仙茅苷調(diào)節(jié)lncRNA MEG3/miR-181a-5p通路對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠成骨細(xì)胞自噬的影響

王勤儉 張睿昕 張攀 李泊泊

河南省中醫(yī)院 河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種系統(tǒng)性骨病,其特征是骨量下降和骨微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞,表現(xiàn)為骨的脆性和骨折的危險(xiǎn)性大大增加,即使是輕微的創(chuàng)傷或無(wú)外傷的情況下也容易發(fā)生骨折[1]。臨床上治療OP的藥物包括雌激素、降鈣素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雙膦酸鹽等,它們大都通過(guò)抑制破骨細(xì)胞活性、阻止骨吸收發(fā)揮治療作用,對(duì)骨形成的作用極小,因此提高成骨細(xì)胞活性、促進(jìn)骨形成是此領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)[2]。仙茅苷(Curculigoside, CUR)是石蒜科仙茅的主要活性成分,屬于苯甲酸酯類衍生物,能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞活性、治療骨質(zhì)疏松[3]。已經(jīng)證明,OP患者長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)MEG3高表達(dá),微小RNA(miR)-181a-5p表達(dá)減少,下調(diào)lncRNA MEG3、上調(diào)miR-181a-5p對(duì)預(yù)防OP和潛在OP風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義[4-5]。CUR是否能調(diào)節(jié)lncRNA MEG3/miR-181a-5p信號(hào)軸影響OP的進(jìn)展尚不清楚。因此,本研究將探究CUR在OP中對(duì)lncRNA MEG3/miR-181a-5p軸的調(diào)節(jié),嘗試為OP的診治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSCs,CP-R131),購(gòu)自普諾賽生物。

1.1.2動(dòng)物:SD雄性大鼠(6～7周齡,(220±25) g),購(gòu)自北京北方艾特生物科技有限公司[SCXK(京)2020-0005],大鼠生活環(huán)境為SPF級(jí)動(dòng)物房,注射、取材等操作遵守實(shí)驗(yàn)室相關(guān)規(guī)定。

1.1.3試劑與儀器:胎牛血清、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒、熒光素酶檢測(cè)試劑、地塞米松、β-甘油磷酸鈉,購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;抗壞血酸、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、堿性磷酸酶(ALP)染色試劑盒、4 %多聚甲醛(PFA)、RIPA裂解液、ECL超敏化學(xué)發(fā)光液、Cy3 IgG二抗(紅色熒光,A0507)、FITC IgG二抗(綠色熒光,A0562),購(gòu)自碧云天生物;一抗微管相關(guān)蛋白1-輕鏈3(LC3,ab192890),自噬效應(yīng)蛋白(Beclin1, ab289864),購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

微型CT掃描儀,購(gòu)自皕赫科學(xué)儀器;CO2培養(yǎng)箱,購(gòu)自德國(guó)Memmert公司;熒光顯微鏡,購(gòu)自日本Keyence公司;電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀,購(gòu)自北京鴻濤基業(yè)科技;Tanon 1600分析儀,購(gòu)自天能集團(tuán)。

1.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.1成骨細(xì)胞分化:復(fù)蘇BM-MSCs細(xì)胞至穩(wěn)定生長(zhǎng),接種至96孔板中,使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含20 mL/L胎牛血清、10-8mol/L地塞米松、50 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μmol/L抗壞血酸、25 μL骨形態(tài)發(fā)生蛋白的DMEM培養(yǎng)基)培養(yǎng)30 d誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化,第15 d、25 d進(jìn)行堿性磷酸酶染色鑒定成骨細(xì)胞,細(xì)胞質(zhì)中有藍(lán)、紫顆粒,提示成骨細(xì)胞分化成功[6]。

1.2.2CUR濃度篩選:將1.2.1分化成功的成骨細(xì)胞接種至96孔板,分別與0、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的CUR共培養(yǎng)72 h[7],按照CCK-8試劑盒要求測(cè)定各組細(xì)胞的吸光度(OD),評(píng)價(jià)增殖活力。

1.2.3檢測(cè)lncRNAMEG3對(duì)miR-181a-5p的轉(zhuǎn)錄調(diào)控:使用Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)lncRNA MEG3基因與miR-181a-5p的結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建lncRNA MEG3野生型質(zhì)粒(lncRNA MEG3-WT)和突變型質(zhì)粒(lncRNA MEG3-MUT),lncRNA MEG3-WT和lncRNA MEG3-MUT分別與miR-181a-5p NC或miR-181a-5p共轉(zhuǎn)染于細(xì)胞,48 h后,使用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,評(píng)價(jià)熒光素酶活性。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染、分組:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成骨細(xì)鋪板至24孔板,融合至60 %時(shí),加入25 μg/mL CUR培養(yǎng)3 h,立即使用Lipofectamine 3000試劑盒分別轉(zhuǎn)染pc-NC、pc-LncRNA MEG3,轉(zhuǎn)染24 h,分別命名為CUR+pc-NC組、CUR+pc-LncRNA MEG3組;只加入25 μg/mL CUR 3 h的組命名為CUR組;加入25 μg/mL CUR 3 h和5 mmol/L 3-MA 1 h的組命名為CUR+3-MA組[8];正常培養(yǎng)的成骨細(xì)胞組命名為NC組,轉(zhuǎn)染48 h后,鑒定轉(zhuǎn)染效率,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5檢測(cè)成骨細(xì)胞中l(wèi)ncRNAMEG3、miR-181a-5p的表達(dá)水平:使用qRT-PCR檢測(cè)mRNA水平。Trizol提取細(xì)胞RNA,反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,根據(jù)PCR試劑盒要求制備反應(yīng)體系:TaqDNA聚合酶1 μL,上、下游引物各2 μL,緩沖液10 μL,dNTP mix 1 μL,cDNA 1 μL,H2O 33 μL。將樣品置于qRT-PCR儀,設(shè)定反應(yīng)程序:預(yù)變性(95 ℃,5 min),變性(95 ℃,30 s),退火(67 ℃,15 s),循環(huán)40次。結(jié)果使用2-△△Ct法統(tǒng)計(jì),并計(jì)算lncRNA MEG3、miR-181a-5p 的相對(duì)表達(dá)量。lncRNA MEG3、miR-181a-5p的引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.6檢測(cè)細(xì)胞ALP活力:按照1.2.3中細(xì)胞分組,誘導(dǎo)分化14 d后,使用ALP染色法評(píng)價(jià)細(xì)胞分化能力。使用多聚甲醛固定細(xì)胞,PBS洗3次,加入BCIP/NBT染液避光孵育0.5 h,蒸餾水洗3次,滴加核固紅染液染色3 min,顯微鏡下觀察,計(jì)算相對(duì)ALP活力。

1.2.7檢測(cè)細(xì)胞自噬體數(shù)量:使用0.25 %胰蛋白酶將1.2.3中細(xì)胞消化1 min,接種至6孔板中。24 h后離心棄去胰蛋白酶消化液,使用洗滌緩沖液使細(xì)胞懸浮,吸取90 μL細(xì)胞懸液并加入10 μL MDC染液孵育0.5 h,離心棄去上清,重新懸浮后滴在載玻片上,使用顯微鏡觀察,藍(lán)色為自噬陽(yáng)性細(xì)胞,自噬陽(yáng)性率%=藍(lán)色染色細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100 %。

1.2.8檢測(cè)細(xì)胞LC3、Beclin1的表達(dá):將1.2.3中細(xì)胞涂布到玻片上,使用多聚甲醛固定15 min,0.5 % Triton X-100通透20 min,封閉30 min,一抗LC3、Beclin1孵育過(guò)夜;二抗避光孵育1 h,最后滴加DAPI染液,封片后在顯微鏡下拍照并分析LC3、Beclin1的表達(dá)。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.1動(dòng)物分組:SD大鼠肌肉注射地塞米松磷酸鈉1 mg/kg,每周2次,持續(xù)8周,建立OP大鼠模型,脛骨近端骨礦物質(zhì)密度(BMD)明顯下降,表示模型建立成功[9]。建模過(guò)程中損失大鼠及時(shí)補(bǔ)充。同時(shí)間同頻次肌肉注射生理鹽水大鼠作為對(duì)照組(CT組)。模型大鼠建立1周后,隨機(jī)分為2組:OP組(灌胃適量生理鹽水,隔天1次)、OP+ CUR組(灌胃15 mg/kg CUR,隔天1次)[10]。CT組處理方式同OP組,每組6只大鼠。技術(shù)路線見(jiàn)圖1。

圖1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線圖Fig.1 Animal testing technology roadmap

1.3.2骨形態(tài)學(xué)分析:給藥結(jié)束后,使用1.5 %戊巴比妥鈉麻醉大鼠,通過(guò)微型CT檢測(cè)脛骨遠(yuǎn)端骨小梁數(shù)(Tb.N)、骨小梁間距(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)。

兩次世界大戰(zhàn)之間，ICMI少有活動(dòng)；1952年ICMI重建后成為國(guó)際數(shù)學(xué)聯(lián)盟（IMU）的分支組織．目前，ICMI有92個(gè)成員國(guó)，包括70個(gè)IMU成員國(guó)和其他以個(gè)案申請(qǐng)并得到批準(zhǔn)參加的成員國(guó)．

1.3.3Westernblot檢測(cè)LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白表達(dá):大鼠保持麻醉狀態(tài),斷頭法處死,取各組脛骨組織,勻漿液一分為二,一份使用Trizol提取組織RNA待測(cè),另一份提取總蛋白,BCA法定量蛋白濃度。在新配置的SDS-PAGE凝膠中上樣各組樣品,經(jīng)過(guò)電泳和轉(zhuǎn)膜,將樣品轉(zhuǎn)至PVDF膜;PVDF膜經(jīng)封閉后在LC3、Beclin1稀釋液(1∶1 000)中過(guò)夜,再使用IgG二抗(1∶2 000)和ECL發(fā)光液孵育,Tanon 1600分析灰度值。

1.3.4檢測(cè)脛骨組織中l(wèi)ncRNA MEG3、miR-181a-5p的表達(dá)水平:取1.3.3中大鼠脛骨組織RNA,按1.2.5中方法檢測(cè)各組lncRNA MEG3、miR-181a-5p的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同濃度CUR對(duì)成骨細(xì)胞增殖活力的影響

與0 μg/mL CUR組比較,25、50、1 000 μg/mL CUR組成骨細(xì)胞增殖活力提高(P< 0. 05)。后續(xù)選擇25 μg/mL劑量的CUR進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)表2。

表2 不同濃度CUR對(duì)成骨細(xì)胞增殖活力的影響

2.2 lncRNA MEG3靶向miR-181a-5p結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)染效率

lncRNA MEG3靶向miR-181a-5p結(jié)合位點(diǎn)見(jiàn)圖2。與mimic NC和lncRNA MEG3-WT共轉(zhuǎn)染組比較,miR-181a-5p mimic和lncRNA MEG3-WT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性降低(P<0.05);與mimic NC和lncRNA MEG3-MUT共轉(zhuǎn)染組比較,miR-181a-5p mimic和lncRNA MEG3-MUT共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

圖2 Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)lncRNA MEG3與miR-181a-5p的結(jié)合位點(diǎn)Fig.2 Starbase database predicts the binding sites of lncRNA MEG3 and miR-181a-5p

表3 熒光素酶活性比較Table 3 Comparison of luciferase

轉(zhuǎn)染效果見(jiàn)圖3。qRT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后,與pc-NC組比較,細(xì)胞中LncRNA MEG3 的相對(duì)表達(dá)水平升高(P< 0.05),miR-181a-5p的相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(P>0.05)。見(jiàn)表4。

圖3 轉(zhuǎn)染后在顯微鏡下的觀察結(jié)果(100×)Fig.3 The results were observed under microscope after transfection(100×)

表4 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中l(wèi)ncRNA MEG3、miR-181a-5p表達(dá)比較

2.3 各組細(xì)胞ALP活性比較

與NC組比較,CUR組細(xì)胞ALP活性提高(P< 0.05);與CUR組比較,CUR+3-MA組細(xì)胞ALP活性下降(P< 0.05);與CUR+pc-NC組比較,CUR+pc-LncRNA MEG3組細(xì)胞ALP活性下降(P< 0.05)。見(jiàn)表5。

表5 各組細(xì)胞ALP活性比較

2.4 各組細(xì)胞自噬陽(yáng)性率比較

與NC組比較,CUR組細(xì)胞自噬陽(yáng)性率提高(P<0.05);與CUR組比較,CUR+3-MA組細(xì)胞自噬陽(yáng)性率下降(P<0.05);與CUR+pc-NC組比較,CUR+pc-LncRNA MEG3組細(xì)胞自噬陽(yáng)性率下降(P<0.05)。見(jiàn)圖4和表6。

圖4 MDC染色檢測(cè)各組細(xì)胞自噬陽(yáng)性率(100×)Fig.4 MDC staining was used to detect the positive rate of autophagy in each group(100×)

表6 各組細(xì)胞自噬陽(yáng)性率比較

2.5 各組細(xì)胞LC3、Beclin1的表達(dá)比較

LC3、Beclin1蛋白表達(dá)細(xì)胞分別被標(biāo)記為綠色、紅色熒光,與NC組比較,CUR組細(xì)胞LC3、Beclin1的表達(dá)升高(P< 0.05);與CUR組比較,CUR+3-MA組細(xì)胞LC3、Beclin1的表達(dá)下降(P< 0.05);與CUR+pc-NC組比較,CUR+pc-LncRNA MEG3組細(xì)胞LC3、Beclin1的表達(dá)下降(P< 0.05)。見(jiàn)圖5、圖6和表7。

圖5 免疫熒光檢測(cè)各組細(xì)胞LC3的表達(dá)(100×)Fig.5 The expression of LC3 in each group was detected by immunofluorescence(100×)

圖6 免疫熒光檢測(cè)各組細(xì)胞Beclin1的表達(dá)(100×)Fig.6 The expression of Beclin1 in each group was detected by immunofluorescence(100×)

表7 各組細(xì)胞LC3、Beclin1的表達(dá)比較Table 7 Comparison of LC3 and Beclin1 expression

2.6 各組大鼠骨形態(tài)學(xué)分析比較

與CT組比較,OP組大鼠Tb.N、Tb.Th降低,Tb.Sp升高(P< 0.05);與OP組比較,OP+CUR組大鼠Tb.N、Tb.Th升高,Tb.Sp降低(P< 0.05)。見(jiàn)表8。

表8 各組大鼠骨形態(tài)學(xué)分析比較Table 8 Comparison of bone morphology

2.7 各組大鼠脛骨LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、LncRNA MEG3、miR-181a-5p的表達(dá)比較

與CT組比較,OP組大鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白及miR-181a-5p表達(dá)水平降低,lncRNA MEG3表達(dá)水平升高(P< 0.05);與OP組比較,OP+CUR組大鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白及miR-181a-5p表達(dá)水平升高,lncRNA MEG3表達(dá)水平降低(P< 0.05)。見(jiàn)圖7和表9。

圖7 各組大鼠脛骨組織蛋白表達(dá)Fig.7 Histamin expression in tibia of rats in each group

表9 各組大鼠脛骨 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、LncRNA MEG3、miR-181a-5p的表達(dá)比較

3 討論

成骨細(xì)胞在骨骼生長(zhǎng)、發(fā)育、重塑過(guò)程中以連接細(xì)胞群的方式發(fā)揮重要作用,它能夠連續(xù)生成新骨、增加骨量,其功能異?？赡芤鸫x性骨病包括OP[11]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),lncRNA MEG3參與多個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化,在骨形成和OP的發(fā)展中充當(dāng)關(guān)鍵介質(zhì)[12]。增加miR-181a-5p的表達(dá)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞分化,減輕OP[13]。探索調(diào)控lncRNA MEG3/miR-181a-5p信號(hào)軸的藥物可能有助于開(kāi)辟治療OP的新路徑。

大量研究證實(shí),CUR通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化,抑制破骨細(xì)胞骨吸收發(fā)揮抗OP的作用[14]。本研究通過(guò)使用梯度濃度的CUR處理BM-MSCs細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)25 μg/mL以上濃度的CUR能夠提高BM-MSCs細(xì)胞的增殖活力,且成骨細(xì)胞分化能力增加;經(jīng)過(guò)CUR處理的OP模型大鼠骨形態(tài)好轉(zhuǎn),說(shuō)明CUR具有治療OP的作用,已前述觀點(diǎn)一致。另外,在lncRNA MEG3過(guò)表達(dá)的成骨細(xì)胞中,其分化能力下降,提示lncRNA MEG3表達(dá)的增加可能促進(jìn)了OP疾病進(jìn)展,但其作用機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

我們也在實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了成骨細(xì)胞和大鼠的自噬相關(guān)指標(biāo)。自噬即細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器包被進(jìn)入囊泡,并與溶酶體融合降解包裹內(nèi)容物的過(guò)程,是維持細(xì)胞本身代謝和細(xì)胞器更新的重要環(huán)節(jié)[15]。Beclin1位于染色體17q21,是哺乳動(dòng)物自噬基因Atg6的同系物,啟動(dòng)自噬進(jìn)程[16]。LC3是自噬過(guò)程標(biāo)志物,它的功能是參與自噬小體的形成,LC3首先裂解成胞質(zhì)形LC3I,然后轉(zhuǎn)移至ATG3以形成膜結(jié)合形式LC3II附著到自噬體的膜上,LC3Ⅱ/Ⅰ升高代表自噬活性增強(qiáng)[17]。此外,抑制成骨細(xì)胞自噬和分化,會(huì)加重OP[18]。本研究中,CUR能夠提高成骨細(xì)胞自噬陽(yáng)性率和LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白的表達(dá),說(shuō)明CUR能提高成骨細(xì)胞自噬活性;在lncRNA MEG3過(guò)表達(dá)的成骨細(xì)胞中,LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白表達(dá)也是下調(diào)的,提示lncRNA MEG3表達(dá)的增加可能是成骨細(xì)胞自噬活性降低的原因之一;此外,OP大鼠脛骨組織LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1蛋白表達(dá)減少,經(jīng)CUR治療能提高自噬蛋白的表達(dá),且lncRNA MEG3表達(dá)下降,miR-181a-5p表達(dá)增加。

本研究使用Starbase數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)LncRNA MEG3作靶基因預(yù)測(cè),我們發(fā)現(xiàn)miR-181a-5p是lncRNA MEG3的一對(duì)潛在靶基因。本研究中,過(guò)表達(dá)lncRNA MEG3可負(fù)向調(diào)控miR-181a-5p表達(dá),抑制成骨細(xì)胞自噬活性,也進(jìn)一步說(shuō)明miR-181a-5p可能與成骨細(xì)胞自噬功能有關(guān)。另外,本研究使用自噬抑制劑3-MA聯(lián)合CUR干預(yù)OP大鼠,發(fā)現(xiàn)3-MA完全逆轉(zhuǎn)了CUR對(duì)OP大鼠的治療作用,進(jìn)一步驗(yàn)證CUR的作用機(jī)制之一是下調(diào)lncRNA MEG3、增加miR-181a-5p的表達(dá)來(lái)增加成骨細(xì)胞自噬活性,從而改善OP進(jìn)展。

綜上所述,CUR可能通過(guò)調(diào)節(jié)lncRNA MEG3/miR-181a-5p信號(hào)軸增加OP大鼠成骨細(xì)胞自噬活性。