靈芝誘導(dǎo)子對南方紅豆杉懸浮培養(yǎng)細胞產(chǎn)紫杉醇的影響

邱 涵，孟麗媛，楊婉婷，凌樹玉，任凱利，魏賽金

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用微生物研究所，江西 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045）

南方紅豆杉（Taxus wallichianavar.mairei）在江西也稱為紅葉水杉，是國家一級重點保護野生植物[1]。紫杉醇是一種從短葉杉樹皮中提取的二萜類生物堿，被認為是世界上最有效的廣譜抗癌藥物之一[2]。若干年來，紅豆杉一直是紫杉醇的天然來源，但是紅豆杉產(chǎn)紫杉醇的量極少，供應(yīng)短缺限制了紫杉醇的臨床應(yīng)用[3]。目前，已采用多種方法解決紫杉醇的供應(yīng)問題[4]，其中，利用植物細胞工程技術(shù)提高紫杉醇產(chǎn)量是保護稀缺紅豆杉資源和解決紫杉醇藥源緊缺的有效途徑之一[5]，但其紫杉醇產(chǎn)量仍然比較低。

真菌能夠合成一種被植物細胞表面特定受體識別的保守分子（MAMPs），引發(fā)植物細胞內(nèi)的防御反應(yīng)，促進次生代謝產(chǎn)物的積累[6]。真菌誘導(dǎo)子能有效誘導(dǎo)植物懸浮細胞體系中次生代謝產(chǎn)物的積累，其誘導(dǎo)機制包括誘導(dǎo)子的識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達以及關(guān)鍵酶的激活等[7]。因此，真菌誘導(dǎo)子添加到南方紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)液中，可以提高紫杉醇的產(chǎn)量。李家儒等[8]在紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)到20 d 時，加入桔青霉（Penicillum citrinum）誘導(dǎo)子，使細胞紫杉醇的含量達到199.1 μg/g。李永成等[9]在東北紅豆杉懸浮細胞培養(yǎng)時，利用4%（體積比）的美麗鐮刀菌（Fusarium mairei）培養(yǎng)液及4%（質(zhì)量與體積比）的胞外多糖分別處理細胞，2種處理均誘導(dǎo)了東北紅豆杉細胞的防御反應(yīng)，使紫杉醇的合成分別提高了2.5、1.5 倍。而關(guān)于藥用真菌誘導(dǎo)子提高紫杉醇含量的研究尚未見報道，鑒于此，擬研究靈芝（Ganoderma lucidum）誘導(dǎo)子對南方紅豆杉懸浮培養(yǎng)細胞生長的影響，為南方紅豆杉細胞高產(chǎn)紫杉醇提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 材料 南方紅豆杉愈傷組織：以南方紅豆杉約2 年生嫩枝條為材料組培獲得，繼代培養(yǎng)至5 代以上[10]。靈芝為多孔菌科真菌赤芝，保存于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用微生物研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基 在B5培養(yǎng)基（購自杭州百思生物技術(shù)有限公司）內(nèi)加0.4 mg/L 2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、0.3 mg/L NAA（1-萘乙酸）、1.2 mg/L 6-KT（6-糠氨基嘌呤）和30 g/L 蔗糖、PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，活化靈芝菌）、PDB（馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基，培養(yǎng)靈芝菌），經(jīng)115 ℃滅菌30 min待用。

1.1.3 試劑 紫杉醇標準品（色譜純）購自北京索萊寶科技有限公司；甲醇（高效液相級）、乙腈（色譜純）、異丙醇（色譜純）、2，4-D、NAA、6-KT 均購自中國醫(yī)藥集團有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

主要儀器和設(shè)備包括Agilent1260 高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）、SHP-250 智能生化培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）、SPH-3112 雙層搖床機（上海世平實驗儀器設(shè)備有限公司）、GENESYS50紫外可見分光光度計（賽默飛世爾科技公司）、SU8100型生物掃描電子顯微鏡（日立高新技術(shù)有限公司）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅豆杉懸浮細胞培養(yǎng) 選取顆粒疏松、黃白色、生長良好的愈傷組織，按照0.09 g/mL 的接種量接種到30 mL 上述待用B5 培養(yǎng)基中，（24±1）℃、120 r/min懸浮暗培養(yǎng)。

1.3.2 靈芝誘導(dǎo)子的制備 將活化后的靈芝挖塊接種于PDB 培養(yǎng)基，于28 ℃、120 r/min 培養(yǎng)7 d，抽濾洗滌，收集菌絲體。以酸解法[11]制備靈芝誘導(dǎo)子。誘導(dǎo)子的質(zhì)量濃度以總糖含量表示，采用蒽酮-硫酸比色法[12]測定。

1.3.3 靈芝誘導(dǎo)子的添加（1）靈芝誘導(dǎo)子最佳添加質(zhì)量濃度試驗：細胞懸浮培養(yǎng)至第8天，分別添加質(zhì)量濃度為0、10、100、500、1 000 μg/mL 的誘導(dǎo)子，繼續(xù)培養(yǎng)至第21 天，測定細胞生長指數(shù)、紫杉醇總產(chǎn)量。

（2）靈芝誘導(dǎo)子最佳添加時間試驗：分別在第0、4、8、12、16 天添加100 μg/mL 誘導(dǎo)子，培養(yǎng)至第21天，測定細胞生長指數(shù)、紫杉醇總產(chǎn)量。

（3）靈芝誘導(dǎo)子最佳持續(xù)作用時間試驗：在紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)的第8 天加入100 μg/mL 誘導(dǎo)子（LZ），以加入等量蒸餾水為對照（CK），之后的第0、2、4、6、8天，測定細胞生長指數(shù)、紫杉醇總產(chǎn)量。

（4）靈芝誘導(dǎo)子對南方紅豆杉懸浮細胞影響試驗：在紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)第8 天加入100 μg/mL靈芝誘導(dǎo)子，掃描電子顯微鏡觀察細胞形態(tài)，測定細胞生長第8、10、12、16、21、24 天的干質(zhì)量和鮮質(zhì)量、紫杉醇總產(chǎn)量、細胞活力、總酚含量、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性、多酚氧化酶（PPO）活性。

1.4 指標測定

1.4.1 細胞生長量、紫杉醇總產(chǎn)量的測定 懸浮細胞生長指數(shù)參照參考文獻[13]測定；采用李永成等[14]的方法提取胞外紫杉醇，采用趙繼鵬等[15]的方法提取胞內(nèi)紫杉醇，采用高效液相測定法[13]測定紫杉醇產(chǎn)量。紫杉醇總產(chǎn)量是細胞外和細胞內(nèi)紫杉醇產(chǎn)量之和。

1.4.2 細胞形態(tài)觀察 取靈芝誘導(dǎo)子處理后懸浮培養(yǎng)至第21 天的紅豆杉細胞，參照參考文獻[16]使用掃描電子顯微鏡觀察其表面形態(tài)。

1.4.3 PAL 活性、細胞活力、PPO 活性、總酚含量測定 加入誘導(dǎo)子之后，懸浮細胞生長第8、10、12、16、21、24 天的PAL 活性測定參照參考文獻[17]；采用TTC 還原法在485 nm 紫外分光光度計下測定懸浮細胞活力；PPO 活性測定參照參考文獻[18]；胞內(nèi)總酚含量采用張長平等[17]的方法測定，用水楊酸作為標準品來衡量總酚的質(zhì)量濃度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2016 記錄數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)取3 個平行試驗的平均值，誤差用標準差表示；用SPSS 22.0 進行單因素ANOVA檢驗；用Origin 2021制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度和添加時間靈芝誘導(dǎo)子對南方紅豆杉細胞生長及紫杉醇合成的影響

由表1 可知，在南方紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)至第8 天、添加靈芝誘導(dǎo)子質(zhì)量濃度低于100 μg/mL 時，細胞生長指數(shù)和紫杉醇總產(chǎn)量隨著誘導(dǎo)子質(zhì)量濃度的增加而逐漸增加，當誘導(dǎo)子質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，細胞生長指數(shù)為36.39%，紫杉醇總產(chǎn)量為1.39 mg/L，顯著高于其他組（P＜0.05）。而當添加的誘導(dǎo)子質(zhì)量濃度高于100 μg/mL 時，隨誘導(dǎo)子質(zhì)量濃度升高細胞生長指數(shù)和紫杉醇總產(chǎn)量開始降低，不利于細胞生長。綜上，在培養(yǎng)基中加入100 μg/mL 的誘導(dǎo)子，有利于細胞生長及紫杉醇的合成，因此認為該質(zhì)量濃度為誘導(dǎo)子添加的最佳質(zhì)量濃度。

表1 靈芝誘導(dǎo)子不同質(zhì)量濃度和添加時間下南方紅豆杉細胞生長指數(shù)及紫杉醇的產(chǎn)量Tab.1 Cell growth index and total paclitaxel production of Taxus wallichiana var.mairei under different concentration and addition time of Ganoderma lucidum elicitor

靈芝誘導(dǎo)子最佳添加時間試驗結(jié)果（表1）表明，當誘導(dǎo)子在細胞生長的第8天加入、懸浮培養(yǎng)至第21 天時，細胞生長指數(shù)為28.92%，紫杉醇總產(chǎn)量為1.49 mg/L，兩者均明顯高于其他添加時間時細胞的生長指數(shù)及紫杉醇總產(chǎn)量。因此，誘導(dǎo)子最佳添加時間為細胞懸浮培養(yǎng)第8天。

2.2 誘導(dǎo)子持續(xù)作用時間對南方紅豆杉細胞生長及紫杉醇合成的影響

由表2 可知，在細胞生長的第8 天加入靈芝誘導(dǎo)子，持續(xù)培養(yǎng)6 d 時，CK 細胞生長指數(shù)為34.37%，紫杉醇總產(chǎn)量為1.90 mg/L；靈芝誘導(dǎo)子處理后，細胞生長指數(shù)為58.73%，紫杉醇總產(chǎn)量為2.75 mg/L。靈芝誘導(dǎo)子處理后細胞生長指數(shù)較CK 提高了70.88%，紫杉醇總產(chǎn)量提高了44.74%。靈芝誘導(dǎo)子處理后6 d 細胞生長指數(shù)、紫杉醇總產(chǎn)量均明顯高于其他持續(xù)作用時間的細胞生長指數(shù)、紫杉醇總產(chǎn)量（P＜0.05），說明培養(yǎng)時間過短和過長均不利于細胞生長和紫杉醇合成。

表2 靈芝誘導(dǎo)子不同持續(xù)作用時間下南方紅豆杉細胞生長指數(shù)及紫杉醇總產(chǎn)量Tab.2 Cell growth index and total paclitaxel production of Taxus wallichiana var.mairei under different duration of Ganoderma lucidum elicitor treatment

2.3 最佳條件下誘導(dǎo)子對南方紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)的影響

2.3.1 南方紅豆杉細胞鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、紫杉醇總產(chǎn)量的變化 靈芝誘導(dǎo)子處理后南方紅豆杉細胞鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、紫杉醇總產(chǎn)量明顯高于CK，培養(yǎng)21 d 時均達到最大值，靈芝誘導(dǎo)子處理后細胞鮮質(zhì)量為5.71 g，達CK的173.56%；細胞干質(zhì)量為1.57 g，達CK 的221.13%；紫杉醇總產(chǎn)量為10.68 mg/L，達CK的569.69%（圖1）。

圖1 靈芝誘導(dǎo)子處理后懸浮培養(yǎng)細胞鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、紫杉醇總產(chǎn)量的變化Fig.1 Changes of fresh weight，dry weight and total paclitaxel production of suspension culture cells after Ganoderma lucidum elicitor treatment

2.3.2 靈芝誘導(dǎo)子對南方紅豆杉懸浮細胞形態(tài)的影響 掃描電鏡觀察結(jié)果（圖2）表明，靈芝誘導(dǎo)子處理后，與CK 比較，南方紅豆杉細胞膜表面結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，小分子物質(zhì)增多，細胞膜變得更加光滑，黏膜狀物質(zhì)大量增加，細胞表面物質(zhì)連接更加緊密，球狀物質(zhì)大量增加且體積更大。

圖2 靈芝誘導(dǎo)子處理后紅豆杉懸浮細胞形態(tài)變化（×15 000）Fig.2 Morphological changes of suspension cells of Taxus wallichiana after Ganoderma lucidum elicitor treatment（×15 000）

2.3.3 靈芝誘導(dǎo)子對南方紅豆杉懸浮細胞PAL 活性和細胞活力的影響 苯丙烷代謝途徑是植物防御反應(yīng)和次生代謝產(chǎn)物形成的重要生化途徑，而PAL 是該途徑中的第一個重要酶[19]，在紫杉醇合成中其支鏈的形成也與該途徑有重要關(guān)系。由圖3可知，細胞懸浮培養(yǎng)8～12 d 時，靈芝誘導(dǎo)子處理后的紅豆杉細胞PAL 活性與CK 相比明顯上升，并在12 d 時達到峰值，為49.43 U/g；16～24 d 時誘導(dǎo)子處理后的酶活性開始降低，但仍高于CK。誘導(dǎo)子處理后的南方紅豆杉細胞活力與CK 相比明顯降低，培養(yǎng)16 d 時CK 細胞活力為0.84，靈芝誘導(dǎo)子處理后的細胞活力為0.41。培養(yǎng)8～16 d 時，靈芝誘導(dǎo)子處理后的細胞活力下降趨勢較對照明顯。

圖3 靈芝誘導(dǎo)子處理后懸浮培養(yǎng)細胞PAL活性和細胞活力變化Fig.3 Changes of PAL enzyme activity and cell vitality after Ganoderma lucidum elicitor treatment

2.3.4 靈芝誘導(dǎo)子對南方紅豆杉懸浮培養(yǎng)細胞PPO活性和總酚含量的影響 PPO可以催化氧化酚類物質(zhì)，酚類物質(zhì)的積累又與褐化有直接關(guān)系，細胞褐化會使細胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或遭破壞，細胞分裂和生長受到抑制[20]。由圖4 可知，靈芝誘導(dǎo)子處理后的PPO 活性與CK 相比明顯降低。第8 天沒有加入誘導(dǎo)子時，細胞內(nèi)總酚質(zhì)量濃度為25.79 mg/L。在加入誘導(dǎo)子后細胞總酚質(zhì)量濃度與CK 相比明顯上升，16 d 時靈芝誘導(dǎo)子處理的細胞總酚質(zhì)量濃度為CK的297.72%。誘導(dǎo)后期，培養(yǎng)21～24 d時，不同處理細胞總酚質(zhì)量濃度均下降，但是誘導(dǎo)子處理后的總酚質(zhì)量濃度仍高于CK。

3 結(jié)論與討論

通過南方紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇是解決紫杉醇短缺的一個途徑[21]。本研究結(jié)果表明，靈芝制備的誘導(dǎo)子對南方紅豆杉細胞生長和紫杉醇合成有明顯促進作用。培養(yǎng)21 d 時，靈芝誘導(dǎo)子處理紅豆杉細胞產(chǎn)紫杉醇總產(chǎn)量為10.68 mg/L，是CK 的569.69%，說明靈芝誘導(dǎo)子的添加促進了紫杉醇的合成，與李永成等[9]的研究結(jié)果比較，本研究中的靈芝誘導(dǎo)子對紫杉醇合成的促進效果更佳。植物懸浮細胞的培養(yǎng)是生產(chǎn)次級代謝物的常用手段之一，而外源性誘導(dǎo)劑可以顯著增加植物細胞中相關(guān)次級代謝物的積累[7]。真菌粗提物中的多糖物質(zhì)可能對紅豆杉細胞具有誘導(dǎo)活性[22]。研究表明，在紅豆杉細胞對數(shù)生長后期誘導(dǎo)可獲得較高的紫杉醇積累[14，23]。本研究中，在細胞懸浮培養(yǎng)至第8 天時，加入100 μg/mL 靈芝誘導(dǎo)子，改變了紅豆杉細胞的培養(yǎng)環(huán)境，細胞膜表面發(fā)生明顯變化，細胞表面小分子物質(zhì)增多，細胞膜變得更加光滑。這可能是靈芝誘導(dǎo)子刺激了紅豆杉懸浮細胞和外界環(huán)境的快速應(yīng)答反應(yīng)，植物防御反應(yīng)被啟動，調(diào)控了紅豆杉細胞的次級代謝途徑[24]，從而促進了紫杉醇產(chǎn)量的增加。

PAL 是苯丙氨酸代謝途徑中的一個關(guān)鍵酶，也是植物防御反應(yīng)中的一個標志性酶。它參與植物信號分子水楊酸、苯甲酸、苯甲異絲氨酸（紫杉醇側(cè)鏈）、酚和一系列與植物防御反應(yīng)相關(guān)化合物的合成[9]。靈芝誘導(dǎo)子處理后的紅豆杉細胞PAL 的活性顯著提高，細胞活力下降更迅速。靈芝誘導(dǎo)子添加后，在誘導(dǎo)前期促進了細胞的代謝，加快了細胞的生長凋亡，細胞活力明顯降低[25]；在誘導(dǎo)后期促使細胞生長保持穩(wěn)定、PAL 活性恢復(fù)正常，細胞活力保持穩(wěn)定。在細胞懸浮培養(yǎng)第8 天添加100 μg/mL 誘導(dǎo)子后，可能立刻誘導(dǎo)了相關(guān)基因的表達，并調(diào)控基因在短時間內(nèi)完成轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[26]。PAL的激活及酚的積累意味著植物防御反應(yīng)被啟動[27]。靈芝誘導(dǎo)子加入前期PPO 活性受到抑制，有利于細胞內(nèi)酚的積累，可能是因為細胞應(yīng)答真菌誘導(dǎo)劑的入侵，降低了PPO 活性，增加了酚類化合物的合成以減少損害[28]。隨著酚含量的增加，PPO 活性逐步上升，分解了多余的酚類，避免酚類過多對細胞自身的傷害[17]。保持適當濃度的酚類化合物有利于增加紫杉醇的產(chǎn)量[29]。本研究中，靈芝制備的真菌誘導(dǎo)子能有效激活南方紅豆杉細胞PAL 活性，提高細胞總酚含量，降低細胞活力和PPO 活性，說明靈芝誘導(dǎo)子可能通過介導(dǎo)植物的防御反應(yīng)來促進紫杉醇合成，靈芝誘導(dǎo)子的誘導(dǎo)前期可以降低紅豆杉細胞PPO 活性，從而提高愈傷組織的生長量，這與MARCHEV等[30]的研究結(jié)果一致。但靈芝誘導(dǎo)子的添加是否增強了紫杉醇合成相關(guān)基因的表達和紫杉醇合成過程中的關(guān)鍵酶活性，仍有待進一步研究。