百香果苯丙氨酸解氨酶基因PePAL 克隆及表達(dá)分析

楊翠鳳，滕 崢，韋 春，劉正魯

（百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院/廣西芒果生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/亞熱帶特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)學(xué)院，廣西 百色 533000）

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是連接植物新陳代謝中初生代謝和次生代謝的橋梁，在植物木質(zhì)素、類黃酮、香豆酸酯類等次生代謝物的形成過(guò)程以及植物的抗逆調(diào)控中發(fā)揮重要作用[1]。PAL 屬于氨基裂解酶，由組氨酸裂解酶（HAL）家族突變進(jìn)化而來(lái)，PAL與HAL 的催化活性位點(diǎn)含有1 個(gè)共同的輔因子4-甲基二烯-咪唑-5-酮（MIO），通過(guò)內(nèi)部三肽區(qū)段Ala-Ser-Gly，經(jīng)過(guò)自環(huán)化脫水形成[2]。植物的PAL基因CDS 長(zhǎng)度通常2 100 bp 左右，包含1 個(gè)內(nèi)含子和2 個(gè)外顯子（裸子植物除外），編碼約700 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量大小在220～330 ku[3]。目前，研究人員已 成 功 從 木 薯（AF383152.1）、麻 瘋 樹（DQ883805.1）、蓖 麻（KF311063.1）及 甜 菜（AJ810175.1）等植物中克隆獲得該基因cDNA 序列全長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，該基因在不同植物中的氨基酸組成和分子質(zhì)量大小存在差異，如宋慕波等[4]克隆了荸薺的PAL基因，其cDNA 全長(zhǎng)2 485 bp，開放閱讀框（ORF）為2 142 bp，編碼713個(gè)氨基酸；潘文等[5]克隆獲得尾葉桉PAL基因全長(zhǎng)4 507 bp，氨基酸編碼序列為2 172 bp，內(nèi)含子為1 759 bp。PAL基因在植物不同器官中的時(shí)空表達(dá)具有組織特異性，也受生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的調(diào)控。朱海生等[6]研究表明，絲瓜LcPAL基因編碼的蛋白質(zhì)包含了PAL-HAL、PLN02457、phe_aml_yase 保守結(jié)構(gòu)域和1 段酶活性中心序列，為典型的Lyase_I_Like 超家族，該基因在絲瓜果實(shí)、花、莖、葉和根中均有表達(dá)。張文香等[7]研究表明，TcPAL基因在百蕊草葉和莖中表達(dá)量較高，根中表達(dá)量較少。喬楓等[8]在研究枸杞中PAL基因的表達(dá)特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，枸杞PAL基因在葉片中表達(dá)量最高，其次是花，且隨枸杞生長(zhǎng)表達(dá)量增加。而對(duì)云錦杜鵑PAL 活性進(jìn)行時(shí)空表達(dá)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在花苞中的PAL活性最高[9]。SHANG 等[10]的研究也證明了PAL 活性在黃瓜雌花和雄花中高于果等部位。隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)不同光因子調(diào)控[11-12]、機(jī)械損傷[13]、低溫[14]、干旱[15]、毒素處理[16]、病原菌感染[17-18]等脅迫均可誘導(dǎo)植物體內(nèi)PAL基因的表達(dá)。董春娟等[19]以黃瓜幼苗為研究對(duì)象，在低溫條件下，葉片中PAL基因的表達(dá)量顯著升高，其產(chǎn)物活性也有所提高。程春振等[20]利用少量紫外線對(duì)梁平柚果皮進(jìn)行照射處理，可誘導(dǎo)PAL 活性的增強(qiáng)。戢強(qiáng)強(qiáng)等[21]通過(guò)對(duì)6 個(gè)青蒿PAL 基因家族成員進(jìn)行順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，青蒿苯PAL 基因成員的啟動(dòng)子區(qū)域含有較多參與光響應(yīng)、逆境脅迫響應(yīng)、激素響應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的作用元件。可見，PAL 在植物的抗逆及生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要的作用，其在組織的含量水平、酶活性及基因表達(dá)量可作為衡量植物抗逆能力的指標(biāo)[22-23]。

花青素是植物各組織器官內(nèi)糖基化的多酚類化合物，是普遍存在于植物葉、花和果中的水溶性天然色素，具有類黃酮物質(zhì)所特有的“C6-C3-C6 三環(huán)”碳骨架結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)為3，5，7-甲基-2-苯基苯并吡喃，能使植物呈現(xiàn)不同顏色[24]?；ㄇ嗨氐暮铣傻孜锸?-氨基苯丙酸（Phenylalanine），又稱苯丙氨酸，其在2-氨基苯丙酸解氨酶的催化作用下生成β-苯丙烯酸（肉桂酸），因此，PAL 是花青素合成的起始酶?；ㄇ嗨卦谥参锏钟婢硶r(shí)同樣發(fā)揮著重要作用，既可抵抗病原菌侵染、蟲害侵染等生物因素脅迫，也可以抵抗紫外線輻射、低溫、旱災(zāi)等非生物因素脅迫[25-27]。

百香果（Passiflora edulisSims）屬攀緣型木質(zhì)藤本植物，果實(shí)多汁，富含多種水果香氣，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，經(jīng)濟(jì)效益顯著。當(dāng)前各地種植的栽培種按果色可分為黃金果、紫果或?yàn)閮烧叩碾s交后代[28]。目前，關(guān)于百香果PAL基因的研究較少，未見在分子方面進(jìn)行百香果PAL基因全長(zhǎng)克隆及其在不同品種不同組織中表達(dá)特異性研究的報(bào)道。鑒于此，擬利用RACE 技術(shù)克隆獲取PePAL基因cDNA 全長(zhǎng)，分析PePAL基因序列特征，然后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）測(cè)定其在不同品種不同組織中的表達(dá)量，為進(jìn)一步研究PePAL基因參與百香果花青素生物合成途徑以及百香果的分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

采集健康生長(zhǎng)的臺(tái)農(nóng)1號(hào)百香果嫩葉用于基因全長(zhǎng)克?。徊杉】瞪L(zhǎng)的臺(tái)農(nóng)1 號(hào)百香果（紫果）和大黃金、小黃金百香果（黃果）3 級(jí)蔓同一結(jié)果枝上的莖、葉、花瓣、果皮組織用于后續(xù)基因熒光定量PCR 試驗(yàn)。樣品采集后立即用液氮速凍，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取及cDNA合成

采 用 試 劑 盒 RNAprep Pure Plant Kit（TIANGEN，北京）抽提純化百香果各組織樣品總RNA，并用試劑盒PrimeScript TM RT Master Mix（TaKaRa，大連）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于后續(xù)基因克隆及基因表達(dá)分析。

1.3 PePAL基因的克隆

根據(jù)百色學(xué)院百香果病害研究團(tuán)隊(duì)前期獲得的候選基因unigene 序列，設(shè)計(jì)引物，以反轉(zhuǎn)錄cDNA 為模板，開展候選基因片段的PCR 擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證；按照SMARTer RACE 5′3′ Kit Protocol-At-A-Glance（TaKaRa，大連）操作指南進(jìn)行5′-RACE和3′-RACE 巢式PCR 擴(kuò)增，并將PCR 產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化、測(cè)序、拼接；設(shè)計(jì)ORF 擴(kuò)增引物，完成ORF的擴(kuò)增和測(cè)序驗(yàn)證。利用Vector NTI 11.0設(shè)計(jì)引物如下：PePAL-Unigene-F：5′-ATGGACCAGGGCGGCAATGGT-3′，PePAL-Unigene-R：5′-TCAGCTGATGGGAAGAGGAGC-3′，PePAL-3OUTER-F：5′-CTGTGGTTGGTTTACGCTCCTATATTTCCGAAGGTGCAGTTAT-3′，PePAL-3OUTER-R：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，PePAL-3INNER-F：5′-CACTTGGAAGAGAACCTGAAGCACGCGGTGAAGAACA-3′，PePAL-3INNERR：5′-CGGCGAGAACGAGAGCAACT-3′ ，PePAL-5OUTER-F：5′-GCATGGCGTCACATTGTGGTTCAGGAGCTTGGTTA-3′，PePAL-5OUTER-R：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，PePAL-5INNER-F：5′-TCAATCATCCGCTTCACCTCTTCC-3′ ，PePAL-5INNER-R：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′。將5′RACE 和3′RACE 測(cè)序結(jié)果用Vector NTI 11.0軟件進(jìn)行拼接獲得百香果PePAL基因cDNA 全長(zhǎng)。設(shè)計(jì)擴(kuò)增完整編碼框引物：PAL-ORF-F：5′-ATGGACCAGGGCGGCAATGGT-3′ 和 PAL-ORFR：5′-TCAGCTGATGGGAAGAGGAGC-3′。

1.4 生物信息學(xué)分析

利用BioXM 2.6 預(yù)測(cè)基因氨基酸序列；利用NCBI-protein blast 在線分析百香果PePAL與其他物種的同源性；利用ProtParam 預(yù)測(cè)PePAL 蛋白理化性質(zhì)；利用ProtScale 在線分析PePAL 蛋白疏水性；利用SignalP 4.1 Server 預(yù)測(cè)信號(hào)肽；利用TMHMM Server 2.0 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域；利用PSORT WWW Server 進(jìn)行PePAL 亞細(xì)胞定位分析；利用NetPhos 3.1 Server 分析PePAL 蛋白磷酸化位點(diǎn)；利用Motif Search 工具對(duì)推導(dǎo)的氨基酸序列預(yù)測(cè)膜內(nèi)在蛋白（MIP）結(jié)構(gòu)域；用SOPMA 軟件預(yù)測(cè)PePAL 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL 對(duì)PePAL 三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模；用Mega 5.05軟件構(gòu)建PePAL編碼氨基酸序列進(jìn)化樹。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

以臺(tái)農(nóng)1 號(hào)、大黃金和小黃金百香果3 級(jí)蔓同一結(jié)果枝上的莖、葉、花瓣和果皮的cDNA 為模板進(jìn)行分析。根據(jù)百香果PePAL基因序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物Y-PePAL-F：5′-GGCGAGAACGAGAGCAACT-3′，Y-PePAL-R：5′-CTAGCACTGTCTACCTCCTTGG-3′；以百香果Histone H3為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)內(nèi)參引物Y-His-F：5′-AGAGCCATGCAGTGTTGGCA-3′，Y-His-R：5′-CTTGGCGTGGATGGCACAGA-3′。PCR 反應(yīng)混合液配制：2×Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，F(xiàn)-primer（10 μmol/L）0.4 μL，Rprimer（10 μmol/L）0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。PCR 循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。加好樣后放在德國(guó)AnalytikJena qTOWERE3 熒光定量PCR 儀中進(jìn)行反應(yīng)。利用2-ΔΔCt法計(jì)算PePAL基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PePAL全長(zhǎng)cDNA克隆

經(jīng)5′-RACE 及3′-RACE 巢式PCR 擴(kuò)增、測(cè)序拼接及其ORF 測(cè)序驗(yàn)證（圖1），獲得百香果PePAL全長(zhǎng)cDNA序列。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)，該基因與其他植物PAL基因有較高同源性。PePAL基因cDNA 全長(zhǎng)2 499 bp，含有一個(gè)185 bp 的5′-端非翻譯區(qū)（5′-UTR）、一個(gè)190 bp 的3′-端非翻譯區(qū)（3′-UTR）和一個(gè)2 124 bp 的完整ORF。PePAL基因186—188 位為起始密碼子ATG，下游存在同框終止密碼子TGA和poly A尾。

圖1 百香果PePAL 5′RACE、3′RACE和編碼框的克隆產(chǎn)物Fig.1 The cloning products of 5′RACE，3′RACE and ORF of PePAL gene

2.2 PePAL基因編碼序列分析

用BioXM 2.6 對(duì)PePAL基因進(jìn)行分析，翻譯得到其編碼的蛋白質(zhì)序列。PePAL完整ORF 長(zhǎng)度為2 124 bp，編碼707 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為173.43 ku。無(wú)帶電荷氨基酸，無(wú)酸性和堿性氨基酸。非極性氨基酸1 145 個(gè)，占54.0%，親水性氨基酸1 543個(gè)，占72.7%。含量最多的氨基酸是丙氨酸（Ala），達(dá)27.4%，含量最少的氨基酸是半胱氨酸（Cys），占比22.2%（表1）。PePAL蛋白等電點(diǎn)為4.92，原子總數(shù)為22 051，分子式簡(jiǎn)寫為C6315H10508N2124-O2632S472，無(wú)負(fù)電殘基（Asp+Glu）和正電殘基（Arg+Lys）。脂肪族系數(shù)為27.35，不穩(wěn)定指數(shù)為44.96，總平均親水性為0.775。

表1 PePAL編碼的總氨基酸成分分析Tab.1 Analysis of total amino acid components encoded by PePAL

2.3 PePAL蛋白親疏水性分析及信號(hào)肽預(yù)測(cè)

利用在線軟件Proscale（http：//web.expasy.org/proscale）分析百香果PAL 蛋白的親疏水性，如圖2所示，正值代表疏水性，負(fù)值代表親水性。在氨基酸第510 位時(shí)，其疏水性達(dá)到高峰，最大值為2.411；在氨基酸第114 位時(shí)，親水性達(dá)到高峰，最大值為-2.733；按照親水性越高則負(fù)值越大，反之相反的標(biāo)準(zhǔn)，可以預(yù)測(cè)出PePAL 蛋白為親水性蛋白。利用在線軟件SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）預(yù)測(cè)PePAL 蛋白的信號(hào)肽，結(jié)果如圖3 所示，C-max 位點(diǎn)為24，C-score=0.145；Ymax 位點(diǎn)為24，Y-score=0.125；S-max 位點(diǎn)為4，Sscore=0.154；D=0.116，SP=‘NO’，說(shuō)明百香果PAL蛋白沒(méi)有信號(hào)肽，不是分泌性蛋白。

圖2 PePAL蛋白親疏水性分析Fig.2 Hydrophilicity analysis of PePAL protein

圖3 PePAL蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of PePAL protein signal peptide

2.4 PePAL蛋白亞細(xì)胞定位及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

經(jīng)PSORT WWW Server 預(yù)測(cè)分析，PePAL 蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核的可能性最高，達(dá)35%，其次為葉綠體，可能性為30%，位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜的可能性均為20%，而位于線粒體、液泡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的可能性僅為10%。利用NetPhos 3.1 Server在線預(yù)測(cè)PePAL 蛋白磷酸化位點(diǎn)，已知閾值大于0.5，證明該位點(diǎn)磷酸化，如圖4 所示，絲氨酸（S）磷酸化位點(diǎn)有30個(gè)，蘇氨酸（T）磷酸化位點(diǎn)有21個(gè)，絡(luò)氨酸（Y）磷酸化位點(diǎn)有7個(gè)。

圖4 PePAL蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of phosphorylation site of PePAL protein

2.5 PePAL蛋白的Motif分析

利用Motif Search 工具（http：//www.genome.jp/tools/motif/）對(duì)推導(dǎo)的PePAL 氨基酸序列進(jìn)行生物學(xué)意義的位點(diǎn)分析，在54—530 位點(diǎn)預(yù)測(cè)到了一個(gè)Lyase_aromatic 結(jié)構(gòu)域，在189—205 位點(diǎn)含有標(biāo)志性的GTITASGDLVPLSYIAG 酶活性中心序列，ASG是典型的保守區(qū)域（圖5）。

圖5 PePAL蛋白的Motif分析Fig.5 Motif analysis of PePAL protein

2.6 PePAL蛋白二級(jí)與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用SOPMA 在線預(yù)測(cè)PePAL 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖6 所示，PePAL 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)由55.45%氨基酸殘基組成α 螺旋，8.63%氨基酸殘基組成延伸鏈，6.22%氨基酸殘基組成β轉(zhuǎn)角以及29.70%氨基酸殘基組成無(wú)規(guī)則卷曲，其中無(wú)規(guī)則卷曲將前三者連接起來(lái)。利用在線分析軟件SWISS-MODEL 對(duì)PePAL蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模（圖7）。

圖6 PePAL蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)各組成位置及空間構(gòu)型預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of positions and spatial configuration of secondary structure of PePAL protein

圖7 PePAL蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型Fig.7 Prediction model of tertiary structure of PePAL protein

2.7 PePAL基因進(jìn)化樹分析

為研究PePAL與其他植物PAL基因的進(jìn)化關(guān)系，用Clastal W 將PePAL所編碼的氨基酸序列與其他植物PAL基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，采用MEGA 5.05 的相鄰法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖8所示，百香果PePAL與毛白楊（Populus tomentosa）、毛果楊（Populus trichocarpa）、川楊（Populus szechuanica）、胡楊（Populus euphratica）的PAL基因聚為一類，表明百香果PePAL與楊屬（Populus）植物的PAL基因親緣關(guān)系較近。

圖8 PePAL基因進(jìn)化樹分析Fig.8 Analysis of PePAL gene evolutionary tree

2.8 PePAL在不同品種及不同組織中的相對(duì)表達(dá)量分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，以百香果Histone H3為內(nèi)參基因，分析了PePAL在臺(tái)農(nóng)1 號(hào)百香果（TN）、大黃金百香果（DHJ）、小黃金百香果（XHJ）中3 級(jí)蔓同一結(jié)果枝葉、花瓣、果皮、莖的表達(dá)情況。從圖9 可以看出，PePAL在不同品種百香果的同一結(jié)果枝上葉、花瓣、果皮、莖中均有表達(dá)，表達(dá)量均呈現(xiàn)出花瓣＞莖＞果皮＞葉的變化趨勢(shì)，但不同品種之間的不同組織表達(dá)量存在明顯差異，小黃金百香果中花瓣的表達(dá)量是葉的7 倍，臺(tái)農(nóng)一號(hào)百香果中花瓣的表達(dá)量是葉的149 倍，而大黃金百香果中花瓣的表達(dá)量是葉的798倍。

圖9 PePAL基因表達(dá)量分析Fig.9 Analysis of PePAL gene expression

3 結(jié)論與討論

植物PAL 一般都包含保守的PLN02457、phe_am_lyase、Lyase_aromatic 和PAL-HAL 結(jié)構(gòu)域，且大都含有GTITASGDLVPLSYIAG 酶活性中心序列，其中ASG 是植物PAL 最典型的保守區(qū)域[29]。對(duì)百香果PePAL 蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析，預(yù)測(cè)到其在54—530 位點(diǎn)存在一個(gè)Lyase_aromatic 結(jié)構(gòu)域，在189—205 位 點(diǎn) 含 有 標(biāo) 志 性 的GTITASGDLVPLSYIAG 酶活性中心序列，表明百香果PAL 是典型的苯丙氨酸解氨酶，屬PAL 蛋白質(zhì)家族的一員。NJ 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，百香果PePAL編碼的氨基酸序列與楊屬中的毛白楊、毛果楊、川楊等PAL基因具有較高的同源性，表明PAL作為苯丙烷代謝途徑的第1個(gè)關(guān)鍵酶在進(jìn)化過(guò)程中保持了足夠的遺傳穩(wěn)定性和演化趨同性，這與前人的研究結(jié)果一致[30-31]。

PAL 作為胞內(nèi)酶，在細(xì)胞水平上，其主要分布在植物微管組織細(xì)胞以及表皮下的細(xì)胞中[32]；此外，研究還發(fā)現(xiàn)，PAL 可在植物高爾基體囊泡和次生壁加厚層中定位到[33]。BARROS 等[34]利用13C 同位素標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，二穗短柄草PAL 通過(guò)其TAL 活性參與了近50%的木質(zhì)素合成，表明PAL 在木質(zhì)素合成途徑和細(xì)胞壁代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在亞細(xì)胞水平上，植物PAL 主要分布于細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及葉綠體等細(xì)胞結(jié)構(gòu)中[35-37]。本研究中百香果PePAL蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核、葉綠體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜等細(xì)胞器中。研究發(fā)現(xiàn)，不同的PAL 異構(gòu)酶亞細(xì)胞定位分析也會(huì)呈現(xiàn)出不同的結(jié)果，如煙草NtPAL1主要定位于細(xì)胞內(nèi)膜，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)肉桂酸的累積；而NtPAL2則主要定位于細(xì)胞質(zhì)，負(fù)責(zé)將積累的肉桂酸擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)中[38]。

大多數(shù)植物PAL基因在成熟的花和根部表達(dá)量較高，莖表達(dá)水平中等，而在成熟的葉片中幾乎不表達(dá)，表明植物PAL基因的表達(dá)具有組織器官特異性。百香果PAL基因與前人研究的黃芪[39]、夏枯草[40]、甘蔗[41]等植物PAL基因表達(dá)模式相同，在花中的表達(dá)量最高，其次是莖和果皮，在成熟的葉片表達(dá)量最低。推測(cè)可能是本研究克隆的百香果PAL更多地參與了花青素和木質(zhì)素的合成過(guò)程。通常植物的PAL 是由一個(gè)基因家族控制，不同的組織器官含有多種同工酶[42]，不同PAL 家族成員之間參與的代謝途徑不同，因此表達(dá)模式也會(huì)有所不同，如何瀟等[43]研究半夏PtPAL的表達(dá)量時(shí)發(fā)現(xiàn)，其在葉中表達(dá)量最高，其次是塊莖和根，花中表達(dá)量最低。

綜上，本研究利用RACE 技術(shù)克隆獲得的百香果PePAL基因cDNA 全長(zhǎng)2 499 bp，含有一個(gè)185 bp的5′-端非翻譯區(qū)和一個(gè)190 bp 的3′-端非翻譯區(qū)，完整開放閱讀框架為2 124 bp，編碼的氨基酸序列與楊屬中毛白楊、毛果楊、川楊、胡楊PAL基因編碼的氨基酸序列具有較高的同源性。PePAL 亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核、葉綠體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜等細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。PePAL在百香果同一結(jié)果枝上的葉、花瓣、果皮、莖中均有表達(dá)，基因表達(dá)量依次為花瓣＞莖＞果皮＞葉，表明該基因更多地參與了花青素和木質(zhì)素的合成過(guò)程。在百香果中是否存在PAL 家族基因，仍需進(jìn)一步研究。此外，今后可進(jìn)一步分析百香果果色或香氣合成途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)模式，為探明百香果PAL基因調(diào)控花青素、木質(zhì)素、香豆酸酯、苯甲酸甲酯等生物合成途徑提供生物學(xué)證據(jù)。