貓杯狀病毒的分子鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

馮秋菊，馬 燕，米高權(quán)，馬 俊，白 翠

1.四川省涼山彝族自治州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，四川西昌 615000；2.四川省涼山彝族自治州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局植物檢疫站，四川西昌 615000；3.吉林省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，吉林長(zhǎng)春 130062

貓杯狀病毒（FCV)為全長(zhǎng)7.8 bp 單股正鏈RNA病毒，隸屬于杯狀病毒科，水皰疹病毒屬，主要編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白（ORF1），VP1 主要衣殼蛋白（ORF2），VP2 次要衣殼蛋白（ORF3）[1]。ORF1 編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2 編碼衣殼蛋白，ORF3 編碼一個(gè)較小區(qū)域的蛋白。貓杯狀病毒是一種能引起貓高度接觸性傳染病的病原，貓杯狀病毒感染是貓病毒性呼吸道傳染病，該病是貓科動(dòng)物較為常見的傳染病之一。表現(xiàn)為口腔潰瘍、肢體跛行、舌表面發(fā)生潰爛、流產(chǎn)、呼吸道感染、眼瞼粘連、鼻軟骨變形等癥狀。自然條件下，僅貓科動(dòng)物易感，如貓、虎、獅和獵豹等，常發(fā)于6 ～84 日齡的幼貓。雖然該病的致死率較低，但是感染率卻很高，嚴(yán)重的情況下會(huì)導(dǎo)致死亡[2,3]。該病在健康貓中，也可以發(fā)現(xiàn)這種病的病毒，該病毒在健康貓中帶毒率也極高，帶毒貓沒有染病跡象，極難察覺。這表明在當(dāng)前環(huán)境中，該病毒廣泛存在，易感貓群難以保護(hù)。該病毒可通過空氣傳播，帶毒貓的分泌物傳播，以及排泄物傳播，接觸傳播等多種方式進(jìn)行傳播，極具傳染性。貓杯狀病毒具有非常強(qiáng)的變異性，這種較強(qiáng)的變異性在抗原和致病性方面均有所體現(xiàn)。疫苗預(yù)防貓杯狀病毒感染的效果并不理想，尤其是與高致病性貓杯狀病毒的交叉免疫較少，因此導(dǎo)致臨床免疫疫苗頻頻失敗[3]。貓杯狀病毒較強(qiáng)的變異性為該病的治療與防范帶來了極大的困難。因此，開展貓杯狀病毒的流行性調(diào)查具有非常重要的意義。

本研究主要針對(duì)分離出的一株貓杯狀病毒進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，分析該毒株的流行特征，為深入了解該病的流行特征奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為治療以及預(yù)防該病等工作做好鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

四川省某寵物醫(yī)院分離的一株貓杯狀病毒。

1.1.2 主要試劑

Easypure? Viral RNA Kit，TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，2×EasyTap?PCR SurperMix，pEASY-T5? Zero Cloning Kit，北京全式金生物技術(shù)有限公司；DNA 凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒小提試劑盒均為Omega 公司。DL2000，TAKARA 公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA 提取及cDNA 的合成

按照Easypure? Viral RNA Kit 的說明書提取病毒總RNA。

參 考TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：Anchored Oligo（dT）18 Primer（0.5 μg/μL）1 μL，2×TS Reaction Mix 10 μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，gDNA Remover 1 μL，RNA 3 μL,RNase-free Water 補(bǔ)充體積至20 μL。輕輕混勻，42 ℃孵育30 min。85 ℃加熱5 s 失活Trans-Script RT/RI 與gDNA Remover，獲得的產(chǎn)物測(cè)定濃度后放入-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RT PCR 鑒定

使用FCV ORF2 引物進(jìn)行PCR 檢測(cè)。引物序列：F:5’-CAACCTGCGCTAACGTGCTTA-3’，R：5’-TTCCCCCAAAAACYCCAGATC-5’。PCR 反應(yīng)體系為：2×Easy Tap PCR SuperMix 25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 模板4 μL，加無菌超純水至50 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5min，變性95 ℃ 45 s，退火59 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 30 min，40 個(gè)循環(huán)后總延伸72 ℃ 10 min，4 ℃ 10 min。目的片段大小為681 bp。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物的回收

按照Omega 公司的凝膠回收試劑盒進(jìn)行目的條帶的回收純化。首先通過凝膠成像系統(tǒng)從1%瓊脂糖凝膠上切下目的DNA 片段，放入干凈的1.5 mL 離心管中；向離心管中加入1 倍體積的Binding Buffer（XP2），50 ～60 ℃孵育7 min，每間隔2 ～3 min 就振蕩一次，確保膠塊充分溶解；將吸附柱放入收集管中，向吸附柱中加入不超過700 μL的膠塊溶解液，室溫10 000 rpm，離心1 min，倒掉收集管中的廢液；向吸附柱中加入300 μL Binding Buffer，室溫13 000 rpm，離心1min，倒掉收集管中的廢液；向吸附管中加入700 μL SPW，室溫13 000 rpm，離心1 min，倒掉收集管中的廢液；將空的吸附柱放到收集管中，室溫13 000 rpm，離心2 min；將吸附柱轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的1.5 mL 離心管中，向吸附膜中間位置加入15 ～30 μL Elution Buffer，室溫下靜置2 min；室溫13 000 rpm，離心1 min,收集DNA 溶液，放入-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 目的基因克隆測(cè)序

按照pEASY-T5 Zero Cloning Vector Kit 說明進(jìn)行回收產(chǎn)物的連接和轉(zhuǎn)化。在PCR 管中依次加入PCR 回收純化產(chǎn)物4 μL，pEASY-T5 Zero Cloning Vector 1 μL，輕輕混勻，25 ℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR 管置于冰上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至50 μL Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞中。按照Omega E.Z.N.A.Plasmid DNA mini kit 的說明書提取菌液的質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR 鑒定，PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同1.2.2。取5 μL PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，篩選出陽性克隆，將初步鑒定正確的陽性質(zhì)粒送往上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交NCBI 進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.5 FCV 分離株的系統(tǒng)發(fā)育分析

將測(cè)序結(jié)果與GenBank 的其他FCV 毒株進(jìn)行DNA 序列比對(duì)。并利用MEG6.0 軟件對(duì)分離得到的貓杯狀病毒毒株與其他上傳至GenBank 中的FCV 毒株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 結(jié)果

應(yīng)用FCV 鑒定引物，經(jīng)PCR 擴(kuò)增，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示得到大小約為681 bp 條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.2 CDV 14 株全基因組的系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)序列對(duì)比可知該病毒為FCV，毒株系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示：分離的貓杯狀病毒毒株與目前國(guó)內(nèi)流行的其他毒株相似性較低，疑似為新的變異毒株。

3 討論

貓杯狀病毒可以引起貓的慢性呼吸道疾病。該病毒可以通過飛沫等方式進(jìn)行傳播，其主要癥狀為口腔潰瘍、鼻結(jié)膜炎、肺炎等，嚴(yán)重時(shí)可致使感染貓面部及四肢出現(xiàn)浮腫、高燒、出血性病變等急性癥狀，死亡率高達(dá)60%?，F(xiàn)在部分家庭進(jìn)行多貓養(yǎng)殖，部分貓進(jìn)行野外活動(dòng)，并且這一部分貓大多活潑好動(dòng)，這使得病毒更容易在它們之間進(jìn)行傳播。部分貓表現(xiàn)為無癥狀感染，在它接近免疫力更為低下的其他貓時(shí)，會(huì)使得這些免疫力低下的貓群感染患病。由于該病毒具有較高的變異性，因此沒有十分有效的針對(duì)性疫苗，即使注射疫苗的貓群也有可能感染該病毒。由于貓杯狀病毒ORF2 編碼的衣殼蛋白是刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要蛋白，該基因是研究貓杯狀病毒基因工程疫苗的主要靶基因[4,5]。

本研究分析的貓杯狀病毒毒株與其他毒株具有較低的同源性，但沒有形成明顯的獨(dú)立分支，其遺傳 相 關(guān) 性 與KT000003、KM016908 和KX371573 較近。上述結(jié)果表明分離得到的貓杯狀病毒與國(guó)內(nèi)流行的毒株有明顯的差異，遺傳進(jìn)化較大，初步懷疑是新的變異株。最近有研究報(bào)道，國(guó)內(nèi)有新的貓杯狀病毒流行株出現(xiàn)，郭慧敏等于2018 年首次報(bào)道了VS-FCV 在我國(guó)流行，湯傲星等于2021 年首次發(fā)現(xiàn)華東地區(qū)貓杯狀病毒不斷發(fā)生變異[6]。另有研究報(bào)道同樣表明，貓杯狀病毒毒株相互之間的同源性不高，來源比較復(fù)雜。

變異毒株的不斷出現(xiàn)，致使傳統(tǒng)疫苗不能起到很好的免疫保護(hù)作用。目前預(yù)防貓杯狀病毒感染使用最多的仍然是接種疫苗進(jìn)行免疫。因此，開展貓杯狀病毒的流行性調(diào)查及遺傳進(jìn)化分析，為貓杯狀病毒疫苗的研究提供理論參考。