg/g。

圖1 竹葉黃酮中總黃酮高效液相色譜圖

表5 高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果

綜上,試驗(yàn)結(jié)果表明,改進(jìn)后的分光光度法,選用異葒草苷做標(biāo)準(zhǔn)品,其結(jié)果與高效液相色譜法的更接近。

3 結(jié)論

本文對(duì)分光光度法測(cè)定竹葉黃酮含量進(jìn)行了改進(jìn),并與高效液相色譜法結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明,選用異葒草苷作為標(biāo)準(zhǔn)品,加大顯色劑用量,結(jié)果準(zhǔn)確度更高。