大花肋柱花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

韓達(dá)斌,李維業(yè),劉學(xué)良,劉安平,蘇 媛,汪永明,劉海青,牛貴姍,問 靜,徐文勝

1.青海省藥品審評核查中心,西寧 810007;2.西寧市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心,西寧 810007;3.三普藥業(yè)有限公司,西寧 810016

目前,大花肋柱花雖然在藏藥制劑中應(yīng)用廣泛,但與同屬藥材輻狀肋柱花相比,其相關(guān)研究較少。為了保證藥材質(zhì)量,本研究建立了大花肋柱花的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn),包括顯微鑒別、獐牙菜苦苷和當(dāng)藥苷的薄層鑒別,并用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)對大花肋柱花中的主要有效成分獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷進(jìn)行了定量分析,建立了質(zhì)量控制方法,為其開發(fā)利用和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀;Waters 2998 PDA detector型二極管陣列檢測器(美國沃特斯有限公司);ME204 梅特勒-托利多電子天平[感量0.01 mg,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];XS105DU梅特勒-托利多超越系列專業(yè)型XS分析天平(感量0.01 mg,瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司);BX43+DP26生物顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社);SB25-12DT新芝超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);Milli-Q2355超純水機(jī)(美國密理博公司)。

1.2 試藥

對照品:獐芽菜苦苷(批號110785-201404,含量為98.3%)、當(dāng)藥苷(批號111742-200501,含量為99.27 %)均購自中國食品藥品檢定研究院;實(shí)驗(yàn)用甲醇、乙醇均為色譜純,購自德國默克公司;磷酸為色譜純,購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;水為超純水。5批實(shí)驗(yàn)用大花肋柱花經(jīng)劉海青主任藥師鑒定為龍膽科肋柱花屬植物大花肋柱花Lomatogoniummacranthum(Diels et Gilg) Fern.的干燥全草。詳細(xì)信息見表1。

表1 樣品信息表

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

在顯微鏡下觀察大花肋柱花(編號DHLZH-001)粉末可見,綠色或粉色的色素塊隨處散在;木纖維甚多,成束散在;花粉粒較多,為圓球形或類圓形,直徑約為30 μm,有 3 個萌發(fā)孔,外壁較厚;導(dǎo)管多見,具螺紋、梯紋和網(wǎng)紋,以螺紋導(dǎo)管為主,單個或數(shù)個成群,排列整齊,多碎斷,直徑為8～40 μm;莖表皮細(xì)胞表面呈類長方形。木栓細(xì)胞呈長方形,壁厚。大花肋柱花粉末的顯微鑒別圖見圖1。

注:A.色素塊;B.纖維;C.花粉粒;D.螺紋導(dǎo)管;E.表皮細(xì)胞;F.木栓細(xì)胞。

2.2 薄層色譜鑒別

樣品溶液的制備:取本品粉末0.5 g,加甲醇25 mL,超聲處理(250 W,50 kHz)30 min,濾過,取續(xù)濾液,即得。

對照品溶液的制備:精密稱取獐牙菜苦苷對照品10 mg,置于10 mL量瓶中,加甲醇至刻度,混勻,制成1 mg·mL-1的對照品溶液。

照薄層色譜法[2020年版《中華人民共和國藥典》,以下簡稱《中國藥典》四部通則0502]實(shí)驗(yàn),吸取上述5種溶液各5 μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-甲醇-水溶液(30∶10∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,再噴以100 g·L-1硫酸乙醇溶液,加熱至斑點(diǎn)顯色清晰,置于紫外光燈365 nm處檢視,結(jié)果見圖2。由圖2可見,供試品色譜中,在與獐牙菜苦苷對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。

注:S.獐牙菜苦苷對照品;1～5.樣品

2.3 浸出物的測定

取各批次大花肋柱花粉末約2 g(過3號篩) ,精密稱定,以體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇為提取溶劑,按照2020年版《中國藥典》四部(通則2201) 浸出物測定法項下的熱浸法測定。經(jīng)測定大花肋柱花浸出物含量分別為29.84%、27.37%、32.47%、36.44%、33.25%,平均值為31.95%。

2.4 含量測定

2.4.1色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) Waters SunFirODS C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。乙腈(A)-5 mL·L-1磷酸(B)溶液為流動相,進(jìn)行梯度洗脫,0～15 min,10%～15% A;15～22 min,15%～20% A;22～35 min,20%～35% A;35～40 min,35%～60% A;40～42 min,60% A;42～45 min,60%～10% A;45～50 min,10% A。流速為1.0 mL·min-1;檢測波長為254 nm;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。在此色譜條件下,獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷與樣品中其他成分的分離度大于1.5,理論板數(shù)不低于5 000。見圖3。

注:A.空白溶劑;B.對照品;C.供試品;1.獐芽菜苦苷;2.當(dāng)藥苷。

2.4.2對照品溶液的制備 精密稱取獐芽菜苦苷對照品17.50 mg、當(dāng)藥苷對照品8.11 mg,分別置于50、10 mL量瓶中,加甲醇超聲使溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對照品儲備溶液,再分別取2、3 mL置于25 mL量瓶中,加甲醇超聲使溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷質(zhì)量濃度分別為0.206 43、0.025 76 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.4.3供試品溶液的制備 取本品粉末(過3號篩)約0.2 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,超聲處理30 min(功率為250 W,頻率為50 kHz),取出,放至室溫,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.4.4線性關(guān)系考察 按上述色譜條件,分別精密稱定獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷對照品,用甲醇配制成不同質(zhì)量濃度的系列混合對照溶液:獐芽菜苦苷0.121 3、 0.242 7、 0.364 0、0.485 4、 0.606 7、 0.800 8 mg·mL-1;當(dāng)藥苷0.010 2、 0.025 5、 0.040 8、 0.066 2、0.081 5、 0.110 1 mg·mL-1,每次進(jìn)樣10 μL,注入液相色譜儀,測得峰面積。以對照品峰面積的對數(shù)值為縱坐標(biāo)(y)、對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),用外標(biāo)兩點(diǎn)法計算并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性回歸分析,計算回歸方程及線性范圍,計算得獐牙菜苦苷的回歸方程為y1= 807 636x1+1 319,線性范圍為0.121 3～0.800 8 mg·mL-1,r=0.999 6;當(dāng)藥苷的回歸方程為y2= 1 242 369x2+ 79,線性范圍為0.010 2～0.110 1 mg·mL-1,r=0.999 4。結(jié)果表明2種成分在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.5精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取上述2種混合對照品溶液,按2.1項下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,進(jìn)樣量為10 μL,記錄峰面積。計算得獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷峰面積的RSD值分別為0.23%、0.39%,表明儀器的精密度良好。

2.4.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液(編號DHLZH-001),按照2.1項下的色譜條件分別于0、2、4、8、16、24 h進(jìn)行測定,進(jìn)樣量均為10 μL,記錄峰面積。計算得獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷峰面積的RSD值分別為0.38%、0.56%,表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取大花肋柱花樣品(編號DHLZH-001)6份,按照2.3項下的方法制備成供試品溶液,按照2.1項下的色譜條件進(jìn)樣檢測。計算得獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷的平均含量分別為5.421%、0.443%,其RSD值分別為0.20%、0.08%。結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.4.8加樣回收實(shí)驗(yàn) 稱取大花肋柱花樣品(編號DHLZH-001)6份,每份0.1 g,精密稱定,置于錐形瓶中,在每組中分別加入適量獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷對照品,按2.3項下的方法制成供試品溶液。按照2.1項下色譜條件進(jìn)行分析,測定上述成分的含量,計算回收率。計算得獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷的平均回收率分別為97.43%、98.02%,RSD值為1.87%、2.95%(n=6),表明該本方法的回收率良好。見表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4.9樣品含量測定 各批次大花肋柱花粉末各取0.2 g,精密稱定,按照2.3項下方法制備供試品溶液,按照2.1項下色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜圖并計算各批次大花肋柱花中獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷2種待測成分的含量。計算得5批次大花肋柱花中獐芽菜苦苷含量為5.42%～9.38%、當(dāng)藥苷含量為0.44%～1.25%,見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果 (n=5)

3 討論

3.1 目標(biāo)成分的選擇

獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷在檢測中有很好的分離度、重復(fù)性、穩(wěn)定性等,故選擇獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷作為大花肋柱花的檢測指標(biāo)來進(jìn)行研究,可以有效控制該藥材的內(nèi)在質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)過程中還嘗試開展了大花肋柱花中馬錢苷酸、蘆丁、當(dāng)藥黃素、木犀草素、槲皮素等化學(xué)成分的含量測定實(shí)驗(yàn),但由于含量較低不建議作為大花肋柱花的定量檢測指標(biāo)。

3.2 色譜條件的選擇

對2種待測成分的甲醇溶液進(jìn)行全波長掃描,結(jié)果顯示在254 nm處有最大吸收;實(shí)驗(yàn)過程中分別對乙腈-5 mL·L-1磷酸溶液、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-1 mL·L-1磷酸溶液等流動相進(jìn)行考察,最終確定以乙腈-5 mL·L-1磷酸為流動相系統(tǒng);實(shí)驗(yàn)對系統(tǒng)流速、柱溫、流動相比例及不同色譜柱進(jìn)行考察,最后確定流速為1.0 mL·min-1、柱溫為30 ℃、色譜柱型號為Waters SunFir ODS C18柱,在此條件下樣品含量結(jié)果的重復(fù)性好。通過對不同極性溶劑、提取方法、提取時間等因素進(jìn)行考察,確定樣品提取以甲醇為溶劑、超聲處理效率最高,提取時間確定為30 min。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對大花肋柱花進(jìn)行了顯微鑒別、TLC鑒別以及醇溶性浸出物等檢查項的考察,并首次建立了用HPLC法同時測定大花肋柱花中2種主要有效成分含量的方法,并進(jìn)行了方法學(xué)考察,其中顯微鑒別和TLC鑒別可以作為該藥材的定性鑒別方法,由于樣本量及藥材來源的差異性,本研究以略低于最低測定值設(shè)限,初步擬定大花肋柱花中醇溶性浸出物的含量不得少于 25.0%,獐芽菜苦苷、當(dāng)藥苷2種待測成分的含量分別不少于5.0%、0.4%。該方法簡便、高效、準(zhǔn)確,可用于大花肋柱花的質(zhì)量控制。本法為全面評估大花肋柱花的質(zhì)量和新藥研究、開發(fā)提供了一定的參考。