無花果病毒CP 基因克隆及遺傳多樣性分析

陳 偉 ，薛 婷 ，李亞娟 ，王瑞鑫 ，玉山江·麥麥提

（1.山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030004；2.銅仁市農(nóng)業(yè)科教信息站，貴州 銅仁 554300；3.西安國際陸港園林景觀有限公司，陜西 西安 710000；4.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830091）

無花果（Ficus caricaLinn.），別名品仙果，是?？崎艑僦参?，喜光不耐寒，對(duì)土壤、水分、溫度要求嚴(yán)格。無花果主要分布在阿拉伯、敘利亞、土耳其等地中海沿岸國家，唐代從波斯傳入中國[1]。我國無花果主要生產(chǎn)地區(qū)是山西、山東、陜西、新疆等。無花果作為重要的經(jīng)濟(jì)果木，所含營養(yǎng)豐富，應(yīng)用范圍廣，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高。在藥用方面，無花果可用作輕泄劑用于治療便秘，同時(shí)干果提取物經(jīng)處理后具有抗艾氏肉瘤的作用[2-3]。在經(jīng)濟(jì)價(jià)值方面，無花果果實(shí)可以加工制作成果干、果脯、飲料、罐頭等系列產(chǎn)品[4-5]。據(jù)聯(lián)合國糧食和農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計(jì)，2020 年中國無花果種植面積約為3 031 hm2，產(chǎn)量為18 121 t。隨著無花果的大面積種植，特別是無性繁殖苗木的廣泛推廣應(yīng)用，無花果的病毒病害日趨嚴(yán)重，嚴(yán)重影響無花果的產(chǎn)量和品質(zhì)。

無花果病毒最早是在美國的加利福尼亞被發(fā)現(xiàn)[6]，隨后在土耳其、日本、塞爾維亞、伊朗等地被報(bào)道。研究顯示，侵染無花果的病毒有5 種，分別是無花果斑點(diǎn)相關(guān)病毒（Fig fleck-associated virus，F(xiàn)FkaV）、無花果桿狀病毒1（Fig badnavirus 1，F(xiàn)BV-1）、無花果桿狀病毒2（Fig badnavirus 2，F(xiàn)BV-2）、無花果葉斑相關(guān)病毒4（Fig leaf mottle-associated virus 4，F(xiàn)LMaV-4）和無花果花葉病毒（Fig mosaic virus，F(xiàn)MV）[7-8]。其中，無花果花葉病毒(Fig mosaic virus，F(xiàn)MV)是一種負(fù)鏈RNA 病毒，被認(rèn)為是無花果花葉病的致病因子[9]。

FMV 通過營養(yǎng)繁殖和嫁接有效傳播，也可以通過Aceria ficus在植物間傳播[10]，目前暫沒有種子傳播的證據(jù)。感染FMV 的植株葉片表現(xiàn)出花葉、褶皺、褪綠斑駁、環(huán)斑、明脈、葉脈明化等癥[11-14]。FMV 的首次發(fā)現(xiàn)是在美國加利福尼亞州無花果植株的花葉上。隨后大量科研人員對(duì)無花果植株中的FMV 檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)FMV 的侵染率高達(dá)96%[15]，說明FMV 是無花果植株的一種重要病害。之后，ELBEAINO 等[16]首次發(fā)現(xiàn)FMV 有4 條負(fù)義單鏈RNA（-ssRNA），分別為RNA1～4。其中每條RNA均編碼一個(gè)開放閱讀框（ORF），其中最大為7 093 nt，其他大小分別為2 252、1 490、1 472 nt。然而在日本無花果收集的FMV 分離物JS1 中檢測(cè)到RNA5，長度為1 752 nt，包含一個(gè)ORF，編碼502 個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量大小為59 ku。JS1 的RNA6 長度為1 216 nt，ORF 編碼預(yù)測(cè)的232 個(gè)氨基酸，26 ku 蛋白質(zhì)[18]。無花果花葉病幾乎遍布于所有無花果種植區(qū)，是無花果生產(chǎn)中的一大威脅。因此，明確我國FMV 的遺傳多樣性、種群結(jié)構(gòu)、分子變異等信息，對(duì)設(shè)計(jì)有效的病毒防控策略至關(guān)重要。

本研究從山西省臨汾市采集被FMV 感染的無花果葉片，經(jīng)RT-PCR 獲得CP 基因，并進(jìn)行序列分析，通過分析FMV 分離株的遺傳變異和種群結(jié)構(gòu)，旨在為無花果花葉病毒的分類、分子特征、進(jìn)化機(jī)制以及致病機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與保存

在山西省臨汾市堯都區(qū)縣底鎮(zhèn)翟村無花果種植園內(nèi)（111.62°E，36.02°N），2019 年采集57 份無花果鮮嫩葉片，2020 年采集62 份，葉片置于冰盒中，24 h 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，一部分用于實(shí)驗(yàn)，另一部分保存于-80 ℃冰箱。

1.2 總RNA 提取和RT-PCR 擴(kuò)增

使用RNA 試劑盒提取樣品無花果葉片總RNA，PrimeScript RT 試劑盒合成cDNA，接著用Primier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物FMV-F（5′-CATCTCTC TAAGTCTAAGGAGAA-3′）和FMV-R（5′-AAC ATGAGCACTTGCAATCCTAT-3′），PCR 擴(kuò)增FMV 的外殼蛋白基因[19]。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收。將回收的目的條帶連接至pGEM-Teasy 載體中，篩選陽性菌落后送去測(cè)序。將陽性菌落送至公司測(cè)序。每條陽性條帶至少經(jīng)過3 次測(cè)序，3 次結(jié)果相同，則測(cè)序完成。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

將測(cè)序得到的12 個(gè)CP 基因,在NCBI 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行BLAST比對(duì)，根據(jù)其核苷酸一致性篩選并獲得37 條相似序列，使用MEGA 7.0 軟件對(duì)這49 條序列構(gòu)建進(jìn)化樹，進(jìn)行遺傳多樣性分析[20]。首先，從Models 中尋找最佳構(gòu)建模型T92+G+I，接著采用General Time Reversible 模型和Construct/Test Maximum Likelihood Tree（ML)方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值1 000，去掉低于50%的進(jìn)化數(shù)分支。

1.4 核酸相似性分析和氨基酸相似性分析

利用SDTv1.2 軟件分析49 個(gè)分離物CP 基因間的核苷酸相似性和氨基酸相似性分析。

基于49 個(gè)分離物CP 基因，使用Dna SP 5.10.01[21]軟件計(jì)算分離位數(shù)（S）、突變總數(shù)（T）、單倍型多樣性（Hd）、核苷酸序列差異的平均數(shù)（K）、核苷酸多樣性（π）、非同義突變（Ka）和同義突變數(shù)（Ks），以及非同義突變與同義突變的比率（Ka/Ks）。在試驗(yàn)中，若Ka/Ks 值在所有分離株中均大于1，表明它們處于正向選擇；反之，如果Ka/Ks＜1，則表明它們處于負(fù)向選擇或者稀薄狀態(tài)[22]。

1.5 種群差異分析

基于49 個(gè)分離物CP 基因，利用Dna SP 5.10.01軟件，分析種群內(nèi)部或種群間的基因流動(dòng)和遺傳分化。試驗(yàn)中，Ks*、Kst*、Z*、Snn[23]的P值小于0.05，則認(rèn)為存在遺傳差異性。Fst[24]值用于衡量49 個(gè)分離物間的遺傳分化程度，F(xiàn)st 的絕對(duì)值小于0.33，表明基因流動(dòng)頻繁。

1.6 群體進(jìn)化分析

運(yùn)用Dna SP 5.10.01 軟件進(jìn)行Tajima’s D、Fu & Li’s D 和Fu & Li’s F 的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，評(píng)估了分離位點(diǎn)的分子多樣性模式[25]。其中，Tajima’s D 檢驗(yàn)比較了核苷酸多樣性與多態(tài)位點(diǎn)的比例，在選擇中性下預(yù)期相等。Fu & Li’s D 是是基于單例數(shù)（突變?cè)谛蛄兄兄怀霈F(xiàn)一次）與突變總數(shù)之間的差異；Fu & Li’s F 檢驗(yàn)是基于單例數(shù)之間的差異和序列對(duì)之間的核苷酸差異的平均數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 FMV 的發(fā)生情況

2019—2020 年，在山西省臨汾市堯都區(qū)的無花果基地隨機(jī)采集119 份無花果葉片。2019 年采集57 份樣品，經(jīng)RT-PCR 檢測(cè)22 個(gè)葉片帶有FMV，其陽性檢出率為38.6%。2020 年采集62 份樣品，其中31 個(gè)樣品帶有FMV，陽性檢出率為50%。測(cè)序分析后獲得12 個(gè)新的FMV 分離物，分別命名為FMV1～FMV12(登錄號(hào)：SUB11540627)。

2.2 FMV 的系統(tǒng)進(jìn)化分析

本試驗(yàn)使用MEGA 7.0 軟件，基于CP 基因，對(duì)49 個(gè)分離物（37 個(gè)來自NCBI，12 個(gè)分離所得）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（圖1）。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，49 個(gè)分離物被分為6 組。其中，Group1 包括18 個(gè)分離物，分布于中國、土耳其、美國、加拿大和日本5 個(gè)國家；Group2 包括7 個(gè)分離物，分別來自于中國、美國、以色列；Group3 有2 個(gè)分離物，均分布在土耳其；Group4 包括14 個(gè)分離物，日本2 個(gè)、塞爾維亞5 個(gè)、俄羅斯3個(gè)、伊朗2 個(gè)、意大利1 個(gè)，另外1 個(gè)地理位置不確定；Group5 有3 個(gè)分離物，均來自于伊朗；Group6 有5 個(gè)分離物，分布在伊朗和俄羅斯。中國的12 個(gè)分離物被分到Group1、Group2，日本的分離物被分到Group1、Group4，美國、俄羅斯等國的分離物也被分到了不同的組，這表明FMV種群存在較高的遺傳多樣性，且地理位置可能不是影響FMV 分離物遺傳多樣性的主要原因。

圖1 基于CP 基因的49 個(gè)FMV 分離物系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of 49 FMV isolates based on CP gene

2.3 FMV 核苷酸和氨基酸序列相似性分析

49 個(gè)FMV 分離物基因序列一致性分析顯示，49 個(gè)CP 基因核苷酸一致率為91.41%～100%。AB697851.1 和 AB697852.1、 AB697851.1 和AB697855.1、AB697852.1 和AB697855.1 核苷酸同源性最高，為100%，MG880759.1 和MG880753.1核苷酸同源性最低，為91.41%。本研究分離物FMV8 與KC182500.1 核苷酸同源性最高，為99.85%，F(xiàn)MV5 與MG880759.1核苷酸同源性最低，為92.44%。49個(gè)CP基因氨基酸一致率為89.33%～100%。MG880753.1 和MG880759.1 的氨基酸相似性最低，為89.33%，本研究分離物FMV1 與MG880759.1 氨基酸相似性最低，為93.33%。上述結(jié)果表明，F(xiàn)MV 的CP 基因存在一定多樣性，但是在進(jìn)化中高度保守，突變率較低（圖2）。

圖2 CP 序列同一性二維分布Fig.2 Identity plot of nucleotide sequence（A）and amino acid sequence（B）

2.4 FMV 群體遺傳學(xué)分析

49 個(gè)分離物CP 基因序列分析表明，Group4 的分離位點(diǎn)數(shù)（S=65）和突變總數(shù)（T=66）最高，然而單倍體多樣性（Hd=0.967）低于其他5 組。Group4 的平均CP 核苷酸差異數(shù)（K=16.055）和核苷酸多樣性（π=0.023 79）最高，Group3 的平均CP核苷酸差異數(shù)（K=1.000）和核苷酸多樣性（π=0.001 48）最低。另外，在49 個(gè)分離物中，為了估計(jì)對(duì)編碼區(qū)的選擇性約束程度，分別計(jì)算了非同義突變/同義突變的比率，Ka/Ks 值在0～0.25，且Ka/Ks 值均小于1。隨著基因組在不同區(qū)域的變化，表明49 個(gè)分離物CP 基因的氨基酸的位置呈負(fù)向選擇（表1）。

表1 6 組分離物遺傳多樣性Tab.1 Genetic diversity of isolates in six groups

2.5 FMV 種群差異分析

使用Ks*、Z*、Kst*和Snn統(tǒng)計(jì)確定了49個(gè)FMV分離物組內(nèi)和組間的基因流動(dòng)和遺傳分化（表2）。結(jié)果顯示，49 個(gè)分離物Snn 值均小于0.05，確定分離物之間存在遺傳差異性。組內(nèi)的Fst 值均小于0，說明組內(nèi)分化程度較低。組間的Fst 值均大于0，表明組間分化程度較高。組內(nèi)Fst 值明顯小于組間，說明組間分化程度高于組內(nèi)，種群分化主要來源于組間。而組間所有的Fst 值均大于0.33，表明群體之間的基因流動(dòng)頻率非常低。

表2 FMV 群體遺傳差異性分析Tab.2 Genetic differences analysis of FMV populations

2.6 FMV 的群體進(jìn)化分析

本研究采用Tajima′s D、Fu & Li′s D、Fu &Li′s F 這3 種方法統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)評(píng)估了FMV 分離位點(diǎn)的分子多樣性模式（表3）。結(jié)果顯示，除Group2 為正值外，其他大多數(shù)各組的Tajima′s D、Fu & Li′s D、Fu & Li′s F 的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)值均為負(fù)值，說明FMV種群極大可能處于擴(kuò)張狀態(tài)。

表3 FMV 分離物的群體進(jìn)化分析Tab.3 Population evolutionary analysis of FMV isolates

3 結(jié)論與討論

本研究采集了119 個(gè)樣品，經(jīng)RT-PCR 檢測(cè)，篩選獲得了12 個(gè)分離物，經(jīng)生物信息學(xué)分析，明確了FMV 存在較高的遺傳多樣性，且負(fù)向選擇可能是FMV 分子變異的重要原因，為FMV 生物防治奠定了理論基礎(chǔ)。

FMV 分離物遺傳多樣性與地理位置沒有密切聯(lián)系。地理上遙遠(yuǎn)的分離物之間的密切遺傳關(guān)系可能是由于繁殖無花果材料的國際運(yùn)輸造成的長距離遷徙[26]。中國山西的分離物分布在Group1 和Group2，可能至少有1 個(gè)分離株被獨(dú)立引入[27]。通過系數(shù)Fst 評(píng)估遺傳分化程度和基因流，本試驗(yàn)49 個(gè)FMV 分離物組間分化程度高且差異顯著。植物病毒主要利用特定載體進(jìn)行植物間傳播[28]。無花果繁殖方式是營養(yǎng)繁殖，大多是扦插。這為病毒有效轉(zhuǎn)移和維持后代提供了機(jī)會(huì)。

從遺傳學(xué)角度分析，F(xiàn)MV 病毒是典型的RNA病毒，CP 基因全長675 bp。RNA 病毒復(fù)制容易出錯(cuò)而導(dǎo)致的高突變率，F(xiàn)MV 缺乏校對(duì)活性[29]。RNA 編碼區(qū)施加的不同選擇壓力也是導(dǎo)致遺傳變異差異的重要原因。因此，在面對(duì)足夠的選擇壓時(shí)，F(xiàn)MV 能夠進(jìn)行快速的進(jìn)化，這將提高控制FMV 的難度。為了提高無花果的產(chǎn)量和質(zhì)量，必須更加重視FMV 的配對(duì)。合理的預(yù)防和控制策略是預(yù)防和控制這種病毒的必要和重要手段。

種群水平上的3 種中性測(cè)試中，Tajima′s D、Fu & Li′s D、Fu & Li′s F 檢驗(yàn)均為負(fù)值，負(fù)向選擇似乎在種群擴(kuò)張中發(fā)揮了重要作用。在無花果園中有可能產(chǎn)生越來越多的遺傳分化分離株。負(fù)選擇也可能導(dǎo)致高毒力菌株的產(chǎn)生。CP 基因遺傳多樣性分析使得更加了解FMV 的感染和發(fā)生以及為FMV 的防治提供理論依據(jù)。