響應(yīng)面法優(yōu)化草烏甲素納米乳的制備工藝

何雨曉,李麗云,孫文強(qiáng),丁江生*,周云龍

1.云南中醫(yī)藥大學(xué),昆明 650500;2.云南省藥物研究所,昆明 650111;3.云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,昆明 650111

草烏甲素是從毛莨科烏頭屬植物滇西嘟拉(A-conitumbulleyanumDiels)中分離出的生物堿——滇西嘟拉堿甲(bulleyaconitine A),屬于二萜雙酯型生物堿,是一種強(qiáng)效鎮(zhèn)痛劑和抗炎劑,在臨床上有廣泛的治療效果,可用于治療由各種原因?qū)е碌穆蕴弁?、癌性疼痛、頸肩痛、腰腿痛等[1-4]。國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的制劑類型有片劑、口服液、注射劑和膠丸劑?，F(xiàn)有的給藥方式仍存在一些問題,如草烏甲素對(duì)黏膜、肌肉等組織具有較強(qiáng)的刺激性,注射時(shí)局部會(huì)長時(shí)間劇烈疼痛,口服時(shí)胃腸道不良反應(yīng)較明顯;草烏甲素是雙酯型生物堿,有毒并且治療窗較窄,生物半衰期短,而目前的制劑都是速釋制劑,血藥濃度波動(dòng)比較大,無法保證用藥的安全性和有效性[5]。

納米乳是由水、油、表面活性劑和助表面活性劑按適當(dāng)比例混和而自發(fā)形成的膠體分散體系,既具親脂性又具親水性,與角質(zhì)層的細(xì)胞間脂質(zhì)雙分子層有較高的相容性,可穿透角質(zhì)層進(jìn)入體循環(huán)而發(fā)揮全身治療作用[6-7]。納米乳作為經(jīng)皮給藥載體,可顯著增加難溶性藥物的溶解度,大大加快藥物的透皮速度。納米乳可作為經(jīng)皮給藥的載體,用于治療各種疾病,如阿爾茨海默病、帕金森病、骨質(zhì)疏松癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等[8]。此外,納米乳液滴的結(jié)構(gòu)特殊,使經(jīng)皮給藥后藥物釋放的時(shí)間更長、血藥濃度更加平穩(wěn)[9]。Box-Behnken響應(yīng)面法是將多項(xiàng)式方程與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合結(jié)合的一種方法,與傳統(tǒng)優(yōu)化分析相比,Box-Behnken響應(yīng)面法具有用較簡單的實(shí)驗(yàn)就能確定研究的自變量與因變量之間相互作用的優(yōu)點(diǎn)[10-11]。因此,與傳統(tǒng)的優(yōu)化分析相比,其使用的試劑和材料更少,并且節(jié)省時(shí)間[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)用加水滴定法和微流化均質(zhì)制備草烏甲素納米乳,以單因素考察結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化草烏甲素納米乳的處方,并對(duì)其粒徑分布、穩(wěn)定性和體外透皮性能進(jìn)行評(píng)價(jià),為草烏甲素制劑的研發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

PL203型電子天平[梅特勒托利多科技(中國)有限公司];STX1202ZH型電子天平(奧豪斯儀器有限公司);1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);TF2RJ-100-DLZS-SB-ZJD61型真空乳化攪拌機(jī)(溫州天富機(jī)械有限公司);MS-H280-Pro型磁力攪拌器[亞速旺(上海)商貿(mào)有限公司];NANO型微射流均質(zhì)機(jī)(諾澤流體科技有限公司);BIC 90 Plus型激光粒度儀(美國布魯克海文儀器公司);JEM2100型透射電鏡(日本電子株式會(huì)社)。

1.2 試藥

草烏甲素對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院);草烏甲素(云南淶文生物科技有限公司);中鏈三酰甘油(MCT油,青島海智源生命科技有限公司);油酸(山西晉湘輔料有限公司);聚氧乙烯40氫化蓖麻油(RH-40)、蓖麻油聚烴氧酯35(HEL-35),均購自北京鳳禮精求醫(yī)藥股份有限公司;辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(labrasol)、二乙二醇單乙醚(transcutol P),均購自嘉法獅(上海)貿(mào)易有限公司。

2 方法

2.1 草烏甲素在輔料中平衡溶解度測定的方法學(xué)考察

2.1.1草烏甲素對(duì)照品溶液的制備 精密稱量草烏甲素對(duì)照品粉末20 mg,置于100 mL量瓶中,用混合均勻的流動(dòng)相溶液(三乙胺∶乙腈=6∶4)溶解并定容,即得草烏甲素對(duì)照品溶液。

2.1.2色譜條件 色譜柱:Kromasil 100-5 C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:質(zhì)量濃度0.2 mg·mL-1三乙胺[用磷酸調(diào)節(jié)pH值至(3.1±0.1)]-乙腈(60∶40);進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:30 ℃;檢測波長:260 nm;流速:1 mL·min-1。

2.1.3線性關(guān)系考察 精密吸取2.1.1項(xiàng)下制備的草烏甲素對(duì)照品溶液5、50、250、500、1 000、2 500、5 000、7 500 μL,分別置于10 mL量瓶中,用流動(dòng)相定容后制成0.1、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、150.0、200.0 μg·mL-1的系列質(zhì)量濃度草烏甲素對(duì)照品溶液,按照2.1.2項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定,以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行線性回歸,得到回歸方程:y=33.252x+8.954 9,R2=0.999 5,草烏甲素質(zhì)量濃度在0.100～200.400 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4精密度實(shí)驗(yàn) 吸取2.1.3項(xiàng)下制備的20.0、50.0、100.0 μg·mL-1的草烏甲素對(duì)照品溶液,按照2.1.2項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積,并計(jì)算日內(nèi)精密度RSD;連續(xù)3 d進(jìn)樣檢測,計(jì)算日間精密度RSD。計(jì)算得20、50、100 μg·mL-1的草烏甲素對(duì)照品溶液日內(nèi)精密度的RSD分別為0.178%、0.473%、0.063%(n=6);日間精密度的RSD分別為0.012%、0.28%、0.22%(n=6)。

2.1.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.1.1項(xiàng)下配制的草烏甲素對(duì)照品溶液,按照2.1.1項(xiàng)下的色譜條件,分別放置0、2、4、6、8、10、12、24 h后,測定草烏甲素的峰面積,計(jì)算得平均RSD為1.03%,表明供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.1.6回收率實(shí)驗(yàn) 精密量取2.1.3項(xiàng)下制備的20、50、100 μg·mL-1草烏甲素對(duì)照品溶液,置于100 mL量瓶中,分別置于100%處方對(duì)應(yīng)的輔料量各3份,置于恒溫振蕩儀中振蕩48 h(37 ℃),超聲約1 h使其完全溶解,靜置冷卻至室溫,以8 000 r·min-1離心。取上清液1 mL,分別置于10 mL量瓶中,用混合的流動(dòng)相定容,再用0.45 μm微孔濾膜過濾,搖勻,按照2.1.2項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定,記錄峰面積,測定含量并計(jì)算回收率。計(jì)算得低、中、高質(zhì)量濃度的平均回收率為100.01%,RSD為1.06%(n=3),符合相關(guān)規(guī)定。

2.2 草烏甲素在輔料中溶解度的測定

取過量的草烏甲素置于試管中,分別依次加入油相、乳化劑和助乳化劑2 g,超聲至不再溶解,放置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩48 h。取出靜置,以8 000 r·min-1離心。取上清液1 mL,分別置于10 mL量瓶中,用混合的流動(dòng)相定容,再用0.45 μm微孔濾膜過濾,用HPLC法進(jìn)行含量測定,測定草烏甲素在不同溶劑中的溶解度,見表1。由表1可知,草烏甲素在油相中的溶解度:油酸>MCT油>大豆油>肉豆蔻酸異丙酯(isopropyl myristate)>油酸乙酯>棕櫚酸異丙酯(palmitic acid isopropyl ester);在乳化劑中的溶解度:RH40>labrasol>HEL-35>吐溫80;在助乳化劑中的溶解度:transcutol P>丙二醇。因此,選擇油酸作為油相,RH40作為乳化劑,transcutol P作為助乳化劑,用偽三元相圖進(jìn)一步篩選。

表1 草烏甲素在不同溶劑中的溶解度

2.3 偽三元相圖的繪制

用加水滴定法建立草烏甲素納米乳的偽三元相圖,對(duì)于每個(gè)相圖,先將乳化劑和助乳化劑按照不同的比例(Km,1∶1、2∶1、3∶1、4∶1)進(jìn)行混合得到混合乳化劑,再將混合乳化劑和油相以1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的比例進(jìn)行混合,在55 ℃用磁力攪拌器攪拌,轉(zhuǎn)速為1 000 r·min-1,逐漸向混合體系中滴加純化水,當(dāng)混合體系達(dá)到濁點(diǎn),即體系由澄清變?yōu)闇啙?繼續(xù)攪拌溶液又可以恢復(fù)澄清狀態(tài)時(shí),依次記錄各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù),用Origin Pro 2019軟件繪制偽三元相圖,比較所形成的微乳區(qū)面積的大小以確定Km值,見圖1。由圖1可見,當(dāng)乳化劑RH40和助乳化劑transcutol P的比例為1∶1時(shí),繪制的偽三元相圖形成的微乳區(qū)面積最大,故確定1∶1為乳化劑和助乳化劑的最佳質(zhì)量比,由于用加水滴定法制備的納米乳只是粗乳,故還需要用微射流均質(zhì)機(jī)進(jìn)行均質(zhì)。

注:A.Km=1∶1;B.Km=2∶1;C.Km=3∶1;D.Km=4∶1。

2.4 微射流均質(zhì)制備納米乳

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)初步得到納米乳的制備方法,按照處方量,先將草烏甲素溶于油相,再與乳化劑混合后用磁力攪拌器攪拌,一邊不斷滴加純化水,攪拌1 h,攪拌溫度為55 ℃,攪拌速度為1 000 r·min-1。置于高剪切乳化機(jī)中以一定速度剪切45次,形成初乳。將剪切好的初乳用微射流均質(zhì)機(jī)以20 000 psi的壓力均質(zhì)6次,即得納米乳。

2.5 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化草烏甲素納米乳的制備工藝

2.5.1Box-Behnken響應(yīng)面法的實(shí)驗(yàn)方案 用Design-Expert 10.0軟件對(duì)草烏甲素納米乳的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化,經(jīng)過單因素實(shí)驗(yàn)篩選,以油相的比例(A)、混合乳化劑的比例(B)、均質(zhì)壓力(C)為自變量,草烏甲素納米乳的粒徑為響應(yīng)值,用3因素3水平響應(yīng)面法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),建立回歸模型,確定草烏甲素納米乳的最佳制備工藝,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表2,具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面法的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

表3 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

2.5.2模型擬合和統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算多項(xiàng)式方程的系數(shù)以預(yù)測響應(yīng)變量的值?；貧w方程為粒徑=104.454+16.785A-16.307 5B-10.005C-9.002 5AB-0.137 5AC-1.227 5BC-3.073 25A2+3.361 75B2+3.771 75C2。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表4。建立的回歸模型F=171.63,P<0.000 1,表明此方程的回歸模型擬合良好,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,R2=0.995 5,變異系數(shù)(coefficient of variation)=1.80%,表明該模型擬合度良好,實(shí)驗(yàn)方法可靠,實(shí)驗(yàn)誤差較小;F失擬值=0.240 1,P=0.864 6>0.05,表明該模型失擬值不顯著,實(shí)驗(yàn)中的未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾較小,該模型可用于預(yù)測和分析實(shí)際的數(shù)據(jù)。

表4 回歸模型方差分析結(jié)果

2.5.3響應(yīng)面法分析交互作用 用Design-Expert 10.0軟件繪制二維等高線圖及三維響應(yīng)面圖,在其中1個(gè)因素不變的條件下,分析另外2個(gè)因素之間的交互作用對(duì)草烏甲素納米乳粒徑的影響,以確定草烏甲素納米乳的最佳制備工藝,結(jié)果見圖2。曲面和等高線的形狀不同,交互效應(yīng)的強(qiáng)弱也不同。交互項(xiàng)的等高線圖越接近橢圓形,且曲面圖越陡峭,表明交互作用越強(qiáng)。由圖2可見,油相的比例(A)與乳化劑的比例(B)之間的交互作用顯著,且油相對(duì)草烏甲素納米乳的制備工藝影響較大,形成的三維響應(yīng)面圖較陡峭。

注:A.油相和乳化劑比例的響應(yīng)面圖;B.均質(zhì)壓力和乳化劑比例的響應(yīng)面圖;C.油相比例和均質(zhì)壓力的響應(yīng)面圖;D.油相比例和乳化劑比例的等高線圖;E.乳化劑比例和均質(zhì)壓力的等高線圖;F.油相比例和均質(zhì)壓力的等高線圖。

2.5.4最優(yōu)處方及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)模型擬合結(jié)果,草烏甲素納米乳的最佳制備工藝為油相的比例為8%、乳化劑的比例為11%、均質(zhì)壓力為28 000 psi,得到的最佳粒徑為60.25 nm。

按照最優(yōu)處方制備3批草烏甲素納米乳,進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),測得納米乳粒徑與預(yù)測值(60.25 nm)的偏差分別為1.72%、0.87%、1.12%,表明所建立的數(shù)學(xué)模型可以準(zhǔn)確預(yù)測草烏甲素納米乳的最優(yōu)處方。

2.6 納米乳的粒徑和形態(tài)

吸取0.1 mL草烏甲素納米乳,用純化水稀釋100倍,用BIC 90 Plus型激光粒度儀測量納米乳液的平均粒徑、多分散系數(shù)和Zeta電位。結(jié)果表明,草烏甲素納米乳的粒徑為(60.55±0.88) nm,多分散系數(shù)為(0.233±0.22),Zeta電位為(-28.5±0.34) mV。草烏甲素納米乳的粒徑分布及Zeta電位見圖3。

取適量的草烏甲素納米乳,用去離子水稀釋,滴在覆蓋有碳膜的銅網(wǎng)上,滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的磷鎢酸染色2 min,用濾紙吸取多余的溶液,自然晾干后再置于透射電子顯微鏡下觀察納米乳液的形態(tài)[11],見圖4。由圖4可見,形成的納米乳液滴外觀圓整,大小均一。

圖4 透射電鏡圖

2.7 草烏甲素納米乳的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將草烏甲素納米乳液分別置于4、25、60 ℃下保存,并于5、10、15、30、60 d分別測定粒徑,分析其穩(wěn)定性。結(jié)果見圖5。

圖5 不同儲(chǔ)存時(shí)間和溫度下粒徑的變化

由圖5可見,儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)草烏甲素納米乳的粒徑有影響,隨著時(shí)間的延長,粒徑增大,這是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長,出現(xiàn)了奧斯特熟化現(xiàn)象,表現(xiàn)為納米乳液開始出現(xiàn)聚集現(xiàn)象,納米乳的粒徑逐漸增大,使得乳液的穩(wěn)定性降低,并且溫度越高,奧斯特熟化現(xiàn)象越嚴(yán)重,納米乳的粒徑越大,穩(wěn)定性下降得越快。因此,在低溫條件下儲(chǔ)存才能防止奧斯特熟化現(xiàn)象的發(fā)生,制備的納米乳在4 ℃下儲(chǔ)存60 d穩(wěn)定性良好,表明草烏甲素納米乳應(yīng)置于低溫條件下儲(chǔ)存。

2.8 草烏甲素納米乳的體外透皮實(shí)驗(yàn)

先將Strat-M膜裝在供給池與接收池之間,再將適量草烏甲素納米乳加入Strat-M膜內(nèi),在接收池中加入接收液至刻度線,注意用超聲排除氣泡。接收液為9 g·L-1氯化鈉溶液(溶劑為體積分?jǐn)?shù)60%乙醇),磁力攪拌速度為400 r·min-1,水浴加熱溫度為(32±0.1) ℃。分別于2、4、6、8、12、24 h取樣,每次取樣7 mL,同時(shí)補(bǔ)加7 mL接收液。樣品溶液用0.45 μm濾膜過濾,用高效液相色譜法測定其中草烏甲素的含量,并計(jì)算累積透皮量(Qn)。

其中Qn為累積透皮量,Cn為第n個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品的質(zhì)量濃度,V為接收池體積,Ci為第i個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品的質(zhì)量濃度,Vo為每次取樣的體積。

以Qn對(duì)時(shí)間(t)作圖,見圖6,并對(duì)曲線中的直線部分進(jìn)行線性回歸,將數(shù)據(jù)分別用零級(jí)方程、一級(jí)方程、Higuchi方程擬合,見表5。由表5可見,草烏甲素納米乳在24 h內(nèi)的釋放數(shù)據(jù)均符合一級(jí)方程,表明所制備的草烏甲素納米乳具有緩釋效果。納米乳中草烏甲素24 h的累積透皮量為(260.851 2±7.763 9) μg·cm-2。

圖6 草烏甲素納米乳體外透皮單位面積內(nèi)的累積透過量

表5 草烏甲素納米乳的3種模型擬合結(jié)果

3 討論

納米乳液可以用高能法和低能法2種方法制備,高能法包括高壓均質(zhì)法、微流態(tài)化和超聲波法,低能法包括反相乳化法和自納米乳化法。低能乳化法需要耗費(fèi)大量的油相和乳化劑,而高能乳化法如用微射流均質(zhì)器在低濃度的油相和乳化劑下就能產(chǎn)生穩(wěn)定的納米乳劑,并且粒徑更小、更穩(wěn)定。與均質(zhì)器相比,微流化器產(chǎn)生的納米乳劑的粒度分布更窄[14]。另外,微流化器在低濃度的表面活性劑下可產(chǎn)生穩(wěn)定的納米乳劑。因此,本研究用微射流均質(zhì)制備納米乳,得到粒徑更小、更穩(wěn)定的納米乳。

根據(jù)斯托克斯定律,液滴的直徑越小,重力分離速度越慢,乳狀液的穩(wěn)定性越好[15],所以以乳狀液的平均直徑為指標(biāo)來確定合適的均質(zhì)壓力、油相比例和乳化劑比例。用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化草烏甲素納米乳的制備工藝時(shí)發(fā)現(xiàn),隨著油相比例的增加,納米乳的粒徑先減小后增大,原因可能是油相的比例越大,意味著要覆蓋的油/水界面越大,體系中乳化劑的量不足以覆蓋新形成的液滴,這可能會(huì)導(dǎo)致液滴直徑的增大。納米乳的平均粒徑隨著乳化劑加入量的減少而逐漸減小,原因可能是當(dāng)助乳化劑加入量增大時(shí),水相的比例較大,導(dǎo)致乳滴不穩(wěn)定,存在合并現(xiàn)象[16]。均質(zhì)壓力和循環(huán)次數(shù)的增加往往會(huì)伴隨著納米乳液溫度的上升。研究表明,高壓均質(zhì)過程中樣品溫度的升高通過影響納米乳液的性質(zhì)(液滴直徑、黏度和界面張力)而影響納米乳液的穩(wěn)定性[17]。所以在制備納米乳時(shí)不能一味地增加均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)。此外,在加工過程中,高的均質(zhì)壓力、均質(zhì)次數(shù)和溫度可能會(huì)導(dǎo)致草烏甲素降解成烏頭堿和次烏頭堿。因此,為了最大限度地減少納米乳中草烏甲素的損失,選擇不超過30 000 psi的均質(zhì)壓力和不超過10次的均質(zhì)循環(huán)進(jìn)行研究。

研究結(jié)果顯示,角質(zhì)層屏障是藥物透皮的主要障礙[18],與其他載體相比,納米乳具有更好的透皮作用[19],這是因?yàn)榧{米乳具有較低的表面張力,易于濕潤皮膚,可使角質(zhì)層結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,增加脂質(zhì)雙分子層的流動(dòng)性,破壞水性通道以及降低其屏障作用[20],并且納米乳的直徑很小,有良好的流動(dòng)性,且能與皮膚細(xì)胞產(chǎn)生水合作用,可有效促進(jìn)小分子藥物的透皮吸收、緩釋、降低藥物刺激[21]。草烏甲素納米乳體外滲透性好還與transcutol P有關(guān),transcutol P可以很容易地穿透角質(zhì)層,并與細(xì)胞間路徑發(fā)生水合作用,以改善活性藥物成分的皮膚滲透性[22],而且還能改變角質(zhì)層蛋白質(zhì)和脂肪分子的流動(dòng)性,即降低皮膚屏障功能,利于藥物的透皮吸收[23]。