草莓葉枯病生防芽孢桿菌的分離鑒定及防效研究

梁 松，孟祥坤，，于 新，徐文鳳，邢芳芳，鄭樹林，李新柱，3，王 亮

（1.金正大生態(tài)工程集團(tuán)股份有限公司，山東 臨沭 276700；2.菏澤金正大生態(tài)工程有限公司，山東 菏澤 274000；3.廣東清遠(yuǎn)金正大農(nóng)業(yè)研究院有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 511500）

草莓（Fragaria ananassa）為薔薇科草莓屬多年生草本植物[1]，其果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高。近年來(lái)，我國(guó)草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，栽培面積逐年擴(kuò)大，但是隨著栽培面積不斷擴(kuò)大以及多年連作[2]，草莓葉部病害日漸嚴(yán)重，給草莓生產(chǎn)帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)。

草莓葉枯病是目前草莓種植區(qū)難以防治的一種葉部病害，一旦發(fā)病，嚴(yán)重影響植物的光合作用及養(yǎng)分利用，最終降低草莓的品質(zhì)及產(chǎn)量[3]。據(jù)報(bào)道，引起草莓葉枯病的病原菌主要包括擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsisspp.）[3]、炭疽菌屬（Colletotrichumspp.）[4]、擬莖點(diǎn)霉屬（Pseudopithomycesspp.）[5]、鏈格孢屬（Alternariaspp.）[6]、新擬盤多毛孢屬（Neopestalotiopsisspp.）[7]真菌、其中擬盤多毛孢屬和新擬盤多毛孢屬病原菌也可以引起草莓根腐病的發(fā)生[8-10]，如果不及時(shí)防治，輕則減產(chǎn)，重則絕收。

目前，防治草莓葉枯病的方法主要包括化學(xué)防治和生物防治，其中化學(xué)防治具有見效快、效果穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)，李忠峰等[11]研究發(fā)現(xiàn)，10%苯醚甲環(huán)唑WG 對(duì)該菌抑制效果顯著，并建議在鄭州地區(qū)草莓生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。但化學(xué)防治存在污染環(huán)境、對(duì)人畜有害等的缺點(diǎn)。生物防治是目前植物病害防治的研究熱點(diǎn)，具有非常廣闊的發(fā)展前景。相比于化學(xué)防治，生物防治具有不污染環(huán)境、對(duì)生物安全等優(yōu)勢(shì)[12-16]。芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）是一種重要的生防細(xì)菌，因其可以產(chǎn)生抵抗逆境的芽孢，現(xiàn)已成為工業(yè)生產(chǎn)上的主要菌屬。研究人員已經(jīng)篩選出多種拮抗植物病害的芽孢桿菌[17-20]，并且效果較好，具有良好的開發(fā)前景。在拮抗草莓病害方面，宋新娜等[21]從土壤中篩選到2 株對(duì)草莓枯萎病菌（Fusarium oxysoporum）具有較好生防效果的芽孢桿菌，經(jīng)鑒定其為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。付莉媛[22]從健康草莓根部土壤樣品中篩選拮抗草莓根腐病的生防菌，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）在對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制力。但是目前的文獻(xiàn)研究多側(cè)重于生防菌株的篩選，真正形成制劑的卻很少，故實(shí)際芽孢桿菌制劑生防效果研究也不夠完善。鑒于此，以山東臨沂區(qū)域草莓葉枯病菌（Neopestalotiopsis clavispora）為靶標(biāo)，從健康草莓根際土壤中分離篩選出對(duì)草莓葉枯病菌具有較好抑制效果的芽孢桿菌，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，研究其微生物制劑對(duì)草莓葉枯病的生防效果，同時(shí)對(duì)篩選得到的菌株進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，以期開發(fā)一種安全且對(duì)草莓葉枯病有較高防效的微生物菌劑。

1 材料和方法

1.1 供試材料

2022 年12 月于山東省臨沂市臨沭縣朱村草莓種植基地采集土壤；供試病原菌為草莓葉枯病菌（Neopestalotiopsis clavispora），由金正大生態(tài)工程集團(tuán)股份有限公司微生物部保存并提供。

供試草莓品種：紅顏。

供試農(nóng)藥：97%戊唑醇原藥購(gòu)于山東西亞化學(xué)有限公司。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）；細(xì)菌分離培養(yǎng)基（LB）；細(xì)菌種子培養(yǎng)基（LB 不加瓊脂）；細(xì)菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基：豆粕粉30 g/L，玉米淀粉10 g/L，玉米粉30 g/L，NaCl 5 g/L，MgSO45 g/L，CaCl22 g/L，KH2PO45 g/L。以上培養(yǎng)基均經(jīng)121 ℃高壓滅菌后使用。血平板購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 生防芽孢桿菌的分離篩選

生防芽孢桿菌的分離采用稀釋涂布平板法[23]，從山東省臨沂市臨沭縣朱村草莓種植基地選取健康草莓植株根際土壤，用無(wú)菌水制成10-4、10-5、10-6不同梯度的土壤懸浮液，分別取100 μL均勻涂布于LB 培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，挑取形似芽孢桿菌的單菌落置于4 ℃培養(yǎng)基中保存。

生防芽孢桿菌的篩選采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法[24]，取活化后直徑約為5 mm 的草莓葉枯病菌菌餅，接種于PDA 培養(yǎng)基中央，在距草莓葉枯病菌菌餅2.5 cm 處點(diǎn)接芽孢桿菌，以不接種芽孢桿菌為對(duì)照（CK），每個(gè)處理重復(fù)3 次。28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，7 d后計(jì)算抑菌率。抑菌率=（對(duì)照病原菌的直徑-對(duì)峙培養(yǎng)病原菌的直徑）/對(duì)照病原菌的直徑×100%。

1.3 生防芽孢桿菌的鑒定

1.3.1 生防芽孢桿菌的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》要求對(duì)生防芽孢桿菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。將生防芽孢桿菌劃線接種于LB平板上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察單菌落形態(tài)，經(jīng)革蘭氏染色后置于顯微鏡下觀察菌體及芽孢形態(tài)。

生理生化反應(yīng)測(cè)定：明膠液化試驗(yàn)、V-P 反應(yīng)、甲基紅反應(yīng)、淀粉水解酶及接觸酶反應(yīng)等參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》的方法進(jìn)行操作。

1.3.2 生防芽孢桿菌的分子生物學(xué)鑒定 參照Ezup 柱式細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]說(shuō)明書，提取細(xì)菌基因組DNA，作為模板，應(yīng)用細(xì)菌鑒定通用引物27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[25]。擴(kuò)增體系（50 μL）：2×PCRTaqMasteMix 25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 模板2 μL，雙蒸水補(bǔ)足到50 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察到明亮單一擴(kuò)增條帶后送至武漢擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，應(yīng)用NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行在線序列比對(duì)分析。選擇同源性較高的序列用MEGA 7.0 軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[12]。

1.4 生防芽孢桿菌菌劑制備

用無(wú)菌接種環(huán)從純化后的生防芽孢桿菌平板上挑取一環(huán)接種到細(xì)菌種子培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)18 h，備用。利用火焰接種法，接種量5%，將發(fā)酵好的細(xì)菌種子液接入20 L 液體發(fā)酵罐中，液體發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量10 L，37 ℃，200 r/min，通氣量1.5 m3/h，氣壓0.05 Mpa。每隔8 h 觀察芽孢的生成情況，直到芽孢率為95%以上，停止發(fā)酵。

將發(fā)酵好的菌液進(jìn)行離心，去上清液，將得到的菌泥加入適量的載體和保護(hù)劑放入65 ℃烘箱中進(jìn)行熱風(fēng)干燥，將干燥后的菌塊粉碎，過(guò)0.18 mm 篩網(wǎng)獲得菌粉，并采用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)，芽孢數(shù)計(jì)數(shù)方法為80 ℃水浴15 min后稀釋涂布計(jì)數(shù)。

1.5 生防芽孢桿菌菌劑離體葉片防效測(cè)定

參考朱杰等[26]的方法并加以改進(jìn)。選用大小相似的草莓葉片，消毒洗凈備用。根據(jù)制備的生防芽孢桿菌菌粉活菌數(shù)，制備1×106、1×107、1×108cfu/mL菌液，利用穿刺法刺傷葉片，在葉片傷口處接種20 μL 不同濃度的菌液，風(fēng)干后接種病原菌孢子懸浮液（1×105個(gè)/mL）20 μL，并設(shè)置清水對(duì)照(CK)及農(nóng)藥戊唑醇處理（質(zhì)量濃度為40 μg/mL），將處理后的葉片放入帶有濾紙的培養(yǎng)皿中，保濕培養(yǎng)，3 d 后觀察測(cè)定草莓葉片的發(fā)病情況及病斑大小。防治效果=（對(duì)照病斑直徑－處理病斑直徑）/對(duì)照病斑直徑×100%。

1.6 生防芽孢桿菌菌劑安全性測(cè)定

1.6.1 溶血試驗(yàn) 采用血平板法，將菌株接種于血平板上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察溶血現(xiàn)象[25]。

1.6.2 對(duì)作物安全性試驗(yàn) 利用盆栽法，對(duì)分離得到的草莓根腐病生防菌進(jìn)行安全性測(cè)定。配制1×109cfu/g 菌粉，將大小相似的小白菜幼苗移栽入盆，每盆取1 g菌粉稀釋500倍澆灌小白菜，清水作為對(duì)照（CK），30 d后測(cè)定小白菜的生長(zhǎng)指標(biāo)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，應(yīng)用Duncan’s 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防芽孢桿菌的分離篩選結(jié)果

試驗(yàn)共分離出220 株芽孢桿菌，通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)，獲得了5 株對(duì)草莓葉枯病菌具有較好抑制效果的芽孢桿菌，其抑菌率均大于70%。由表1和圖1可知，生防芽孢桿菌B125 的平板抑菌效果最好，抑菌率達(dá)到75.44%。

圖1 生防芽孢桿菌B125平板抑菌效果Fig.1 Antibacterial effect of antagonistic strain B125 on Neopestalotiopsis clavispora

表1 生防芽孢桿菌的分離篩選Tab.1 Isolation and screening of biocontrol Bacillus

2.2 生防芽孢桿菌B125的鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定及生理生化鑒定 菌株B125 在LB培養(yǎng)基上，菌落顏色為乳白色，不透明，邊緣不規(guī)則，易挑?。▓D2A）。對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色，發(fā)現(xiàn)菌體為革蘭氏陽(yáng)性菌，短桿狀（圖2B），能夠產(chǎn)生短桿狀芽孢（圖2C）。

圖2 生防芽孢桿菌B125的形態(tài)學(xué)鑒定Fig.2 Morphological identification of biocontrol Bacillus B125

細(xì)菌生理生化鑒定結(jié)果表明，該菌株明膠液化試驗(yàn)為陽(yáng)性，卵磷脂酶活性試驗(yàn)為陽(yáng)性，淀粉水解試驗(yàn)為陽(yáng)性，吲哚試驗(yàn)為陰性，V-P 試驗(yàn)為陽(yáng)性，運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)為陽(yáng)性，接觸酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，厭氧生長(zhǎng)試驗(yàn)為陽(yáng)性，檸檬酸鹽試驗(yàn)為陽(yáng)性，硝酸鹽還原試驗(yàn)為陽(yáng)性，甲基紅試驗(yàn)為陰性。以上鑒定結(jié)果符合貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）的生理生化特征。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 利用細(xì)菌通用引物對(duì)菌株B125 的16S rDNA 序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到大小為1 292 bp的序列，將序列在NCBI庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株B125的擴(kuò)增序列與貝萊斯芽孢桿菌的親緣關(guān)系最近，相似性為100%，由此可以確定，菌株B125 為貝萊斯芽孢桿菌。采用MEGA 7.0 軟件，按照Neighbor-Joining 法，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

圖3 生防芽孢桿菌B125進(jìn)化樹Fig.3 Evolutionary tree of strain B125

同源性比對(duì)結(jié)果表明，菌株B125與貝萊斯芽孢桿菌的同源性達(dá)到100%，系統(tǒng)發(fā)育樹也表明，菌株B125 與貝萊斯芽孢桿菌親緣關(guān)系較近，綜合形態(tài)學(xué)、生理生化特性以及分子生物學(xué)鑒定，可以確定菌株B125為貝萊斯芽孢桿菌。

2.3 生防芽孢桿菌B125制劑的制備情況

根據(jù)表2可知，接入細(xì)菌種子液后，經(jīng)過(guò)30 h發(fā)酵，芽孢率達(dá)到95%以上，離心后得到菌泥，經(jīng)烘干粉碎過(guò)篩，得到生防芽孢桿菌B125 菌粉，經(jīng)平板稀釋計(jì)數(shù)法測(cè)定，菌含量可達(dá)3.3×1011cfu/g，芽孢率100%，菌劑各項(xiàng)指標(biāo)符合GB 20287－2006《農(nóng)用微生物菌劑》的要求（表2）。

表2 芽孢桿菌B125制劑相關(guān)指標(biāo)Tab.2 Relevant indicators of Bacillus B125 preparation

2.4 生防芽孢桿菌B125制劑室內(nèi)離體葉片防效

采用穿刺接種法在草莓葉片上接種菌株B125，3 d后測(cè)定接種不同濃度菌株B125對(duì)草莓葉枯病的防治效果，結(jié)果見表3 和圖4，B125 不同濃度菌液的防治效果均高于戊唑醇處理，其中1×108cfu/mL 菌液接種處理病斑直徑僅0.59 cm，清水對(duì)照病斑直徑1.54 cm，防治效果達(dá)到61.69%，顯著高于農(nóng)藥戊唑醇處理，說(shuō)明生防芽孢桿菌B125可以定殖于草莓葉片表面發(fā)揮作用。

表3 不同濃度芽孢桿菌B125對(duì)草莓葉片病斑直徑的影響Tab.3 Effects of different concentrations of Bacillus B125 on the diameter of strawberry leaf spot

2.5 生防芽孢桿菌B125制劑的安全性測(cè)定結(jié)果

2.5.1 溶血試驗(yàn)結(jié)果 將菌株B125 劃線接種于血平板上，培養(yǎng)24 h后，未出現(xiàn)溶血環(huán)（圖5），說(shuō)明該菌株不具有溶血性，可作為一種安全的微生物制劑產(chǎn)品。

圖5 生防芽孢桿菌B125制劑的溶血試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Hemolysis test result of Bacillus B125 preparation

2.5.2 對(duì)作物的安全性 根據(jù)表4 和圖6 可知，菌株B125制劑對(duì)小白菜具有顯著的促生效果，能夠顯著增加小白菜地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量、葉片數(shù)、葉片葉綠素值（SPAD）以及根長(zhǎng)，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。經(jīng)試驗(yàn)認(rèn)證，細(xì)菌B125制劑對(duì)作物安全。

圖6 施用生防芽孢桿菌B125制劑對(duì)小白菜生長(zhǎng)的促生作用Fig.6 Promoting effect of Bacillus B125 preparation on the growth of Chinese cabbage

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從健康草莓根際土壤中篩選到5株對(duì)草莓葉枯病菌具有較好抑制效果的芽孢桿菌，其抑菌率均在70%以上，其中菌株B125 的抑菌率最高，可達(dá)75.44%，經(jīng)鑒定，該菌株為貝萊斯芽孢桿菌。對(duì)其發(fā)酵特性進(jìn)行初步研究，成功制備該菌株的固體菌劑，經(jīng)室內(nèi)生防效果測(cè)定，該菌株能夠有效控制草莓葉枯病的發(fā)生，離體防效可達(dá)61.69%。為了保證菌株的安全性，本試驗(yàn)還進(jìn)行了溶血性試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)，結(jié)果表明，菌株B125 不具有溶血性且對(duì)作物生長(zhǎng)具有較好的促生效果。

2005年，RUIZ-GARCíA 等[27]從采自西班牙馬拉加省托雷德爾馬爾的維萊茲河口的環(huán)境樣本中分離得到細(xì)菌CR-502T 和CR-14b，經(jīng)過(guò)表型分析、遺傳特性和生理生化特性的差異分析證實(shí)其為新菌株，并根據(jù)分離地將其命名為貝萊斯芽孢桿菌。但貝萊斯芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的分類定位一直存在爭(zhēng)議，直到2016 年，貝萊斯芽孢桿菌才擁有學(xué)界公認(rèn)的獨(dú)立分類學(xué)地位。近些年來(lái)，貝萊斯芽孢桿菌越來(lái)越受到研究人員的關(guān)注。馮江鵬等[28]從堆肥樣品中篩選到一株對(duì)草莓膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）具有較強(qiáng)抑菌效果的細(xì)菌JK3，經(jīng)鑒定該菌株為貝萊斯芽孢桿菌。劉雪嬌等[29]深入研究了貝萊斯芽孢桿菌3A3-15 的促生基因，發(fā)現(xiàn)該菌株促生基因包括ysnE 和dhbC，并且該菌株具有較強(qiáng)分泌嗜鐵素能力。本研究中，貝萊斯芽孢桿菌B125 能夠顯著抑制草莓葉枯病病原菌的生長(zhǎng)，形成明顯的抑菌帶，但本試驗(yàn)未拓展其抑菌譜，今后將測(cè)定該菌株對(duì)其他病原菌的抑制效果，以拓展該菌株的應(yīng)用范圍。

目前，工業(yè)發(fā)酵芽孢桿菌的方式包括液體發(fā)酵和固體發(fā)酵，液體發(fā)酵相較于固體發(fā)酵具有不容易污染、發(fā)酵效率高、易于控制等優(yōu)勢(shì)，是目前工業(yè)發(fā)酵芽孢桿菌制劑的主要方式。本研究篩選出的菌株B125 產(chǎn)孢效率高，并且安全性好，對(duì)人畜以及農(nóng)作物安全，具有良好的開發(fā)前景，但本研究未能深入探索菌株B125在液體發(fā)酵罐中的最佳發(fā)酵條件，這也是今后要深入研究的方向。