紫草素-利尼伐尼抗腫瘤衍生物的合成及活性篩選

盧明軍,戴子琦,羅煜瑾,陳可點,高 豐,顧昱昊,張梓杰,張 佟,曾 琪,金猷凱,徐 冰,雷海民

北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 102488

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常見的實體惡性腫瘤之一,也是發(fā)病率和死亡率較高的腫瘤之一[1]。HCC的發(fā)病機制復(fù)雜且具有地域性,涉及多種因素,包括基因突變、異常的血管新生和異常的信號通路表達(dá)等[2-3]。由于肝癌發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速、惡性程度高,故70%以上的患者在診斷時已處于中晚期,只有約15%的患者符合手術(shù)或移植的條件[4]。近年來,分子靶向藥物已成為治療晚期HCC的有效方法,多靶點阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤血管生成的聯(lián)合治療可明顯抑制癌細(xì)胞的生長,為癌癥患者帶來了新的希望。以索拉非尼(sorafenib)和舒尼替尼(sunitinib)為代表的多激酶抑制劑已被廣泛用于無法進(jìn)行手術(shù)的晚期HCC患者的臨床治療,但長期使用多激酶抑制劑可能引起一系列不良反應(yīng),如惡心、乏力、白細(xì)胞減少,甚至發(fā)生耐藥[5-8]。利尼伐尼(結(jié)構(gòu)見圖1)作為口服活性多靶點受體酪氨酸激酶抑制劑之一,已被證明能通過抑制血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血小板衍生的生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)而顯示出強大的抗腫瘤活性[9],但與索拉非尼相比,其不能明顯改善HCC患者的總生存率,且因其具有毒性未能通過臨床試驗[10]。

注:A.利尼伐尼;B.紫草素。

紫草素(結(jié)構(gòu)見圖1)是從天然植物紫草中提取的強效抗腫瘤化合物之一,是一種1,4-萘醌,由一個苯基與一個共軛的環(huán)狀二酮駢合而成[11]。大量研究表明,紫草素可以有效抑制腫瘤細(xì)胞生長和腫瘤血管生成,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤特異性丙酮酸激酶的活性,且具有一定的逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥的作用[12-19]。

基于上述研究結(jié)果,將多激酶抑制劑利尼伐尼與抗腫瘤中藥活性成分紫草素通過不同長度的碳鏈進(jìn)行偶聯(lián),設(shè)計、合成一系列結(jié)構(gòu)新穎的紫草素-利尼伐尼衍生物;以母體藥物利尼伐尼和紫草素為對照,用3種腫瘤細(xì)胞系HepG2、A549、HCT-116和1種肝正常細(xì)胞系L02評價衍生物的抗腫瘤活性和細(xì)胞毒選擇性;進(jìn)一步采用細(xì)胞染色、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞劃痕實驗和鵪鶉胚模型研究優(yōu)勢衍生物對細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移和血管生成的影響[20-27],以期發(fā)現(xiàn)高效、低毒的抗腫瘤衍生物。

1 儀器與材料

1.1 儀器

磁力攪拌器(德國IKA公司);SAROO-RIUS-BS124S型電子分析天平(德國賽多利斯股份有限公司);Bruker Avance 400型核磁共振儀(瑞士Bruker公司);Agilent Q-TOF型質(zhì)譜儀(美國安捷倫科技有限公司);Thermo 3111型CO2培養(yǎng)箱、Multiskan GO酶標(biāo)儀,均購自美國賽默飛世爾科技有限公司;Olympus倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯株式會社)。

1.2 試藥

紫草素(陜西摩爾生物科技有限公司);利尼伐尼(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride,EDCI]、1-羥基苯并三唑(1-hydroxybenzotriazole,HOBt,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);4-二甲氨基吡啶(4-dimethyl amino phridine,DMAP,上海晶純股份科技有限公司);N,N-二異丙基乙胺(N,N-diisopropylethylamine,DIPEA,上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司);二氯甲烷、無水硫酸鈉等均為分析純,均購自北京化工廠;RPMI-1640培養(yǎng)基、杜氏改良必需基本培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑藍(lán)[3-(4,5-di-methylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)、吉姆薩染液(Giemsa),均購自北京拜爾迪生物科技有限公司;柱色譜硅膠(200～300目,青島海洋化工有限公司)。

1.3 細(xì)胞

人肝癌細(xì)胞HepG2、人肺癌細(xì)胞A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、人正常肝細(xì)胞L02,均購自北京協(xié)和醫(yī)院細(xì)胞資源中心。

2 方法

2.1 化學(xué)合成

2.1.1化合物1a的合成 精密稱取己二酸(101.4 mg,0.694 mmol)、DMAP(42.4 mg,0.347 mmol)、EDCI(266.2 mg,1.388 mmol),置于100 mL反應(yīng)瓶中,加入10 mL二氯甲烷溶解,冰水浴中攪拌0.5 h后,另取紫草素(200.0 mg,0.694 mmol)溶于10 mL二氯甲烷,將其緩慢滴加至反應(yīng)瓶中,冰水浴中攪拌4 h,薄層色譜法(thin-layer chromatography,TLC)監(jiān)測反應(yīng)完全后,停止反應(yīng);將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,依次用水和飽和食鹽水萃取,收集二氯甲烷層并用無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮,置于硅膠柱上分離,得紫色粉末,即1a。

2.1.2化合物2a的合成 精密稱取辛二酸(120.9 mg,0.694 mmol)、DMAP(42.4 mg,0.347 mmol)、EDCI(266.2 mg,1.388 mmol),置于100 mL反應(yīng)瓶中,加入10 mL二氯甲烷溶解,冰水浴中攪拌0.5 h,另取紫草素(200.0 mg,0.694 mmol)溶于10 mL二氯甲烷,將其緩慢滴加至反應(yīng)瓶中,冰水浴中攪拌4 h,TLC監(jiān)測反應(yīng)完全后,停止反應(yīng);將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,依次用水和飽和食鹽水萃取,收集二氯甲烷層并用無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮,置于硅膠柱上分離,得紫色粉末,即2a。

2.1.3化合物3a的合成 精密稱取癸二酸(140.3 mg,0.694 mmol)、DMAP(42.4 mg,0.347 mmol)、EDCI(266.2 mg,1.388 mmol),置于100 mL反應(yīng)瓶中,加入10 mL二氯甲烷溶解,冰水浴中攪拌0.5 h,另取紫草素(200.0 mg,0.694 mmol)溶于10 mL二氯甲烷,將其緩慢滴加至反應(yīng)瓶中,冰水浴中攪拌4 h,TLC監(jiān)測反應(yīng)完全后,停止反應(yīng);將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,依次用水和飽和食鹽水萃取,收集二氯甲烷層并用無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮,置于硅膠柱上分離,得紫色粉末,即3a。

2.1.4化合物4a的合成 精密稱取十二烷二酸(159.8 mg,0.694 mmol)、DMAP(42.4 mg,0.347 mmol)、EDCI(266.2 mg,1.388 mmol),置于100 mL反應(yīng)瓶中,加入10 mL二氯甲烷溶解,冰水浴中攪拌0.5 h,另取紫草素(200.0 mg,0.694 mmol)溶于10 mL二氯甲烷中,將其緩慢滴加至反應(yīng)瓶中,冰水浴中攪拌4 h,TLC監(jiān)測反應(yīng)完全后,停止反應(yīng);將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,依次用水和飽和食鹽水萃取,收集二氯甲烷層并用無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮,置于硅膠柱上分離,得紫色粉末,即4a。

2.1.5化合物5a的合成 精密稱取十四烷二酸(179.2 mg,0.694 mmol)、DMAP(42.4 mg,0.347 mmol)、EDCI(266.2 mg,1.388 mmol),置于100 mL反應(yīng)瓶中,加入10 mL二氯甲烷溶解,冰水浴中攪拌0.5 h,另取紫草素(200.0 mg,0.694 mmol)溶于10 mL二氯甲烷中,將其緩慢滴加至反應(yīng)瓶中,冰水浴中攪拌4 h,TLC監(jiān)測反應(yīng)完全后,停止反應(yīng);將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,依次用水和飽和食鹽水萃取,收集二氯甲烷層并用無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮,置于硅膠柱上分離,得紫色粉末,即5a。

2.1.6化合物6a的合成 精密稱取十六烷二酸(198.7 mg,0.694 mmol)、DMAP(42.4 mg,0.347 mmol)、EDCI(266.2 mg,1.388 mmol),置于100 mL反應(yīng)瓶中,加入10 mL二氯甲烷溶解,冰水浴中攪拌0.5 h,另取紫草素(200.0 mg,0.694 mmol)溶于10 mL二氯甲烷中,將其緩慢滴加至反應(yīng)瓶中,冰水浴中攪拌4 h,TLC監(jiān)測反應(yīng)完全后,停止反應(yīng);將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,依次用水和飽和食鹽水萃取,收集二氯甲烷層并用無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮,置于硅膠柱上分離,得紫色粉末,即6a。

2.1.7化合物AL-6的合成 精密稱取利尼伐尼(100 mg,0.267 mmol)、1a(111.11 mg,0.267 mmol)、HOBt(54.2 mg,0.401 mmol)、EDCI(76.9 mg,0.401 mmol)、DIPEA(51.8 mg,0.801 mmol),置于100 mL反應(yīng)瓶中,加入10 mL二氯甲烷溶解,冰水浴中攪拌8 h,TLC監(jiān)測反應(yīng)完全,停止反應(yīng);將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,依次用水和飽和食鹽水萃取,收集二氯甲烷層并用無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮,置于硅膠柱上分離,得紫色粉末,即AL-6。

2.1.8化合物AL-8的合成 精密稱取利尼伐尼(100 mg,0.267 mmol)、2a(118.6 mg,0.267 mmol)、HOBt(54.2 mg,0.401 mmol)、EDCI(76.9 mg,0.401 mmol)、DIPEA(51.8 mg,0.801 mmol),置于100 mL反應(yīng)瓶中,加入10 mL二氯甲烷溶解,冰水浴中攪拌8 h,TLC監(jiān)測反應(yīng)完全后,停止反應(yīng);將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,依次用水和飽和食鹽水萃取,收集二氯甲烷層并用無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮,置于硅膠柱上分離,得紫色粉末,即AL-8。

2.1.9化合物AL-10的合成 精密稱取利尼伐尼(100 mg,0.267 mmol)、3a(126.1 mg,0.267 mmol)、HOBt(54.2 mg,0.401 mmol)、EDCI(76.9 mg,0.401 mmol)、DIPEA(51.8 mg,0.801 mmol),置于100 mL反應(yīng)瓶中,加入10 mL二氯甲烷溶解,冰水浴中攪拌8 h,TLC監(jiān)測反應(yīng)完全后,停止反應(yīng);將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,依次用水和飽和食鹽水萃取,收集二氯甲烷層并用無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮,置于硅膠柱上分離,得紫色粉末,即AL-10。

2.1.10化合物AL-12的合成 精密稱取利尼伐尼(100 mg,0.267 mmol)、4a(133.6 mg,0.267 mmol)、HOBt(54.2 mg,0.401 mmol)、EDCI(76.9 mg,0.401 mmol)、DIPEA(51.8 mg,0.801 mmol),置于100 mL反應(yīng)瓶中,加入10 mL二氯甲烷溶解,冰水浴中攪拌8 h,TLC監(jiān)測反應(yīng)完全后,停止反應(yīng);將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,依次用水和飽和食鹽水萃取,收集二氯甲烷層并用無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮,置于硅膠柱上分離,得紫色粉末,即AL-12。

2.1.11化合物AL-14的合成 精密稱取利尼伐尼(100 mg,0.267 mmol)、5a(141.0 mg,0.267 mmol)、HOBt(54.2 mg,0.401 mmol)、EDCI(76.9 mg,0.401 mmol)、DIPEA(51.8 mg,0.801 mmol),置于100 mL反應(yīng)瓶中,加入10 mL二氯甲烷溶解,冰水浴中攪拌8 h,TLC監(jiān)測反應(yīng)完全后,停止反應(yīng);將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,依次用水和飽和食鹽水萃取,收集二氯甲烷層并用無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮,置于硅膠柱上分離,得紫色粉末,即AL-14。

2.1.12化合物AL-16的合成 精密稱取利尼伐尼(100 mg,0.267 mmol)、6a(148.5 mg,0.267 mmol)、HOBt(54.2 mg,0.401 mmol)、EDCI(76.9 mg,0.401 mmol)、DIPEA(51.8 mg,0.801 mmol),置于100 mL反應(yīng)瓶中,加入10 mL二氯甲烷溶解,冰水浴中攪拌8 h,TLC監(jiān)測反應(yīng)完全后,停止反應(yīng);將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,依次用水和飽和食鹽水萃取,收集二氯甲烷層并用無水硫酸鈉干燥,減壓濃縮,置于硅膠柱上分離,得紫色粉末,即AL-16。

2.2 體外抗腫瘤活性的評價

用MTT法評價紫草素-利尼伐尼系列衍生物的抗腫瘤活性和細(xì)胞毒選擇性,在含有100 mL·L-1胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM或RPMI 1640中,以3×103個·孔-1的密度將細(xì)胞接種到96孔板中,并在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2條件下培養(yǎng)24 h,使其黏附。用含測試化合物連續(xù)濃度(40、20、10、5、2.5、1.25、0.625 μmol·L-1)的培養(yǎng)液處理細(xì)胞72 h。每孔加入20 μL質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液,并在37 ℃孵育4 h。棄掉培養(yǎng)基,每孔加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sul-foxide,DMSO),在黑暗中搖動96孔板6次,用酶標(biāo)儀測量490 nm處的吸光度。以上操作均重復(fù)3次。計算IC50以確定細(xì)胞存活率。

2.3 DAPI染色

將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板中(2.4×103個·孔-1)。在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,加入不同濃度(1.5、3、6 μmol·L-1)的AL-8,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h。丟棄細(xì)胞培養(yǎng)基,用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline, PBS)洗2次后,用40 mL·L-1多聚甲醛固定細(xì)胞10 min。棄去固定劑,用PBS清洗細(xì)胞,加入DAPI染液,避光染色5 min,棄去剩余染液,PBS洗2次,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.4 Giemsa染色

將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞接種于12孔培養(yǎng)板中(2.4×103個·孔-1)。在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,加入不同濃度(1.5、3、6 μmol·L-1)的AL-8,放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。丟棄細(xì)胞培養(yǎng)基,用PBS洗2次,用預(yù)冷的乙醇固定10 min。棄去乙醇,用PBS清洗細(xì)胞,加入Giemsa染液對細(xì)胞進(jìn)行避光染色2 min,棄去剩余染液,用PBS洗2次,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)

將HepG2細(xì)胞以4.8×104個·孔-1的密度接種于6孔板中,培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁,用系列濃度梯度的AL-8(1.5、3、6 μmol·L-1)在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2條件下處理細(xì)胞72 h,用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化細(xì)胞,以1 200 r·min-1離心10 min,收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS清洗每管細(xì)胞3次,用200 μL PBS重懸細(xì)胞,加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI,在4 ℃避光對細(xì)胞進(jìn)行染色,持續(xù)30 min。隨后于每管中加入300 μL PBS,用400目濾網(wǎng)過濾1次,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2.6 細(xì)胞劃痕實驗

將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以4.8×104個·孔-1的密度接種于6孔培養(yǎng)板中。用無菌的200 μL吸頭做劃痕傷口,用PBS清洗細(xì)胞1次。立即用倒置顯微鏡觀察傷口(0 h)并拍照。將HepG2細(xì)胞分別接種于培養(yǎng)基(對照組)和含AL-8(1.5、3、6 μmol·L-1)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在培養(yǎng)24、48、72 h后于顯微鏡下對劃痕傷口進(jìn)行拍照。

2.7 抗血管生成實驗

用鵪鶉胚絨毛尿囊膜實驗評估AL-8對血管生成的影響。隨機選取56枚質(zhì)量為10～12 g的鵪鶉蛋,在37 ℃、相對濕度為65%的孵化器中孵化。將鵪鶉蛋隨機分為7組,每組8枚。在每個蛋殼上打大小合適的洞,將含有10、20、40、80 μmol·L-1AL-8的載藥海綿(直徑5 mm)放在鵪鶉胚絨毛尿囊膜(quail chick chorioallantoic membrane,qCAM)上,用醫(yī)用膠帶密封蛋殼。藥物干預(yù)2 d后,用手術(shù)剪刀取出鵪鶉胚胎,用生理鹽水清洗。將尿囊膜展開并觀察。用Image J對每一個qCAM上的微血管進(jìn)行定量分析。

3 結(jié)果

3.1 化學(xué)合成

本研究根據(jù)藥物化學(xué)中的拼合原理合成了紫草素-利尼伐尼系列衍生物,合成路線見圖2。將紫草素和不同碳鏈長度的linker在EDCI、DMAP等縮合劑的作用下發(fā)生酯化反應(yīng)得到中間體化合物1a～6a。中間體化合物1a～6a繼續(xù)與利尼伐尼在HOBt、EDCI和DIPEA催化下發(fā)生酰胺化反應(yīng),得到紫草素-利尼伐尼系列衍生物AL-6～AL-16。所有終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)均經(jīng)核磁共振氫譜(nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum,1H-NMR)、核磁共振碳譜(nuclear magnetic resonance carbon spectrum,13C-NMR)和高分辨質(zhì)譜(high resolution mass spectrometry,HRMS)確證,譜學(xué)數(shù)據(jù)見表1。

表1 衍生物AL-6～AL-16的波譜數(shù)據(jù)

注:a.DMAP,EDCI,CH2Cl2,0 ℃,4 h;b.DIPEA,EDCI,HOBT,CH2Cl2,0 ℃。

3.2 體外抗腫瘤活性

用MTT實驗評價紫草素-利尼伐尼系列衍生物對3種腫瘤細(xì)胞(HepG2、A549、HCT-116)的抗腫瘤活性和肝正常細(xì)胞L02的細(xì)胞毒選擇性。結(jié)果見表2。由表2可知,大部分化合物在進(jìn)行偶聯(lián)之后,對癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的毒性相較于母核均有不同程度的降低,但衍生物AL-8不僅對癌細(xì)胞的抑制作用與母核接近,且對肝正常細(xì)胞L02的毒性低于母體化合物。進(jìn)一步對AL-8、紫草素和利尼伐尼的抗腫瘤活性和毒性進(jìn)行比較,見圖3。

表2 衍生物對HCT-116、HepG2、A549和L02細(xì)胞的抗增殖活性

圖3 AL-8、紫草素和利尼伐尼抗腫瘤活性和毒性的比較

由圖3可見,AL-8仍保留較高的活性,其對人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用與紫草素相當(dāng),優(yōu)于利尼伐尼,但是對于肝正常細(xì)胞L02的毒性明顯降低,安全性強于紫草素,選擇性顯著提升。進(jìn)一步分析AL-8對HepG2抑制作用隨時間的變化,見圖4。由圖4可見,AL-8在不同干預(yù)時間均具有較好的抑制作用,與母核紫草素相當(dāng),均優(yōu)于利尼伐尼。

綜合分析衍生物構(gòu)效關(guān)系可知,不同的linker長度對衍生物的腫瘤細(xì)胞抑制活性有較大影響,衍生物AL-8具有最強的抑制作用,而當(dāng)碳鏈長度縮短時抑制作用喪失,AL-8與AL-6的最低能量構(gòu)象與相應(yīng)的藥效團(tuán)模型見圖5。由圖5可見,隨著linker長度的縮短,利尼伐尼與紫草素的藥效基團(tuán)之間產(chǎn)生了相互排斥的弱作用力,使二者的最低能量構(gòu)象發(fā)生改變,從而使藥效團(tuán)作用模型發(fā)生改變,同時在與靶點結(jié)合時,由于2個母體化合物之間距離過近,可能會在與靶點結(jié)合時產(chǎn)生排斥作用。

注:粉色.氫鍵供體;綠色.氫鍵受體;淺藍(lán)色.疏水作用;橙色.π-π堆積作用。

而當(dāng)linker長度增加時,雖然其對2個母體化合物之間的構(gòu)象影響較小,但較大的相對分子質(zhì)量會嚴(yán)重影響其跨膜作用,并且可能影響其與靶點的結(jié)合,增強脫靶效應(yīng)。綜上所述,本部分實驗對合成的衍生物進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞毒性與正常細(xì)胞毒性篩選,綜合分析了其構(gòu)效關(guān)系,優(yōu)勢化合物AL-8與利尼伐尼相比,不僅活性提升,并且對正常細(xì)胞的毒性降低,選擇性明顯提高,表現(xiàn)出了一定的HCC治療潛力。

3.3 DAPI染色結(jié)果

作為一種可以與DNA強力結(jié)合的熒光染料,4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染液可以透過細(xì)胞膜,用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。為了驗證化合物AL-8是否通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡對HepG2產(chǎn)生抑制作用,本研究用DAPI染色觀察細(xì)胞核的形態(tài)變化,見圖6。由圖6可見,對照組的細(xì)胞核完整,細(xì)胞未表現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的特征,細(xì)胞形態(tài)正常;用不同濃度的AL-8處理72 h后,細(xì)胞數(shù)量明顯減少,并且可見明顯的細(xì)胞核破裂,一些細(xì)胞的輪廓變得不規(guī)則,隨著AL-8濃度的增加,核破裂明顯。結(jié)果表明,化合物AL-8的干預(yù)使HepG2細(xì)胞的細(xì)胞核破裂,推測其可能是通過誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果。

注:A.對照組;B. 1.5 μmol·L-1 AL-8;C.3 μmol·L-1 AL-8;D.6 μmol·L-1 AL-8。

3.4 Giemsa染色結(jié)果

吉姆薩(Giemsa)染液由天青色素、伊紅等組成,與DAPI染液類似,容易對細(xì)胞核著色。本研究用Giemsa染色進(jìn)一步驗證AL-8誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用機制,見圖7。由圖7可見,對照組的HepG2細(xì)胞具有清晰的圓形細(xì)胞核,被染成藍(lán)紫色,排列緊密,細(xì)胞形態(tài)舒展,折光率相似。而隨著AL-8濃度的增加,凋亡率上升。

注:A.對照組;B.1.5 μmol·L-1 AL-8;C.3 μmol·L-1 AL-8;D.6 μmol·L-1 AL-8。

在高濃度(6 μmol·L-1)AL-8作用下,細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化,核染色質(zhì)凝結(jié)和碎裂,細(xì)胞萎縮。Giemsa染色結(jié)果進(jìn)一步證明AL-8可能通過誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞核破裂,發(fā)揮抗腫瘤作用。

3.5 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

細(xì)胞凋亡是一種由基因控制的自主有序死亡,其對于維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡是抗腫瘤藥物發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機制。為了進(jìn)一步確定AL-8誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和繼發(fā)性壞死的機制,用Annexin V-FITC/PI對細(xì)胞進(jìn)行染色,用流式細(xì)胞儀分析凋亡率,見圖8。由圖8可見,用不同濃度(1.5、3、6 μmol·L-1)的AL-8處理HepG2時,發(fā)生凋亡的HepG2細(xì)胞(Q2+Q4)的比例從對照組的7.3%增加到10.1%、14.8%、42.1%。表明化合物AL-8能以濃度依賴的方式誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡,且早期凋亡(Q4)更為明顯。綜上所述,AL-8能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制HepG2細(xì)胞增殖的作用。

注:A.對照組;B.1.5 μmol·L-1 AL-8;C.3 μmol·L-1 AL-8;D.6 μmol·L-1 AL-8。

3.6 細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果

細(xì)胞劃痕實驗作為評價抗腫瘤藥物對腫瘤遷移影響的經(jīng)典實驗,通過分析腫瘤細(xì)胞在劃痕處的細(xì)胞占有率,可以判斷藥物是否有效抑制了腫瘤細(xì)胞的遷移。本研究用細(xì)胞劃痕實驗研究AL-8對HepG2細(xì)胞遷移的影響,見圖9。由圖9可見,細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,對照組約67.95%的劃痕寬度被HepG2細(xì)胞占據(jù)。在用不同濃度AL-8處理的藥物干預(yù)組中,隨著AL-8濃度的增加,細(xì)胞占有率從29.56%、11.41%下降到6.79%。表明AL-8能有效抑制HepG2細(xì)胞的遷移,從而阻止腫瘤細(xì)胞的擴散。

3.7 抗血管生成作用實驗結(jié)果

鵪鶉胚絨毛尿囊膜模型可以作為多種疾病表型的篩選模型,具有實驗周期短、成本低、通量高等優(yōu)點,在評價血管生成時的優(yōu)勢尤為明顯。對照組與給予不同濃度AL-8干預(yù)組的鵪鶉胚絨毛尿囊膜見圖10。由圖10可見,AL-8干預(yù)對血管生成的抑制作用明顯,AL-8干預(yù)組血管壁變薄,血管數(shù)量顯著減少。血管面積的定量結(jié)果見圖11。由圖11可見,隨著AL-8濃度的增加,對血管生成的抑制作用也愈加明顯,呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。綜上所述,化合物AL-8具有明顯的抗血管生成作用。

注:A.vehicle;B.DMSO;C.alkannin;D.linifanib;E.10 μmol·L-1 AL-8;F.20 μmol·L-1 AL-8;G.40 μmol·L-1 AL-8;H.80 μmol·L-1 AL-8。

圖11 不同濃度AL-8處理的qCAM血管面積

4 討論

本研究基于拼合原理設(shè)計、合成了6個結(jié)構(gòu)新穎的紫草素-利尼伐尼抗腫瘤衍生物,并對其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證與體外抗腫瘤活性評價,篩選出高效、低毒的抗腫瘤衍生物AL-8,其對HepG2的抑制活性和對肝正常細(xì)胞L02的安全性均優(yōu)于母體化合物紫草素和利尼伐尼。細(xì)胞染色和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,AL-8能顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果表明,AL-8能抑制腫瘤細(xì)胞遷移。鵪鶉胚絨毛尿囊膜血管生成實驗結(jié)果表明,AL-8能有效抑制血管新生,使新形成的血管壁變得更薄,血管數(shù)量更少,強于最佳濃度的利尼伐尼和紫草素。

綜上所述,本實驗得到了抗腫瘤活性與安全性均佳的優(yōu)勢化合物AL-8,探討了其作用機制,為利尼伐尼和紫草素的進(jìn)一步衍生化與具有HCC治療潛力先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供了借鑒。