二陳湯抑制高脂飼養(yǎng)肥胖小鼠炎癥和肝臟脂肪變性作用研究

嚴(yán)曉丹，唐莉玲，錢長暉，招金娣，楊 媛，廖凌虹，3*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122；3.福建省中醫(yī)健康狀態(tài)辨識重點實驗室，福建 福州 350122）

以西式飲食為代表高卡路里的飲食方式容易引起肥胖，肥胖是多種疾病如脂肪肝、代謝綜合征、心血管疾病、結(jié)直腸癌、乳腺癌等的共同風(fēng)險因素。分析病理機制可知機體慢性低度炎癥是這些疾病的共同病理基礎(chǔ)［1-2］，如果能夠抑制或減輕炎癥，那么對相關(guān)疾病的預(yù)防具有積極意義。長期高脂飲食可導(dǎo)致血液中的脂多糖（LPS）含量升高［3-4］，激活Toll 樣受體-4（TLR4）和髓樣分化因子88（MyD88）信號通路，使肝臟巨噬細(xì)胞極化為促炎的M1 型，分泌多種炎性因子，促進(jìn)炎癥［5-8］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為長期嗜食肥甘厚味，形成痰濁，進(jìn)一步阻礙脾胃的運化功能，繼發(fā)損傷其他臟腑功能，成為多種疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。本團(tuán)隊擬從健脾化痰的角度入手，觀察二陳湯對高脂喂養(yǎng)的肥胖小鼠炎癥和肝臟脂肪樣變性的作用，并檢測血清LPS 含量和TLR4、MyD88 的表達(dá)情況，探討二陳湯對于高脂喂養(yǎng)肥胖小鼠肝臟的保護(hù)作用及機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF 級C57BL/6 雄性小鼠45 只，體質(zhì)量為（20±2） g，購自上海斯萊克動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005，動物質(zhì)量合格證編號：20170005043943。小鼠飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心SPF 級動物實驗室，實驗動物使用許可證編號：SYXK（閩）2014-0001。本實驗已通過福建中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審批（動物倫理號：FJTCM IACUC 2021084）。

1.2 藥物與試劑 根據(jù)《太平惠民和劑局方》二陳湯的原方，組成：陳皮15 g，姜半夏15 g，茯苓9 g，炙甘草4.5 g，生姜9 g，烏梅3 g。上述中藥購自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院，藥物浸泡 30 min，武火燒開文火煎30 min，重復(fù)煎煮2 次的藥液混合后蒸發(fā)濃縮成含生藥濃度為0.555 g/mL 二陳湯濃縮液。普通飼料：脂肪4%，糖類8%，蛋白20%（北京華阜康生物科技股份有限公司）；高脂飼料：脂肪45%，糖類20%，蛋白20%（上海帆泊生物技術(shù)有限公司）。甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）ELISA 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：A110-1-1、A111-1-1、A112-1-1 和A113-1-1）；小鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和脂多糖結(jié)合蛋白（LBP）ELISA 檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：EK0527、EK0411 和EK1274）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara 公司，批號：5015）；LPS 檢測試劑盒（美國Thermo Scientific 公司，批號：A39552）。

1.3 儀器 Infinite M200 多功能酶標(biāo)儀（奧地利Tecan 公司）；超微量紫外分光光度儀（美國Thermo Scientific 公司）；ABI 實時熒光定量PCR 儀（美國Thermo Scientific 公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與給藥 C57BL/6 雄性小鼠在SPF 級動物實驗室中適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d 后，隨機分為對照組15 只，高脂組30 只。對照組給予普通飼料，高脂組給予高脂飼料。喂養(yǎng)6 周后，稱量小鼠體質(zhì)量，高脂組小鼠體質(zhì)量高于對照組20%判定為肥胖小鼠造模成功［9］。將造模成功的高脂組小鼠隨機分為模型組、二陳湯組，每組15 只。按照人與動物劑量換算常規(guī)法［10］，二陳湯組予以含生藥量0.555 g/mL二陳湯濃縮液20 mL/（kg·d）灌胃，模型組及對照組則予以等體積生理鹽水灌胃，同時二陳湯組和模型組繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)，4 周后處死小鼠，收集血清和肝臟組織進(jìn)行檢測。

2.2 標(biāo)本采集 處死前一晚禁食，于次日清晨通過摘除小鼠眼球收集靜脈血，分離血清用于血清學(xué)檢測。脫脊椎處死小鼠，解剖后取小鼠肝臟右側(cè)肝葉切分為2 份，1 份置于4%多聚甲醛固定，用于肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察，1 份置于-80 ℃冰箱用于檢測基因mRNA 相對表達(dá)水平和蛋白表達(dá)量。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

2.3.1 體質(zhì)量 每周1 次固定時間稱量小鼠體質(zhì)量，直至取材，比較3 組每周小鼠平均體質(zhì)量。

2.3.2 血脂指標(biāo)檢測 第10 周處死小鼠后按照ELISA 檢測試劑盒說明書檢測小鼠血清TG、TC、LDL-C、HDL-C 水平。

2.3.3 肝臟組織病理形態(tài)觀察 將4%多聚甲醛固定24 h 的3 組小鼠肝臟進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片（厚度5 μm），HE 染色后在200 倍光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2.3.4 血清TNF-α、IL-6 和LBP 檢測 用ELISA 試劑盒在酶標(biāo)儀上進(jìn)行檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度（X 值）及其對應(yīng)OD 值（Y 值），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將各樣品孔吸光值代入，計算得出待測標(biāo)本中上述指標(biāo)的含量。

2.3.5 血清LPS 檢測 通過LPS 與細(xì)胞裂解物的特異性反應(yīng)催化無色顯色底物，借助酶標(biāo)儀測定待測樣品OD 值，根據(jù)顯色強度與LPS 之間對應(yīng)關(guān)系，可計算出樣品中LPS 含量。

2.3.6 qPCR 檢測肝臟組織TLR4、MyD88 mRNA 相對表達(dá)水平 取小鼠肝臟組織30 mg，提取總RNA，測定濃度。取2 μg 總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 并進(jìn)行qPCR 檢測，用2-ΔΔCT法分析相關(guān)基因的表達(dá)水平。檢測目的基因和內(nèi)參基因的引物序列如表1所示。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列

2.3.7 Western blot 檢測肝臟組織TLR4、MyD88 蛋白表達(dá)量 取小鼠肝臟組織提取總蛋白質(zhì)，測定濃度，用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。常規(guī)轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂奶粉封閉，加入一抗4 ℃孵育過夜（其中TLR4、MyD88和GAPDH一抗稀釋比分別為1∶5 000、1∶800和1∶10 000），洗膜后加入二抗室溫孵育2 h。洗膜后，進(jìn)行化學(xué)顯影，掃描灰度值，以GAPDH 作為內(nèi)參照蛋白進(jìn)行校準(zhǔn)，采用目標(biāo)蛋白條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值來表示目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 3 組小鼠體質(zhì)量變化比較 高脂飼料喂養(yǎng)6 周后，模型組體質(zhì)量為（31.9±2.2）g，與對照組（26.4±1.2）g 比較明顯增高（P＜0.05）；給藥第1、2、3 周后，對照組小鼠體質(zhì)量明顯低于模型組和二陳湯組（P＜0.05），二陳湯組小鼠體質(zhì)量明顯低于模型組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 3 組小鼠體質(zhì)量每周變化圖

3.2 3 組小鼠血脂指標(biāo)比較 見表2。

表2 第10 周3 組小鼠血脂指標(biāo)比較（±s） mmol/L

表2 第10 周3 組小鼠血脂指標(biāo)比較（±s） mmol/L

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

HDL-C 4.03±0.13 4.32±0.38 5.44±0.162）組別對照組模型組二陳湯組n 15 15 15 TG 3.11±0.17 5.27±0.131）3.58±0.102）TC 3.45±0.21 5.57±0.581）2.49±0.172）LDL-C 0.69±0.10 2.29±0.201）1.49±0.082）

3.3 3 組小鼠肝臟組織病理學(xué)形態(tài)比較 對照組小鼠肝細(xì)胞以中央靜脈為中心，呈放射狀排列，未見脂肪空泡，炎癥細(xì)胞浸潤；模型組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂肪空泡明顯增大，并伴隨輕度炎癥細(xì)胞浸潤；二陳湯組肝細(xì)胞脂肪空泡減小，炎癥細(xì)胞浸潤減少，中央靜脈、肝索、肝血竇結(jié)構(gòu)趨于正常。見圖2。

圖2 3 組小鼠肝臟組織HE 染色圖（×200）

3.4 3 組小鼠血清TNF-α、IL-6、LBP、LPS 含量比較 見表3。

表3 3 組小鼠血清中TNF-α、IL-6、LBP、LPS 含量比較（±s）

表3 3 組小鼠血清中TNF-α、IL-6、LBP、LPS 含量比較（±s）

注：與對照組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與模型組比較，3） P＜0.05。

組別對照組模型組二陳湯組n 15 15 15 TNF-α/（pg/mL）13.53±0.17 21.98±2.651）15.62±1.023）IL-6/（pg/mL）8.13±0.89 12.35±1.441）8.61±0.583）LBP/（ng/mL）293.17±32.64 488.46±67.901）333.39±57.633）LPS/（EU/mL）50.58±0.63 74.63±1.922）54.64±2.163）

3.5 3 組小鼠肝臟組織TLR4、MyD88 mRNA 相對表達(dá)水平比較 見表4。

表4 3 組小鼠肝臟組織TLR4、MyD88 mRNA相對表達(dá)水平比較（±s）

表4 3 組小鼠肝臟組織TLR4、MyD88 mRNA相對表達(dá)水平比較（±s）

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

MyD88 1.00±0.04 1.25±0.311）1.05±0.122）組別對照組模型組二陳湯組n 15 15 15 TLR4 1.00±0.02 0.88±0.311）0.81±0.272）

3.6 3 組小鼠肝臟組織TLR4、MyD88 蛋白表達(dá)量比較 見圖5、表5。

圖5 3 組小鼠肝臟組織TLR4、MyD88 蛋白條帶圖

表5 3 組小鼠肝臟組織TLR4、MyD88蛋白表達(dá)量比較（±s）

表5 3 組小鼠肝臟組織TLR4、MyD88蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

MyD88 0.02±0.01 0.69±0.071）0.02±0.012）組別對照組模型組二陳湯組n 15 15 15 TLR4 0.04±0.01 0.29±0.021）0.02±0.012）

4 討 論

本研究結(jié)果顯示：與對照組小鼠比較，高脂飼養(yǎng)的模型組小鼠，除體質(zhì)量、血脂指標(biāo)升高外，還表現(xiàn)出血清炎癥指標(biāo)TNF-α 和IL-6 升高，組織病理學(xué)顯示模型組小鼠肝臟也出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤和肝細(xì)胞脂肪變，說明高脂飼養(yǎng)在引起小鼠肥胖同時引發(fā)機體代謝性炎癥。二陳湯干預(yù)4 周后，與模型組比較，血脂異常得到改善，血清炎癥因子TNF-α 和IL-6 降低，肝臟炎癥病理和脂肪變減輕，說明二陳湯對高脂飲食造成的炎癥具有治療作用，對肝臟組織有一定的保護(hù)作用。綜上可知：與對照組比較，模型組中血清LPS 和LPB 明顯升高，二陳湯干預(yù)后，LPS 和LPB 下調(diào)，提示二陳湯的肝臟保護(hù)機制與LPS 有關(guān)。

長期高脂飲食導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，革蘭氏陰性菌增多，LPS 分泌增多［11］。肝臟是清除LPS 的主要臟器，當(dāng)LPS 隨血液循環(huán)進(jìn)入肝臟后，可刺激肝臟細(xì)胞合成、分泌LBP，隨后LPS、LBP 和CD14 形成免疫復(fù)合物，作用于肝臟內(nèi)巨噬細(xì)胞表面TLR4 受體，激活胞內(nèi)MyD88/NF-κB 信號通路，同時促使靜息態(tài)巨噬細(xì)胞向促炎型M1 型發(fā)生極化，啟動多種促炎癥基因和趨化因子的轉(zhuǎn)錄［12］，導(dǎo)致持續(xù)性炎癥的發(fā)生。此外，TLR4 也是Toll 樣受體家族中與脂代謝密切相關(guān)的成員，具有調(diào)節(jié)脂肪生成基因表達(dá)，影響脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)積累的作用［13］。因此，本研究檢測了肝臟組織TLR4 和MyD88 表達(dá)水平，結(jié)果顯示模型組肝臟組織TLR4 和MyD88 蛋白相對表達(dá)量均升高，提示TLR4、MyD88 通路已經(jīng)激活，導(dǎo)致血清中炎癥因子IL-6 和TNF-α 水平升高以及肝細(xì)胞脂肪空泡增大。二陳湯組TLR4、MyD88表達(dá)較模型組明顯降低，血清炎癥因子減少，肝細(xì)胞脂肪空泡變小。說明二陳湯可降低血清LPS，并進(jìn)一步抑制肝臟TLR4、MyD88 的基因表達(dá)，具有降低炎癥因子表達(dá)，從而改善肝臟細(xì)胞脂肪變性的效果，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致［14］。在中醫(yī)理論中，過度營養(yǎng)和能量的飲食對機體造成的損傷與痰濁關(guān)系密切?！端貑枴け哉摗分赋觥帮嬍匙员?，腸胃乃傷”。過食肥膩和醇酒厚味會損傷脾胃，導(dǎo)致運化失司，水谷精微“化失其正”，影響氣血津液之代謝，引起痰濕內(nèi)生，過多的痰濕不能及時轉(zhuǎn)化和排泄，留而不去，即成痰濁。痰濁一旦形成，可進(jìn)一步阻礙脾胃的運化功能，阻滯中焦氣機，損傷其他臟腑。中醫(yī)更有“肥人多痰”的說法，提示肥胖及其相關(guān)疾病中，“痰”是關(guān)鍵中醫(yī)病理因素，這一說法也得到了多個理論和臨床研究的支持［15-16］。從痰入手治療過度營養(yǎng)造成的肥胖相關(guān)疾病也被認(rèn)為是行之有效的治療方法［17-22］，如糖尿?。?7］、多囊卵巢綜合征［18-19］、非酒精性脂肪肝［20］、高脂血癥［21］。本研究發(fā)現(xiàn)二陳湯可能通過降低LPS 含量從而抑制TLR4、MyD88 表達(dá)來減輕炎癥，與張玉蓉等［23］研究結(jié)果相印證，但本研究首次從降低LPS 出發(fā)研究二陳湯作用機制，為后續(xù)進(jìn)一步研究二陳湯通過調(diào)整腸道菌群，減少LPS 釋放，從而干預(yù)肥胖相關(guān)的慢性炎癥提供了新的思路。

綜上所述，二陳湯對高脂飼養(yǎng)的肥胖小鼠炎癥因子升高和肝細(xì)胞脂肪變等病理改變有一定的改善作用，其具體機制與二陳湯抑制LPS 活化的TLR4、MyD88 通路有關(guān)。