放血和刮痧療法單一及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)全身炎癥反應(yīng)綜合征模型大鼠炎癥的影響

林麗莉，李一純，湯文政，吳麗華，林 棟*

（1.福建省中醫(yī)藥科學(xué)院，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建 福州 350122；3.福建省立醫(yī)院，福建 福州 350001）

在針灸臨床干預(yù)體系中，大多采用多種干預(yù)方式的聯(lián)合應(yīng)用，但是不同干預(yù)方式聯(lián)合應(yīng)用會(huì)產(chǎn)生增效性或等效性，抑或是減效性，卻常常被忽略［1］。針灸療法不同的干預(yù)方式之間存在協(xié)同或拮抗的可能，已有研究提示體表干預(yù)的物理刺激方式對(duì)機(jī)體產(chǎn)生最大效應(yīng)與其干預(yù)次序存在相關(guān)性［1-2］。全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）屬于中醫(yī)外感熱病學(xué)及溫病學(xué)的范疇，以“熱毒”“痰”“瘀”“虛”為基本證候特征［3］?；诮?jīng)絡(luò)腧穴理論為指導(dǎo)的刮痧、放血干預(yù)方式屬于針灸臨床干預(yù)體系的一部分，具有開腠理、行氣血、散邪毒的功效。本研究通過制備SIRS模型大鼠，以大鼠血清、肺組織關(guān)鍵炎性因子含量與肺病理組織形態(tài)學(xué)的改變作為主要觀察指標(biāo)，探究刮痧和放血療法單一和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)SIRS 模型大鼠炎癥反應(yīng)的效應(yīng)，以期為臨床干預(yù)及SIRS 等相關(guān)感染性疾病的救治策略提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選用SPF 級(jí)健康成年雌性Wistar大鼠42 只，6～8 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（閩）2019-0007。動(dòng)物飼養(yǎng)于恒溫、恒濕環(huán)境，恒定溫度（22±1）℃，濕度為50%，光照明暗時(shí)間各12 h 交替，大鼠自由進(jìn)食與飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：FJTC-MIACUC2020059）。

1.2 試劑與器材 酵母多糖（美國Sigma 公司，型號(hào)：Z4250-5G）；注射用烏司他?。◤V東天普生化醫(yī)藥股份有限公司）；醫(yī)用液體石蠟（南昌華鑫醫(yī)藥化工有限公司）；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、大鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6）、大鼠γ 干擾素（IFN-γ）ELISA檢測(cè)試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；一次性使用末梢采血針（天津華鴻科技股份有限公司）；小型刮痧板（重慶譚木匠工藝品有限公司）；全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀（日本Sysmex 公司）；RM2235石蠟切片機(jī)（德國LEICA 公司）；ZT-14V1 生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）。

1.3 酵母多糖-石蠟油混懸液的制備 首先在磁力攪拌器上放置已準(zhǔn)確量取100 mL 液體石蠟的玻璃量杯，接著手持20 mL 注射器針頭，將5 g 酵母多糖粉劑逐漸少量撥入液體石蠟中，混勻后換裝至EP 管中高頻振蕩15 min；而后使用100 ℃水浴進(jìn)行滅菌80 min，待冷卻后放置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。使用前需使用恒溫水浴鍋中加熱?0 ℃，并充分搖勻，繼而制備出50 mg/mL 酵母多糖-石蠟油混懸液以待使用。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與造模方法 將42 只SPF 級(jí)Wistar雌性大鼠依照隨機(jī)數(shù)字表法分成空白組、模型組、放血組、刮痧組、刮痧＋放血組、放血＋刮痧組、烏司他丁組，每組6 只?？瞻捉M不予造模，以大鼠體質(zhì)量500 mg/kg 腹腔注射滅菌石蠟，其余6 組參照Goris 法［4］并結(jié)合參考文獻(xiàn)［5-7］建立SIRS 大鼠模型。造模前18 h 大鼠禁食，不禁水，自由活動(dòng)。造模時(shí)測(cè)直腸溫度，以大鼠體質(zhì)量500 mg/kg 腹腔注射50 mg/mL 酵母多糖-石蠟油混懸液，當(dāng)造模大鼠的直腸溫度較正?；蛟炷Ｇ吧? ℃、白細(xì)胞總數(shù)大于正常值2 倍時(shí)，即判定SIRS 大鼠模型造模成功［8］。

1.5 干預(yù)方法 參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［9］及人體相關(guān)穴位的解剖標(biāo)志，采用擬人對(duì)照法取穴，放血部位取大鼠雙側(cè)少商穴，定位和取穴方法參考文獻(xiàn)［10-11］，取第1 指橈側(cè)、爪根角旁開0.1 cm 處；刮痧部位取大鼠雙側(cè)肺俞穴（第3 胸椎下兩旁肋間）和大椎穴（背部正中第7 頸椎與第1 胸椎之間）。① 刮痧操作：輕按大鼠頭部進(jìn)行固定，持小型刮痧板與皮膚夾角約在45°～60°，自頭部向尾部方向進(jìn)行刮痧，操作頻次為2 次/s，持續(xù)60 s。② 放血操作：在大鼠雙側(cè)少商穴處使用一次性無菌末梢采血針，固定大鼠前肢，直刺穴位后迅速出針，出血量約4～6滴（約0.2～0.3 mL）。③ 烏司他丁給藥：根據(jù)注射用烏司他丁的臨床使用說明［12］，結(jié)合《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》中“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人用藥量的換算方法”［9］，本實(shí)驗(yàn)中烏司他丁組的給藥劑量定為2.7 萬U/kg。④ 各組具體干預(yù)方法：空白組和模型組僅模擬抓取動(dòng)作；烏司他丁組分別于造模后2、24 h 進(jìn)行腹腔注射烏司他丁；放血組分別于造模后2、24 h 進(jìn)行放血；刮痧組分別于造模后2、24 h 進(jìn)行刮痧；放血＋刮痧組于造模后2 h 進(jìn)行放血，于造模后24 h 進(jìn)行刮痧；刮痧＋放血組于造模后2 h 進(jìn)行刮痧，于造模后24 h進(jìn)行放血。

1.6 取材

1.6.1 收集血清 采集大鼠腹主動(dòng)脈血3～4 mL，將血液標(biāo)本置于一次性真空采血管中靜置1～2 h，使其血清與血漿初步分層；而后使用高速冷凍離心機(jī)以4 ℃、3 000 r/min 離心15 min，將血清從采血管移置EP 管內(nèi)，進(jìn)行二次離心操作；最后將所得血清樣本分裝，并放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 肺組織取材 在采集完腹主動(dòng)脈血后按大鼠體質(zhì)量0.5 mL/100 g 腹腔注射20%烏拉坦對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，解剖大鼠取出肺組織，并使用預(yù)冷的0.9% NaCl 洗滌，去除水分；取大鼠左肺組織置于提前裝有4%多聚甲醛固定液的EP 管中用于HE 染色；取大鼠右肺下葉組織放置于EP 管中并即刻放入干冰，短時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于檢測(cè)炎癥因子含量。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察 左肺組織在4%多聚甲醛固定液中固定24 h 后，使用流水沖洗清除組織上的多聚甲醛殘留液體，隨后放置于70%乙醇中過夜后進(jìn)行梯度脫水、透明及浸蠟、石蠟包埋、HE染色，HE 染色后的載玻片放置于干燥通風(fēng)的櫥窗內(nèi)自然風(fēng)干封片后，在光鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化。1.7.2 大鼠血清TNF-α、IL-6和INF-γ含量檢測(cè) 取出保存在-80 ℃冰箱的血清樣本，取上清液加樣于酶標(biāo)本孔，余下操作嚴(yán)格按照相應(yīng)指標(biāo)ELISA 檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算TNF-α、IL-6 和INF-γ 含量。

1.7.3 大鼠肺組織TNF-α、IL-6 和INF-γ 含量檢測(cè) 在一次性研磨管內(nèi)加入1 mL 增強(qiáng)型RIPA 裂解液、10 μL PMSF 蛋白酶抑制劑及一次性研磨磁珠，稱取100 mg 右肺組織，剪碎后放入各研磨管內(nèi)；研磨管置于研磨機(jī)中已提前預(yù)冷的金屬槽內(nèi)，并以64 Hz 頻率研磨50 s，共運(yùn)行2 次使其充分勻漿；研磨后使用移液槍將上清液抽取至新的EP 管內(nèi)，并置于高速冷凍離心機(jī)中以4 ℃、12 000 r/min 離心10 min；取上清液加樣于酶標(biāo)本孔，余下操作嚴(yán)格按照相應(yīng)指標(biāo)ELISA 檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算TNF-α、IL-6 和INF-γ 含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD-t檢驗(yàn)，若方差不齊則采用Games-Howell 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 7 組大鼠血清TNF-α、IL-6、IFN-γ含量比較 見表1。

表1 7 組大鼠血清TNF-α、IL-6、IFN-γ 含量比較（±s） pg/mL

表1 7 組大鼠血清TNF-α、IL-6、IFN-γ 含量比較（±s） pg/mL

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與烏司他丁組比較，3） P＜0.05；與刮痧組比較，4） P＜0.05。

IFN-γ 64.81±16.32 198.19±33.231）132.16±30.09 153.72±36.47 103.16±23.962）107.63±14.972）124.39±31.08組別空白組模型組烏司他丁組刮痧組放血組放血＋刮痧組刮痧＋放血組n6 6 6 6 6 6 6 TNF-α 4.37±1.79 29.29±2.181）14.29±2.452）16.63±1.662）11.56±3.392）12.72±3.412）12.18±6.372）IL-6 65.82±20.12 238.68±46.421）209.39±14.31 203.90±29.47 184.65±28.282）141.17±39.132）3）4）174.84±60.092）

2.2 7 組大鼠肺組織TNF-α、IL-6、IFN-γ 含量比較 見表2。

表2 7 組大鼠肺組織炎性因子TNF-α、IL-6、IFN-γ 含量比較（±s） pg/mL

表2 7 組大鼠肺組織炎性因子TNF-α、IL-6、IFN-γ 含量比較（±s） pg/mL

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

IFN-γ 40.09±1.87 66.00±6.191）50.98±6.552）47.71±4.542）44.12±1.252）45.85±3.592）49.53±4.862）組別空白組模型組烏司他丁組刮痧組放血組放血＋刮痧組刮痧＋放血組n6 6 6 6 6 6 6 TNF-α 46.89±1.86 69.85±8.061）60.76±4.06 55.42±1.98 53.79±2.562）53.17±3.882）55.94±3.96 IL-6 32.91±13.01 226.34±73.931）98.32±33.80 75.84±37.582）63.16±30.492）56.56±21.592）78.57±26.242）

2.3 7 組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)比較 7 組大鼠肺組織HE 染色結(jié)果顯示：空白組肺泡結(jié)構(gòu)正常、清晰且完整，無明顯病理改變，肺泡之間無明顯融合，肺泡壁無增厚，肺泡腔內(nèi)及肺泡壁未見明顯的炎癥細(xì)胞滲出、浸潤(rùn)及透明膜形成等情況；模型組存在明顯肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺泡壁明顯增厚，肺泡腔塌陷、縮小、變狹長(zhǎng)，肺間質(zhì)以炎癥改變?yōu)橹?，在肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)明顯可見有大量中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺間質(zhì)區(qū)域有紅細(xì)胞滲出、充血、水腫、肺實(shí)變等病理改變；而各干預(yù)組大鼠肺組織仍有部分肺泡融合、肺泡壁增厚情況，但已有明顯改善，與模型組比較，肺泡結(jié)構(gòu)較為明晰，肺泡腔及肺間質(zhì)仍見有少量炎癥細(xì)胞聚集。見圖1。

圖1 7 組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)HE 染色圖（×200）

3 討 論

根據(jù)SIRS 炎癥急性反應(yīng)期所表現(xiàn)出“熱”“毒”的病機(jī)與臨床特征，SIRS 屬中醫(yī)溫病學(xué)的范疇，因此SIRS 也常被辨為“痧證”［13-15］。清初瘟疫派醫(yī)家郭志邃所著《痧脹玉衡》有言：“血肉痧，看青紫筋刺之，則痧毒有所泄”“痧在肌膚者，刮之而愈；痧在血肉者，放之而愈”“滿則瀉之，菀陳則除之”，可見具有開腠理、行氣血和散邪毒功效的放血與刮痧療法在古代溫病急救中已得到了廣泛應(yīng)用。在針灸臨床干預(yù)中，大多采用刮痧和放血聯(lián)合應(yīng)用的治療策略［16-17］，然而放血與刮痧單一或聯(lián)合應(yīng)用，在SIRS炎癥急性反應(yīng)期的干預(yù)過程中是否會(huì)帶來不同的治療效應(yīng)？以及聯(lián)合應(yīng)用產(chǎn)生的效應(yīng)是否具有增效性，或僅僅具有等效性，抑或是減效的作用，這些問題目前尚未有系統(tǒng)的研究與解釋。

本研究結(jié)果表明刮痧和放血療法能夠抑制促炎因子的釋放，從而對(duì)SIRS 所導(dǎo)致的大鼠急性肺部炎癥反應(yīng)能夠起到一定的緩解和保護(hù)作用。刮痧所導(dǎo)致的表皮輕度促炎反應(yīng)，可激活抗原提呈細(xì)胞及皮膚免疫反應(yīng)，促使皮膚肥大細(xì)胞釋放組胺等物質(zhì)，從而誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答［18］，最終降低TNF-α、IL-6、INF-γ 的表達(dá)。另有研究表明：放血可以使顱腦創(chuàng)傷后的大鼠腦干IL-1β、TNF-α 的表達(dá)降低，并能夠抑制JNK/p38MAPK 信號(hào)通路，改善炎癥反應(yīng)［19］；手十二井穴放血能夠使大鼠血漿IL-6 水平降低［20］。本研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)干預(yù)組對(duì)炎癥因子均有影響，但多數(shù)干預(yù)組血清和肺組織各炎癥因子含量組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明放血和刮痧療法單一和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)SIRS 模型大鼠的治療效應(yīng)相當(dāng)，不同次序的放血和刮痧聯(lián)合應(yīng)用對(duì)SIRS 模型大鼠炎癥反應(yīng)的抑制作用亦無差別。