雷公藤甲素柔性納米脂質(zhì)體的體外抗炎活性及透皮性能研究

劉美秀,付林可,周 丹,袁曉峰,韓江帆,葉威良*

1.空軍軍醫(yī)大學藥學系藥劑學與藥事管理學教研室,西安 710032;2.空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,西安 710032;3.西安市第九醫(yī)院藥劑科,西安 710054

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種常見的自身免疫性疾病,易引起關(guān)節(jié)畸形及運動功能喪失,給患者帶來巨大痛苦,從而降低患者的生活質(zhì)量[1-2]。我國RA患者多達480萬,且患病率呈逐年上升的趨勢[3]。雖然臨床上對RA的治療手段在不斷地更新,但是RA的臨床致殘率依然較高。因此,探尋新的RA治療手段是臨床的迫切需求。

雷公藤甲素(triptolide,TP)又稱雷公藤內(nèi)酯醇,屬于二萜內(nèi)酯類。中藥雷公藤治療RA具有確切的療效,而TP是中藥雷公藤抗RA最主要的活性成分[4]。RA患者單核巨噬細胞異?；罨?分泌大量炎癥因子,直接導致炎癥損傷。白細胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)在RA發(fā)病中的主要作用是促進滑膜纖維母細胞和軟骨細胞產(chǎn)生前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)和膠原酶,進而導致關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)的破壞。白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)能增強IL-1和TNF-α的局部效應,增加B細胞產(chǎn)生類風濕因子的量。研究表明,TP能顯著抑制體外培養(yǎng)的巨噬細胞中炎癥因子TNF-α、IL-6、環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)的表達[5]。此外,有研究發(fā)現(xiàn)TP能降低關(guān)節(jié)炎大鼠外周血中TNF-α的水平,推測TP可能通過促進破骨細胞凋亡,降低RA患者的骨損失,從而緩解RA的癥狀[6-7]。但TP在體內(nèi)的非特異性分布,使其在正常組織中有大量分布,而在炎癥關(guān)節(jié)部位藥物濃度有限,造成藥物的高毒低效現(xiàn)象。因此,構(gòu)建合適的藥物載體將TP選擇性地遞送到RA炎癥部位,對提高TP治療RA的效果具有重要意義。

透皮給藥是一種十分有發(fā)展前景的給藥方式,它能夠克服傳統(tǒng)口服和靜脈給藥方式的缺陷,但皮膚的天然屏障作用極大地降低了藥物的透皮性能。目前,化學促透劑(如醇類、氮酮類等)和物理方法(如微針法和超聲等)常用于提高皮膚的藥物滲透性能,但這些透皮方法極易造成皮膚的不可逆損傷,且藥物的皮膚滲透率依舊不高[8]。柔性納米脂質(zhì)體(flexible nanoliposomes,FNLs)是一種多功能的藥物載體,與傳統(tǒng)脂質(zhì)體相比,具有高度可變形性,可有效促進藥物進入皮膚,并將大量的藥物儲留在皮膚組織內(nèi),形成藥物儲庫,使藥物在局部發(fā)揮持久的治療作用[9]。FNLs以水合梯度為驅(qū)動力,借助自身的高度變形能力,穿過比自身粒徑小得多的皮膚孔道,可高效地將藥物遞送至皮膚組織[10-12]。本文擬利用薄膜分散法制備TP-FNLs,并對其進行表征。用熒光顯微鏡觀察RAW 264.7細胞對TP-FNLs的攝取情況。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測定TP-FNLs對RAW 264.7細胞炎癥因子分泌的影響。用離體大鼠皮膚考察TP-FNLs的體外透皮性能。本研究旨在開發(fā)一種新的TP新型透皮制劑,從而為RA的治療奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司);5804R型冷凍離心機(德國Eppendorf公司);DHG-914A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);JEM-1200EX型透射電子顯微鏡(日本電子株式會社);AR2140型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、超聲波清洗儀均購自河南省鞏義市予華儀器有限責任公司;Delso Nano C型納米粒度/Zeta電位分析儀(美國Beckman Coulter公司);RYJ-6B型藥物透皮擴散實驗儀(上海黃海藥檢儀器有限公司)。

1.2 試藥

(2,3-二油?；?丙基)-三甲基氯化銨(N-[1-(2,3-dioleoyloxy) propyl]-N,N,N-trimethylammonium methyl-sulfate,DOTAP,美國Avanti Polar Lipids公司);膽固醇(北京金客隆生物技術(shù)有限公司);甲氨蝶呤、去氧膽酸鈉、吐溫80、膽酸鈉均購自百靈威科技有限公司;甲醇、氯仿均為色譜級,均購自廣東省汕頭市西隴化工股份有限公司;去離子水為自制。

1.3 細胞與動物

小鼠單核白血病巨噬細胞RAW 264.7,購自武漢普諾賽生命科技有限公司;雄性SD大鼠,體質(zhì)量約為200 g,購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心。

2 方法

2.1 TP-FNLs的制備及評價

2.1.1TP-FNLs的制備 取一定量的DOTAP、CHOL、TP置于茄形瓶內(nèi),用6 mL甲醇-三氯甲烷(3∶1)超聲溶解,于40 ℃條件下旋蒸1 h,去除有機溶劑,待瓶壁上形成均勻薄膜后,真空干燥1 h,置于-20 ℃冰箱中過夜。加入5 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)與一定量的膜軟化劑,水化2 h,隨后反復4次,過0.22 μm濾膜,即得。

2.1.2包封率的計算 取1 mL TP-FNLs,置于10 mL量瓶中,加入甲醇破乳、定容,超聲15 min后,測定TP的總質(zhì)量濃度(Mt)。另取1 mL TP-FNLs置于透析袋中,透析12 h后,取透析液置于10 mL量瓶中,用甲醇定容,超聲15 min破乳,測定TP的質(zhì)量濃度(My)。計算TP-FNLs的包封率(Me)。Me=(My/Mt)×100%。

2.2 TP-FNLs的表征

2.2.1粒徑分布及Zeta電位 取TP-FNLs適量,加水稀釋,用Delso Nano C型納米粒度/Zeta電位分析儀測定其粒徑、Zeta電位和PDI,平行測定3次。

2.2.2透射電鏡觀察 取TP-FNLs,加水稀釋后,用20 mg·mL-1磷鎢酸溶液負染,滴于銅網(wǎng)上,自然晾干,置于透射電鏡下觀察。

2.2.3變形性考察 取TP-FNLs,加水稀釋后,在一定壓力和時間下擠壓通過50 nm微孔濾膜,測定濾液體積以評估FNLs的變形性。

2.3 TP-FNLs穩(wěn)定性的考察

分別用去離子水、pH 7.4的PBS以及含有100 mg·mL-1胎牛血清的PBS溶解一定量的TP-FNLs,隨后將各納米粒溶液分別置于37 ℃保存。于1、12、24、48 h測定TP-FNLs溶液的粒徑和Zeta電位。

2.4 TP-FNLs釋藥性的考察

分別配制pH 7.4和pH 6.0的PBS緩沖液。稱取5 mg TP-FNLs溶于1 mL釋放介質(zhì)中,隨后加入透析袋(截留相對分子質(zhì)量5 000)中,并將透析袋放入裝有20 mL相同釋放介質(zhì)的離心管中,置于37 ℃水浴中孵育。在不同時間點,取出1 mL釋放介質(zhì),同時補加新的、相同的釋放介質(zhì)。將取出的溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后,用HPLC法測定TP的釋放量,計算TP的累積釋放量。

2.5 TP-FNLs的細胞攝取研究

為了觀察TP-FNLs在巨噬細胞內(nèi)的攝取情況,用Rho B標記TP-FNLs。取12孔細胞培養(yǎng)板,鋪上圓形蓋玻片,將RAW 264.7細胞接種于12孔板中,接種密度為3×104個·孔-1。在細胞培養(yǎng)箱中放置24 h后,加入TP-FNLs,繼續(xù)培養(yǎng)30 min或2 h,用pH 7.4的PBS洗滌3次,用體積分數(shù)4%多聚甲醛固定15 min,加入100 ng·mL-1的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)溶液染色5 min,用pH 7.4的PBS洗滌3次,用甘油封片后,置于熒光顯微鏡下觀察FNLs的分布情況。

2.6 細胞炎癥因子的檢測

將RAW 264.7細胞接種于6孔板中,細胞密度為2×106個·孔-1,置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,棄去培養(yǎng)基,加入2 mL含有脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。隨后棄去培養(yǎng)基,加入2 mL含有游離TP或TP-FNLs的新鮮培養(yǎng)基。24 h后取培養(yǎng)基上清,用ELISA測定IL-1β、IL-6和TNF-α等細胞炎癥因子的水平。

2.7 體外透皮實驗

2.7.1體外皮膚累積滲透量 取適宜的大鼠離體皮膚(有效皮膚面積為0.636 cm2),固定于Franz池中,放入接收液[生理鹽水-乙醇(4∶1)混合液],接收池保持(32±1) ℃恒溫水浴,攪拌速度為400 r·min-1,平衡15 min后,更換新的接收液。隨后取500 μg·mL-1的TP-FNLs溶液1 mL分2次均勻涂布于大鼠皮膚表面,并于1、4、8、12、24、36 h取200 μL接收池液體,及時補加等體積的新鮮接收液。以TP水溶液作為參比制劑。

2.7.2體外皮膚滯留量 取2.7.1項下經(jīng)過36 h體外透皮實驗后的離體皮膚,用生理鹽水沖洗皮膚的內(nèi)、外表面,吸干皮膚表面的水分,剪碎后制備皮膚勻漿;加入3 mL提取溶劑(丙酮∶甲醇=3∶1),渦旋2 min,以1 500 r·min-1離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)移至具塞塑料離心管中。此提取過程重復2次,合并2次提取液,用氮氣吹干。用甲醇復溶,渦旋2 min,離心后吸取上清,用HPLC法測定皮膚中藥物的滯留量[12]。

3 結(jié)果

3.1 TP-FNLs的表征結(jié)果

3.1.1包封率、粒徑及Zeta電位 TP-FNLs的粒徑為(178±13) nm,PDI為(0.237±0.021),Zeta電位為(12.39±1.8) mV,包封率為(56.3%±4.1%)。TP-FNLs的粒徑分布較窄,見圖1。

3.1.2透射電鏡觀察 TP-FNLs的透射電鏡圖見圖2。由圖2可見,TP-FNLs呈梭形,大小均一,且無聚集現(xiàn)象。

3.1.3變形性考察 TP-FNLs混懸液在一定壓力下經(jīng)一定時間可順利地通過50 nm微孔濾膜,而作為對照的等粒徑正常脂質(zhì)體在相同壓力和時間下則很少通過50 nm微孔濾膜,表明TP-FNLs具有較好的變形性。結(jié)果見圖3。

3.2 TP-FNLs穩(wěn)定性的研究結(jié)果

將TP-FNLs置于不同的介質(zhì)中孵育,測定粒徑及Zeta電位,考察其體外穩(wěn)定性。結(jié)果見圖4。在48 h內(nèi),TP-FNLs的粒徑在水中、PBS中及含有100 mg·mL-1FBS的PBS中均未發(fā)生明顯變化,表明在48 h內(nèi),TP-FNLs能穩(wěn)定存在于3種不同的介質(zhì)中,見圖4A。在48 h內(nèi),TP-FNLs在水中、PBS中及含有100 mg·mL-1FBS的PBS中的Zeta電位均未發(fā)生明顯改變,表明在48 h內(nèi),3種介質(zhì)對TP-FNLs的Zeta電位沒有影響,見圖4B。

注:A.粒徑的變化;B.Zeta電位的變化。

3.3 TP-FNLs釋藥性的研究結(jié)果

TP-FNLs在不同pH值介質(zhì)中TP的累積釋放率見圖5。由圖5可見,在釋藥1 h后,TP-FNLs在2種介質(zhì)中都有輕微的突釋現(xiàn)象,藥物突釋率分別為15.6%、21.6%,導致突釋的主要原因是部分藥物存在于納米粒表面,由于TP在酸性環(huán)境中具有更好的溶解性,故TP-FNLs在pH 6.0的環(huán)境中,突釋率比在pH 7.4中性介質(zhì)中更高。在釋放12 h后,TP-FNLs在2種介質(zhì)中持續(xù)釋放,在48 h后,TP-FNLs中TP的釋放基本達到平臺期,幾乎不再釋放。最終,TP-FNLs中TP的釋放量在pH 6.0和pH 7.4介質(zhì)中分別為91.4%、72.6%。在整個釋放過程中,TP-FNLs中的TP在酸性介質(zhì)中的釋放率均高于在pH 7.4中性介質(zhì)中的釋放率。這是由于脂質(zhì)材料DOTAP在酸性環(huán)境中具有更好的溶解性,使FNLs具有酸敏釋藥特性。

注:與pH7.4相比,*P<0.01。

3.4 TP-FNLs細胞攝取的研究結(jié)果

用熒光顯微鏡觀察TP-FNLs的細胞攝取行為,見圖6。由圖6可見,隨著藥物與細胞共孵育時間的延長,細胞內(nèi)的紅色熒光強度逐漸增強,表明RAW 264.7細胞對TP-FNLs能夠時間依賴性地有效內(nèi)吞。

圖6 熒光顯微鏡觀察RAW 264.7細胞對Rho B標記的TP-FNLs的攝取情況

3.5 TP-FNLs抗炎活性的研究結(jié)果

用ELISA檢測游離TP和TP-FNLs抑制活化巨噬細胞炎癥因子的表達,見圖7。由圖7可見,當用LPS刺激RAW 264.7細胞后,TNF-α、IL-6、IL-1β的表達水平均上調(diào),當給予游離TP和TP-FNLs后,TNF-α、IL-6、IL-1β的表達水平均明顯降低,且TP-FNLs的抑制效果顯著優(yōu)于TP。

注:與LPS相比,*P<0.01;與TP相比,#P<0.01。

3.6 體外透皮實驗結(jié)果

3.6.1體外皮膚累積滲透量結(jié)果 36 h后,TP-FNLs中TP的皮膚累積滲透量為(397.08±29.61) μg·cm-2,而游離TP的皮膚累積滲透量為(88.34±9.66) μg·cm-2。TP-FNLs中TP的36 h皮膚累積滲透量約為游離TP的4.5倍,表明與游離TP相比,TP-FNLs可有效提高TP的皮膚滲透量。結(jié)果見圖8。

圖8 TP-FNLs和TP在體外皮膚的累積滲透曲線 (n=4)

3.6.2體外皮膚滯留量結(jié)果 36 h后,TP-FNLs中TP的皮膚滯留量為(46.56±0.39) μg·cm-2,而游離TP的皮膚滯留量為(10.93±0.61) μg·cm-2,TP-FNLs中TP的皮膚滯留量約為游離TP的4倍。

4 討論

TP在水中的溶解度低,在腸胃中不易被吸收且易被代謝,生物利用度很低,因此考慮將其制成經(jīng)皮給藥制劑,但由于其不易透過角質(zhì)層,故直接經(jīng)皮給藥也不易被吸收[13]。FNLs制劑具有較好的生物相容性,更容易透過皮膚角質(zhì)層[14-16]。基于此,本研究擬將TP包裹在FNLs載體中。研究結(jié)果顯示,制備的TP-FNLs的粒徑為(178±13) nm、PDI為(0.237±0.021)、Zeta電位為(12.39±1.8) mV、包封率為(56.3%±4.1%);透射電鏡結(jié)果顯示TP-FNLs呈梭形,且具有良好的變形性。

體外釋藥結(jié)果顯示,TP-FNLs的釋藥行為具有pH依賴性。TP-FNLs在pH 6.0的酸性介質(zhì)中TP的釋放速度顯著快于在pH 7.4中性介質(zhì)中,且釋放量多。TP-FNLs酸敏特性的釋藥特點可有效增加其在體循環(huán)中的穩(wěn)定性,而在炎癥微酸環(huán)境下,可以選擇性地發(fā)生藥物釋放,從而保證了遞送系統(tǒng)的高效、低毒。TP-FNLs具有酸敏釋藥特性,主要是因為TP是一種弱堿性藥物,它在酸性條件下的溶解度更大,所以在pH 6.0釋放介質(zhì)中擴散得更快,藥物釋放速度也更快。部分TP可能是通過靜電吸附于脂質(zhì)體表面,在酸性條件下,TP從其表面迅速解吸附[17]。細胞攝取實驗結(jié)果表明,TP-FNLs可時間依賴性地被RAW 264.7細胞攝取,進而發(fā)揮抗炎活性。ELISA結(jié)果顯示,與游離TP相比,TP-FNLs可顯著降低相關(guān)炎癥因子的分泌,表明TP-FNLs具有強大的抗炎作用,進而可有效治療RA[18-19]。

體外皮膚滲透性實驗結(jié)果表明,與游離TP相比,TP-FNLs的皮膚滲透性更好,TP-FNLs中TP的36 h皮膚累積滲透量約為游離TP的4.5倍。而皮膚滯留實驗結(jié)果顯示,36 h后,TP-FNLs中TP的皮膚滯留量約為游離TP的4倍。表明TP-FNLs中的藥物能夠很好地穿透角質(zhì)層,而且TP-FNLs中的藥物可以大量滯留于皮膚中,使藥物具有長效、緩釋的特性。而游離TP則不能有效進入皮膚,藥物皮膚滲透量和滯留量均大大降低。表明FNLs具有明顯的經(jīng)皮滲透優(yōu)勢,適合作為藥物的經(jīng)皮滲透載體。

綜上所述,本研究以FNLs為載體,促進TP的透皮吸收,實現(xiàn)了TP皮膚局部給藥,并具有緩釋特性,增加了使用的安全性。