海拔高度對(duì)刺梨根際土壤真菌與細(xì)菌多樣性的影響

李銀鳳，劉曉柱

（貴州理工學(xué)院食品藥品制造工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550003）

根是植物長(zhǎng)期在陸上生活進(jìn)化過(guò)程中形成的營(yíng)養(yǎng)器官，可吸收土壤中的水分與礦物質(zhì)，為植物地上部分提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。植物根的周?chē)嬖诖罅康奈⑸?，稱(chēng)為根際微生物[2]。根際微生物與植物之間存在密切相互作用，對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、抗逆等生命活動(dòng)具有重要的影響[3]。但植物根際微生物的種群組成及豐度受植物生理狀態(tài)、地理?xiàng)l件及氣候環(huán)境影響[4]。因而，研究特定生境下植物根際微生物多樣性，對(duì)于構(gòu)建良好的農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)、促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)穩(wěn)定具有重要實(shí)踐意義。

刺梨（Rosa roxburghiiTratt）是薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）多年生落葉灌木植物，為我國(guó)特有物種[5]。刺梨根系較為發(fā)達(dá)，對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，在荒坡、山地均可生長(zhǎng)，可保持水土、涵養(yǎng)水源，對(duì)于喀斯特地區(qū)的石漠化治理具有重要作用[6]。刺梨主要種植在海拔高度為1 500～2 000 m 的丘陵和山地，刺梨產(chǎn)業(yè)在貴州省鄉(xiāng)村振興中發(fā)揮著重要作用。

目前，對(duì)刺梨的研究主要集中在活性成分、香氣特性、農(nóng)藝性狀及基因功能等方面[7-9]。近年來(lái)對(duì)于刺梨微生物的研究報(bào)道逐漸增多，如采用高通量測(cè)序方法對(duì)刺梨果實(shí)酵母菌[5]、細(xì)菌[10]種群多樣性進(jìn)行鑒定，利用純培養(yǎng)法分離可培養(yǎng)酵母菌，嘗試將分離的酵母菌株用于刺梨果酒的發(fā)酵生產(chǎn)，評(píng)價(jià)其發(fā)酵性能[11-12]。微生物的分布具有空間特異性，但目前還未有關(guān)于不同海拔高度刺梨根際微生物多樣性的報(bào)道。因此，擬采用高通量測(cè)序技術(shù)，分析不同海拔高度刺梨根際微生物多樣性，為分離刺梨根際促生菌提供參考。

1 材料和方法

1.1 土壤材料

刺梨根際土壤于2020 年8 月采自貴州省六盤(pán)水市盤(pán)州縣某刺梨種植園。根據(jù)刺梨種植特點(diǎn)，采樣地海拔高度分別設(shè)置為1 550 m（B1）、1 650 m（B2）、1 750 m（B3）、1 850 m（B4）、2 050 m（B5），3次重復(fù)。

1.2 測(cè)序引物

高通量測(cè)序所用引物由上海美吉生物科技有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1 高通量測(cè)序所用引物Tab.1 Primers used in high-throughput sequencing

1.3 高通量測(cè)序與生物信息學(xué)分析

按照試劑盒（生工生物上海股份有限公司，型號(hào)B51828）說(shuō)明書(shū)提取刺梨根際土壤基因組DNA，利用NanoDrop 2000 進(jìn)行DNA 純度與濃度檢測(cè)，采用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA 完整性檢測(cè)。取適量的DNA 模板，以ITS1F 和ITS2R 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)后，進(jìn)行回收和純化。文庫(kù)的構(gòu)建與Miseq 測(cè)序由上海美吉生物科技有限公司完成。

利用上海美吉生物科技有限公司的微生物多樣性云分析平臺(tái)（https://www.i-sanger.com/）對(duì)Miseq測(cè)序得到的序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。首先，根據(jù)樣本的海拔高度，將測(cè)序樣本分為B1、B2、B3、B4、B5 共5 組。然后，以相似度為97%、按照最小樣本序列數(shù)抽平樣本序列。之后，按照云平臺(tái)的操作步驟，進(jìn)行物種組成分析、樣本比較分析、物種差異分析和進(jìn)化分析等。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同海拔刺梨根際土壤PCR分析

采用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)收集的不同海拔刺梨根際土壤PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)后，結(jié)果如圖1 所示。所有土壤PCR 擴(kuò)增條帶完整性和特異性均較好，沒(méi)有其他雜帶。表明收集的土壤樣本質(zhì)量較好，可滿足后續(xù)測(cè)序要求。

圖1 不同海拔刺梨根際土壤的真菌ITS1區(qū)域（A）和細(xì)菌V3—V4區(qū)域（B）PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR result of fungal ITS1 region（A）and bacterial V3—V4 region（B）in rhizosphere soil of R.roxburghii at different altitudes

2.2 不同海拔刺梨根際土壤高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析

對(duì)不同海拔刺梨根際土壤高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用引物ITS1F 和ITS2R 共得到1 083 495條原始讀數(shù)（Raw read），652 263 990 bp 序列；經(jīng)序列優(yōu)化后，測(cè)序序列平均長(zhǎng)度227 bp，共245 998 085 bp。采用引物338F和806R 共得到745 539條原始讀數(shù)，448 814 478 bp 序列；經(jīng)序列優(yōu)化后，測(cè)序序列平均長(zhǎng)度416 bp，共310 301 104 bp。

2.3 不同海拔刺梨根際土壤真菌和細(xì)菌Alpha多樣性分析

Alpha 多樣性用來(lái)評(píng)價(jià)特定樣本物種類(lèi)群的豐富性和均勻性，常用的度量標(biāo)準(zhǔn)有覆蓋度（Coverage）、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Ace指數(shù)及Chao 指數(shù)。其中，Coverage 用來(lái)評(píng)價(jià)測(cè)序樣本對(duì)低豐度物種的覆蓋情況。所有樣本真菌測(cè)序Coverage值均為100.00%，細(xì)菌測(cè)序Coverage 值均為98.00%（表2），說(shuō)明所有土壤樣本覆蓋低豐度物種的程度均較高，因而測(cè)序結(jié)果可代表土壤中物種真實(shí)狀況。

表2 不同海拔刺梨根際土壤真菌與細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)Tab.2 Alpha diversity index of fungi and bacteria in rhizosphere soil of R.roxburghii at different altitudes

Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)常用來(lái)評(píng)估樣本物種多樣性，Shannon 指數(shù)值越大、Simpson 指數(shù)值越小，表明物種多樣性越高，反之，則越低[5]。如表2所示，對(duì)不同海拔刺梨根際土壤真菌測(cè)序發(fā)現(xiàn)，樣本B4 的Shannon 指數(shù)值最大，Simpson 指數(shù)值最小，因而樣本B4真菌多樣性最高；樣本B5的Shannon指數(shù)值最小，Simpson指數(shù)值最大，因而樣本B5真菌多樣性最低。真菌物種多樣性整體上為B4＞B1＞B3＞B2＞B5。細(xì)菌測(cè)序結(jié)果表明，樣本B3、B4 的Shannon 指數(shù)值較大，其細(xì)菌多樣性較高；樣本B2 的Shannon指數(shù)值最小，Simpson 指數(shù)值最大，其細(xì)菌多樣性最低。細(xì)菌物種多樣性整體上為B4＞B3＞B1＞B5＞B2。

Ace 指數(shù)、Chao 指數(shù)也常用來(lái)衡量樣本中的物種多樣性。Ace指數(shù)、Chao指數(shù)越大，表明物種多樣性越高[5]。如表2所示，B4樣本的真菌與細(xì)菌Ace指數(shù)與Chao指數(shù)值均最大，表明其真菌與細(xì)菌物種多樣性均最高。

綜合來(lái)看，海拔1 850 m 刺梨根際土壤（B4 樣本）真菌與細(xì)菌物種多樣性最高，物種最豐富；海拔2 050 m 刺梨根際土壤（B5 樣本）真菌與細(xì)菌物種多樣性最低。隨海拔高度增加，真菌和細(xì)菌物種多樣性呈現(xiàn)先降低、再升高、再降低的趨勢(shì)。

2.4 不同海拔刺梨根際土壤真菌和細(xì)菌β多樣性分析

采用非度量多維尺度（Non-metric multidimensional scaling，NMDS）方法對(duì)不同海拔刺梨根際土壤樣本中微生物組成進(jìn)行了分析。如圖2A 所示，5 個(gè)不同海拔刺梨根際土壤樣本的真菌組成較為分散，表明其真菌物種組成相似性差，差異較大。對(duì)于細(xì)菌物種組成（圖2B）而言，B1 樣本、B2 樣本密切相關(guān)，表明其細(xì)菌組成較為相似；其他組樣本較為分散，表明其物種組成差異較大。

圖2 不同海拔刺梨根際土壤中真菌（A）與細(xì)菌（B）NMDS分布Fig.2 NMDS distribution of fungi（A）and bacteria（B）in rhizosphere soil of R.roxburghii at different altitudes

2.5 不同海拔刺梨根際土壤真菌和細(xì)菌物種組成分析

不同海拔刺梨根際土壤鑒定出的真菌數(shù)目有差異，B4 樣本最多，包含609 個(gè)種；B3 樣本最少，包含547 個(gè)種（圖3A）。其他土壤樣本，B1 樣本包含551 個(gè)種，B2 樣本包含560 個(gè)種，B5 樣本包含549 個(gè)種。對(duì)于細(xì)菌而言，B2 樣本細(xì)菌數(shù)最多，包含1 585個(gè)種；B3 樣本最少，包含1 372 個(gè)種（圖3B）。其余土壤樣本，B1 樣本包含1 445 個(gè)種，B4 樣本包含1 522個(gè)種，B5樣本包含1 396個(gè)種。因而，5個(gè)不同海拔刺梨根際土壤樣本真菌與細(xì)菌綜合比較，B2樣本物種數(shù)最多，B3樣本最少。

真菌物種組成如圖4 所示，樣本B1 中相對(duì)豐度最高的為鐮孢霉屬（Unclassified_g__Fusarium，21.63%），接著為沙蜥屬（Saitozymasp.，9.89%）、長(zhǎng)孢被孢霉（Mortierella_elongate，6.93%）。B2 樣本中，Saitozymasp.相對(duì)豐度最高（20.70%），接著為Unclassified_g__Fusarium（11.20%）和Mortierella_elongate（9.85%）。B3 樣本中，相對(duì)豐度最高的為Unclassified_g__Clavaria（19.75%），然后為子囊菌（Unclassified_p__Ascomycota，19.21%）、木霉孢子菌（Trichoderma_polysporum，7.76%）。B4 樣本中相對(duì)豐度最高的為Unclassified_g__Fusarium（9.32%），然后為Saitozymasp.（9.75%）、Mortierella_elongate（6.87%）。B5 樣本中Saitozymasp.（24.82%）為相對(duì)豐度最高的物種，接著為Mortierella_elongate（18.44%），然后為Unclassified_g__Fusarium（6.51%）。

圖4 不同海拔刺梨根際土壤真菌物種組成Fig.4 Composition of fungi species in rhizosphere soil of R.roxburghii at different altitudes

不同海拔刺梨根際土壤中，Unclassified_g__Fusarium表現(xiàn)出先降低、再升高、再降低的趨勢(shì)（圖5）；而Mortierella_elongate表現(xiàn)出先升高、后降低、再升高的趨勢(shì)；Saitozymasp.則表現(xiàn)出先升高、后降低、再升高的趨勢(shì)。因而不同海拔刺梨根際土壤真菌物種多樣性及相對(duì)豐度具有差異性。

圖5 不同海拔刺梨根際土壤主要真菌變化趨勢(shì)Fig.5 Variation trend of major fungi in rhizosphere soil of R.roxburghii at different altitudes

細(xì)菌物種組成如圖6 所示，刺梨根際土壤中絕大部分細(xì)菌還未能被鑒定出，該部分在各樣本中相對(duì)豐度均超過(guò)70%。B1 樣本中鞘氨醇單胞菌（Uncultured_Sphingomonadaceae_bacterium_g__Sphingomonas）相對(duì)豐度較高，為3.67%；接著為酸桿菌（Uncultured_Acidobacteria_bacterium_g__norank_f__norank_o__Acidobacteriales），相對(duì)豐度為2.15%；然后為硫黃球菌屬（Unclassified_g__norank_f__norank_o__Vicinamibacterales）。 Uncultured_Sphingomonadaceae_bacterium_g__Sphingomonas在B2 樣本中相對(duì)豐度依然較高，為3.10%；其次為Romboutsia_ilealis（2.96%），且該物種專(zhuān)屬存在于該海拔刺梨根際土壤 中 。 Unclassified_g__norank_f__norank_o__Vicinamibacterales 在B3樣本、B4樣本中相對(duì)豐度依然較高，分別為4.24%、3.57%。 慢生根瘤菌（Bradyrhizobium_elkanii_g__Bradyrhizobium）在 B4樣本、B5 樣本中含量較高，相對(duì)豐度分別為2.81%、3.68%。黃色桿菌（Unclassified_f__Xanthobacteraceae）在B5樣本中相對(duì)豐度也較高（2.29%）。

圖6 不同海拔刺梨根際土壤細(xì)菌物種組成fig.6 composition of bacterial species in rhizosphere soil of R.roxburghii at different altitudes

不同海拔刺梨根際土壤中，Uncultured_Sphingomonadaceae_bacterium_g__Sphingomonas與Bradyrhizobium_elkanii_g__Bradyrhizobium表現(xiàn)出先降低、再升高的趨勢(shì)（圖7）；而Unclassified_g__norank_f__norank_o__Vicinamibacterales 則表現(xiàn)出先升高、再降低的趨勢(shì)；Uncultured_bacterium_g__norank_f__Roseiflexaceae 則表現(xiàn)出先降低、再升高、再降低的趨勢(shì)。

圖7 不同海拔刺梨根際土壤主要細(xì)菌變化趨勢(shì)Fig.7 Variation trend of major bacteria in rhizosphere soil of R.roxburghii at different altitudes

2.6 不同海拔刺梨根際土壤真菌和細(xì)菌物種組成差異分析

采用Kruskal-Wallis H 測(cè)驗(yàn)方法分析了不同海拔刺梨根際土壤中真菌與細(xì)菌組成差異。各樣本間真菌物種組成差異如圖8A 所示，5 個(gè)樣本相互間在Saitozymasp.Unclassified_g__Fusarium、Mortierella_elongate、Unclassified_p__Ascomycota、嗜魚(yú)外瓶霉（Exophiala_equina）、巨枝膝梗孢（Gonytrichummacrocladumvar.terricola） 、Neocosmospora_rubicola、Unclassified_k__Fungi 組成上均具有顯著性差異；B4 樣本中的Claviceps_panicoidearum與其他樣本之間具有極顯著性差異；B2樣本中的英杜被孢霉（Mortierella_indohii）與其他樣本間存在顯著性差異。

圖8 不同海拔刺梨根際土壤真菌與細(xì)菌差異性分析Fig.8 Difference analysis of fungi and bacteria in rhizosphere soil of R.roxburghii at different altitudes

各樣本間細(xì)菌物種組成差異如圖8B 所示，Bradyrhizobium_elkanii_g__Bradyrhizobium、Uncultured_Sphingomonadaceae_bacterium_g__Sphingomonas、Unclassified_f__Xanthobacteraceae、 Uncultured_Acidobacteria_bacterium_g__norank_f_norank_o__Acidobacteriales、放線菌（Unclassified_g_norank_f__norank_o__Gaiellales）、芽單胞菌屬（Unclassified_g__Gemmatimonas） 、 Unclassified_g_norank_f__Vicinamibacteraceae、 Unclassified_g__Pseudolabrys、Uncultured_bacterium_g_norank_f__Roseiflexaceae、Uncultured_bacterium_g__norank_f_norank_o__Rokubacteriales、Romboutsia_lealis以及Uncultured_actinobacterium_g__norank_f__norank_o__Gaiellales 等組成上具有顯著性差異。

2.7 不同海拔刺梨根際土壤菌群功能預(yù)測(cè)分析

基于FUNGuild 功能預(yù)測(cè)方法分析了不同海拔刺梨根際土壤真菌功能，結(jié)果如圖9A 所示，不同海拔刺梨根際土壤真菌具有多種功能，其中腐殖質(zhì)真菌（Animal pathogen-endophyte-lichen parasite-plant pathogen-soil saprotroph-wood saprotroph、Undefined saprotroph）隨海拔高度的增加呈現(xiàn)出先降低、后升高、再降低的趨勢(shì)；而一些未知功能的真菌則隨海拔高度的增加表現(xiàn)出先升高、后降低的特點(diǎn)；寄生腐殖質(zhì)真菌（Fungal parasite-undefined saprotroph）則隨海拔升高表現(xiàn)出先升高、后降低、再升高的趨勢(shì)。

圖9 不同海拔刺梨根際土壤真菌（A）與細(xì)菌（B）功能分析Fig.9 Functional analysis of fungi（A）and bacteria（B）in rhizosphere soil of R.roxburghii at different altitudes

基于PICRUSt功能預(yù)測(cè)方法分析了不同海拔刺梨根際土壤細(xì)菌功能，結(jié)果如圖9B 所示，不同海拔刺梨根際土壤細(xì)菌具有多種功能，如RNA 的加工與修飾（RNA processing and modification）、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動(dòng)態(tài)變化（Chromatin structure and dynamics）、能量合成與轉(zhuǎn)化（Energy production and conversion）等。不同海拔刺梨根際細(xì)菌功能高度相似，無(wú)明顯變化。

3 結(jié)論與討論

土壤根際微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其群落組成對(duì)栽培植物的健康生長(zhǎng)至關(guān)重要[13]。但土壤根際微生物資源受多種因素影響，如土壤耕種措施、土壤類(lèi)型、季節(jié)等[14-15]。劉宇[16]采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)方法對(duì)不同海拔海南鳳仙花可培養(yǎng)根際真菌群落的季節(jié)性變化進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同海拔梯度真菌數(shù)量與豐度在干季明顯高于濕季。本研究中，真菌資源與細(xì)菌資源物種多樣性具有海拔高度差異性，一些優(yōu)勢(shì)菌群的分布隨海拔高度呈現(xiàn)一定分布特征。Unclassified_g__Fusarium隨海拔高度增加表現(xiàn)出先降低、再升高、再降低的趨勢(shì)；Mortierella_elongate則表現(xiàn)出先升高、后降低、再升高的趨勢(shì)。這些可能與其功能有關(guān)。

張二豪等[17]采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)西藏芒康和林芝葡萄表皮及根際土壤樣品進(jìn)行真菌群落多樣性分析發(fā)現(xiàn)，不同葡萄品種根際土壤真菌多樣性不同，芒康葡萄的根際土壤真菌多樣性高，林芝葡萄的根際真菌多樣性低；鐮刀菌屬（Fusarium）、被孢霉屬（Mortierella）為西藏2 個(gè)地區(qū)葡萄根際優(yōu)勢(shì)真菌。本研究中，F(xiàn)usarium、Mortierella為低海拔（B1）、高海拔（B4、B5）中的優(yōu)勢(shì)菌屬，這與西藏地區(qū)葡萄根際真菌組成具有相似性。

植物根際有益微生物被稱(chēng)為植物根際促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）[18]。PGPR 可通過(guò)合成某些促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育的化合物[19]，如生長(zhǎng)素，或者改變土壤的理化性質(zhì)，促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的吸收，因而有利于植物的生長(zhǎng)發(fā)育。CHABOT 等[20]的研究表明，隨著土壤肥力的不斷增加，土壤根瘤菌對(duì)磷的吸收能力也逐漸增強(qiáng)，從而促進(jìn)生菜、玉米等作物的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果也表明，不同海拔刺梨根際真菌與細(xì)菌組成具有一定的差異性，推斷其可能對(duì)刺梨的生長(zhǎng)發(fā)育具有相應(yīng)影響，但還有待于進(jìn)一步研究。

同時(shí)植物的根際也存在一些有害微生物，它們通過(guò)限制植物根系的生長(zhǎng)或改變根系功能來(lái)影響植物對(duì)水分、營(yíng)養(yǎng)的吸收利用，進(jìn)而對(duì)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育產(chǎn)生顯著負(fù)影響[21-22]。 大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）、腐霉屬菌（Pythium）、Fusarium可誘發(fā)大豆的根腐病，降低大豆根系活力，抑制根系對(duì)水分及營(yíng)養(yǎng)的吸收，造成產(chǎn)量降低；立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）可誘發(fā)小麥的紋枯病[23]；半知菌亞門(mén)的灰梨孢菌（Pyricularia grisea）可誘發(fā)水稻的稻瘟病[24]。根際有害微生物影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，特別對(duì)于農(nóng)作物而言，可造成產(chǎn)量降低。本研究盡管采用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定了不同海拔刺梨根際土壤真菌與細(xì)菌資源多樣性以及分布特點(diǎn)，同時(shí)也預(yù)測(cè)了其潛在功能，但要真正明確這些微生物的實(shí)際功能，還需進(jìn)一步深入研究。

綜上，本研究基于高通量測(cè)序技術(shù)的研究結(jié)果表明，不同海拔刺梨根際土壤真菌和細(xì)菌種類(lèi)數(shù)不同，1 850 m海拔高度的刺梨根際土壤中真菌與細(xì)菌物種數(shù)相對(duì)較多，而1 750 m 海拔高度的刺梨根際土壤中真菌與細(xì)菌物種數(shù)相對(duì)較少。海拔高度對(duì)刺梨根際土壤真菌與細(xì)菌分布有重要影響，優(yōu)勢(shì)菌群隨海拔高度變化呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。此外，刺梨根際土壤中真菌與細(xì)菌資源具有多種功能，根際真菌功能分布隨海拔不同呈現(xiàn)不同特征。