衣藻對鹽脅迫下小麥幼苗光合生理指標的影響

王彥欽，孟憲剛，李武陽，羅光宏

（1.蘭州交通大學生物與制藥工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.河西學院甘肅省微藻工程技術(shù)研究中心，甘肅 張掖 734000）

鹽脅迫是植物生長發(fā)育過程中經(jīng)常遭遇的主要非生物脅迫之一。當植物遭遇鹽脅迫，自身會啟動保護機制，閉合氣孔以減少水分散失，而氣孔的閉合會導致葉片CO2濃度（Ci）下降，從而抑制暗反應(yīng)[1]。同時，高濃度的離子還會造成光類囊體解離，使葉綠體結(jié)構(gòu)遭到嚴重破壞，進而導致光反應(yīng)受到抑制[2]。因此，鹽脅迫會使作物光合效率降低，從而抑制其生長，最終導致產(chǎn)量降低[3]。此外，在鹽脅迫下，高等植物的水分運輸和抗氧化系統(tǒng)也會受到一定干擾，進而導致其產(chǎn)量和品質(zhì)降低[4]。據(jù)報道，我國耕地鹽漬化面積占總耕地面積的6.62%，達到了920.9 萬hm2[5]。加強鹽堿化土壤的綜合開發(fā)與運用，將對我國糧食安全起到重要作用[6]。

微藻是一類光合利用度高的低等自養(yǎng)生物，其分布廣泛，種類繁多，具有固碳、固氮等特性[7]。研究發(fā)現(xiàn)，微藻可以促進植物生長，提升植物抗逆性[8-11]。BABU 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，與不接種固氮藍藻的對照相比，接種固氮藍藻處理小麥在處理后14 d 鮮質(zhì)量增加30%～60%，干質(zhì)量增加14%～40%。鐘國民等[9]研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用藻類活性細胞生物肥能促進水稻分蘗，提高成穗率、有效穗數(shù)、結(jié)實率和實粒數(shù)，進而提高水稻產(chǎn)量。XU 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，纖細席藻產(chǎn)生的多糖可以提高植株的K+、Ca2+、Mg2+含量及光合活性；增強超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低活性氧含量，減少氧化損傷；還可以促進檸條、錦雞兒的種子萌發(fā)和幼苗新陳代謝。杜氏鹽藻和其β-胡蘿卜素提取物可以提升中度鹽脅迫下南瓜總生物量、產(chǎn)量、光合色素含量以及抗氧化物質(zhì)含量等，進而提升南瓜抗中度鹽脅迫的能力[11]。

衣藻是綠藻門衣藻科的單細胞藻類，其產(chǎn)生的孢子具有極強的耐受性，且藻株對環(huán)境無污染，對人畜沒有致病性[12]。衣藻具有作為生物肥料的潛能，在鹽脅迫環(huán)境下可以積累大量海藻糖，而海藻糖具有優(yōu)良的滲透調(diào)節(jié)作用[13-14]。目前，衣藻在植物上的研究主要集中于提升土壤肥力[15]、促進植物生長[16]方面，在鹽脅迫下植物上的應(yīng)用研究鮮見報道，且衣藻對植物光合作用的影響尚不明確。為此，采用德巴衣藻（Chlamydomonas debaryana）藻粉作為試驗材料，研究其對鹽脅迫下小麥幼苗光合生理指標的影響，為衣藻粉在鹽脅迫下小麥上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試小麥品種為長豐2112，購自張掖當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場；衣藻藻粉由甘肅凱源微藻工程技術(shù)中心生產(chǎn)的微藻（德巴衣藻）干燥制成。

1.2 試驗設(shè)計

采用20% 過氧化氫對小麥種子表面消毒15 min，然后用無菌水沖洗3 次，最后置于溫度為25 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)24 h。待種子發(fā)芽后，挑選萌發(fā)一致的種子放入清洗滅菌后的砂土盆中，并將其置于25 ℃、12 h 光照[300 μmol/（m2·s）]/12 h 黑暗的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，向砂土盆內(nèi)繼續(xù)添加清水保持砂土濕潤，用于催發(fā)小麥種子。待小麥長至兩心一葉時，進行鹽脅迫處理，共設(shè)6個處理，CK：每天施加50 mL 無菌水；T0—T4：連續(xù)5 d每天施加50 mL 150 mmol/L 的NaCl 溶液，從添加NaCl 溶液當日開始，T1—T4 處理分別每3 d 添加50 mL 0.25、0.5、1.0、2.0 g/L 的衣藻藻液，T0 處理同時添加50 mL 無菌水，共添加5 次。然后測定各生理指標。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 光合色素含量 處理后12 d，取0.1 g 小麥葉片，將其研磨搗碎后加入5 mL 80%丙酮溶液，低溫超聲處理20 min，于4 ℃放置24 h，離心后，取上清液，利用DR 600 紫外分光光度計分別在波長663、646、470 nm 處測定吸光值，以80%丙酮為空白對照。按下列公式計算葉綠素a、b和類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度。

式中，Ca、Cb和Cxc分別代表葉綠素a、b和類胡蘿卜素的質(zhì)量濃度。

1.3.2 光合氣體交換參數(shù) 分別于處理后3、6、9、12 d，選取生長健壯、一致的小麥10 株，選取受光方向一致的旗葉，測定其凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（Tr）、氣孔導度（Gs）和Ci，重復(fù)測量3次。

1.3.3 葉綠素熒光參數(shù) 分別于處理后3、6、9、12 d，選取生長健壯、一致的小麥10 株，在環(huán)境溫度為25 ℃的情況下，于9：00 選取受光方向一致的旗葉，所選葉片暗適應(yīng)30 min后，在距葉尖3 cm 處，利用Handy PEA 植物效率儀測定葉綠素熒光參數(shù)光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）最大光化學效率（Fv/Fm），恢復(fù)光照后測定光化學淬滅系數(shù)（qP）、非光化學淬滅系數(shù)（qN）、PSⅡ?qū)嶋H光量子產(chǎn)量[（Y（Ⅱ）]和電子傳遞速率（ETR）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2013 進行整理，用SPSS 21.0軟件進行方差分析，用OriginPro 8.5軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 衣藻質(zhì)量濃度對鹽脅迫下小麥幼苗葉片光合色素含量的影響

由表1 可知，與CK 相比，T0 處理小麥幼苗葉片葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和總?cè)~綠素含量分別降低48.1%、25.0%、43.8%和43.4%。添加不同質(zhì)量濃度的衣藻藻液后，除葉綠素b含量外，其他色素含量總體均較T0處理顯著提高。添加衣藻藻液后，對于葉綠素a 含量，各處理均較T0 處理顯著提高，表現(xiàn)為T4＞T3＞T2＞T1＞T0，僅T3和T4處理間差異不顯著；對于葉綠素b 含量，總體上有所升高，但各處理間差異不顯著；對于類胡蘿卜素含量，各處理均顯著提高，表現(xiàn)為T4＞T3＞T2＞T1＞T0，T4 處理最高，接近CK，較T0 處理提高71.1%；對于總?cè)~綠素含量，各處理總體上均顯著提高，表現(xiàn)為T4＞T3＞T2＞T1＞T0，僅T1處理與T0處理差異不顯著。

表1 衣藻質(zhì)量濃度對鹽脅迫下小麥幼苗葉片光合色素含量的影響Tab.1 Effect of concentration of Chlamydomonas debaryana on photosynthetic pigment content in wheat seedling leaves under salt stressng/g

2.2 衣藻質(zhì)量濃度對鹽脅迫下小麥幼苗葉片光合氣體交換參數(shù)的影響

2.2.1 Pn 如圖1 所示，處理后3～12 d，T0—T4 處理小麥幼苗葉片Pn 均低于CK；隨著處理后時間的推進，CK Pn 稍有降低，變化不明顯，T0—T1 處理Pn逐漸降低，T2—T4 處理Pn 逐漸升高。在處理后3 d，T0—T4處理間Pn無明顯差異；處理后6 d，T0—T4 處理間Pn 開始出現(xiàn)明顯差異，表現(xiàn)為T3＞T4＞T3＞T1＞T0；處理后9 d，Pn 仍表現(xiàn)為T3＞T4＞T3＞T1＞T0，T3 處理較T0 處理提高37.5%，T2—T4 處理較處理后6 d 提高，與CK 間的差距較處理后6 d 縮小，而T0—T1處理較處理后6 d降低；處理后12 d，T2—T4處理Pn 繼續(xù)提高，尤其是T3 處理，與CK 間的差距進一步縮小，T0—T1處理Pn繼續(xù)降低。

圖1 衣藻質(zhì)量濃度對鹽脅迫下小麥幼苗葉片Pn的影響Fig.1 Effect of Chlamydomonas debaryana concentration on Pn of leaves of wheat seedlings under salt stress

2.2.2 Tr 如圖2所示，處理后3～12 d，T0—T4處理小麥幼苗葉片Tr 均低于CK；隨著處理后時間的推進，T0—T4 處理Tr 明顯降低，CK 總體上稍微降低，T0—T4 處理與CK 間的差距逐漸變大。處理后3 d，Tr表現(xiàn)為CK＞T4＞T3＞T1＞T2＞T0；處理后6 d，Tr表現(xiàn)為CK＞T2＞T4＞T3＞T1＞T0，T0—T4 處理與CK 間的差距較處理后3 d 加大；處理后9 d，Tr 表現(xiàn)為CK＞T3＞T4＞T2＞T1＞T0，T0—T4 處理與CK 間的差距較處理后6 d 加大；處理后12 d，Tr 表現(xiàn)與處理后9 d 一致，T0—T4處理與CK間的差距達到最大，T0處理較CK降低37.8%，T3 和T4 處理分別較CK 降低21.8%和22.9%。

圖2 衣藻質(zhì)量濃度對鹽脅迫下小麥幼苗葉片Tr的影響Fig.2 Effect of Chlamydomonas debaryana concentration on Tr of leaves of wheat seedlings under salt stress

2.2.3 Gs 如圖3所示，處理后3～12 d，隨著處理后時間的推進，T0—T4 處理小麥幼苗葉片Gs 逐漸降低，CK 先降低后升高；隨著衣藻質(zhì)量濃度增加，Tr總體上先升高后降低，處理后3 d、9 d 和10 d 均以T3 處理最高，處理后6 d 以T2 處理最高，總體以T0處理最低；T0—T4 處理Tr 均明顯低于CK，T0—T4處理Tr 與CK 間的差距在處理后12 d 最大，且T3 和T4 處理與T0 處理間的差距也在處理后12 d 最大，分別較T0處理提高25.24%和22.33%。

圖3 衣藻質(zhì)量濃度對鹽脅迫下小麥幼苗葉片Gs的影響Fig.3 Effect of Chlamydomonas debaryana concentration on Gs of leaves of wheat seedlings under salt stress

2.2.4 Ci 如圖4 所示，處理后3～12 d，隨著處理后時間的推進，CK 小麥幼苗葉片Ci無明顯變化，T0—T1 處理先降低后趨于平穩(wěn)，T2—T4 處理先降低后升高；T0—T4 處理間Ci 在處理后3 d 和6 d 差異均不明顯，在處理后9 d 和12 d 差異變大，尤其是處理后12 d，處理后9 d 和12 d Ci 均表現(xiàn)為T3＞T4＞T2＞T1＞T0，在處理后12 d T3處理較T0處理提高62.4%。

圖4 衣藻質(zhì)量濃度對鹽脅迫下小麥幼苗葉片Ci的影響Fig.4 Effect of Chlamydomonas debaryana concentration on Ci of leaves of wheat seedlings under salt stress

2.3 衣藻質(zhì)量濃度對鹽脅迫下小麥幼苗葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

2.3.1 Fv/Fm 如圖5 所示，處理后3～12 d，隨著處理后時間的推進，CK 小麥幼苗葉片F(xiàn)v/Fm 變化不大，維持在0.825～0.850，高于T0—T4 處理；T0—T4處理Fv/Fm 變化均較大，T0 和T2 處理均呈下降趨勢，T3和T4處理均呈先下降后增加的趨勢，T1處理呈先下降后升高再下降的趨勢；T0—T4處理間Fv/Fm差異總體上逐漸增大。處理后9 d 和12 d，F(xiàn)v/Fm 均表現(xiàn)為CK＞T3＞T4＞T2＞T1＞T0；處理后12 d，T0 處理與CK間的差距達到最大，較CK降低7.3%。

圖5 衣藻質(zhì)量濃度對鹽脅迫下小麥幼苗葉片F(xiàn)v/Fm的影響Fig.5 Effect of Chlamydomonas debaryana concentration on Fv/Fm of leaves of wheat seedlings under salt stress

2.3.2 qP 如圖6所示，處理后3～12 d，隨著處理后時間的推進，CK 小麥幼苗葉片qP變化不明顯，均遠高于T0—T4 處理；T0—T4 處理qP 變化均較大，T0處理呈下降趨勢，T1處理呈先下降后趨于平穩(wěn)的趨勢，T2—T4 處理均呈先下降后升高的趨勢；T0—T4處理間qP差異總體上逐漸增大。處理后12 d，qP表現(xiàn)為CK＞T3＞T4＞T2＞T1＞T0，T3 和T4 處理間差異較小，兩者與T0處理間的差距均達到最大。

圖6 衣藻質(zhì)量濃度對鹽脅迫下小麥幼苗葉片qP的影響Fig.6 Effect of Chlamydomonas debaryana concentration on qP of leaves of wheat seedlings under salt stress

2.3.3 qN 如圖7所示，處理后3～12 d，隨著處理后時間的推進，CK小麥幼苗葉片qN先下降后升高，以處理后6 d 最低；T0 處理qN 先升高后趨于平穩(wěn)；T1—T4 處理qN 先升高后降低。在處理后6、9 d，T1—T4 處理qN 均高于CK、低于T0 處理；在處理后12 d，T1—T2 處理均高于CK，T3—T4 處理均低于CK，T1—T4處理均低于T0處理。

圖7 衣藻質(zhì)量濃度對鹽脅迫下小麥幼苗葉片qN的影響Fig.7 Effect of Chlamydomonas debaryana concentration on qN of leaves of wheat seedlings under salt stress

2.3.4 Y（Ⅱ） 如圖8 所示，處理后3～12 d，隨著處理后時間的推進，CK 小麥幼苗葉片Y（Ⅱ）略有波動，高于T0—T4 處理；T0 處理小麥幼苗葉片Y（Ⅱ）一直下降，T1—T4 處理Y（Ⅱ）均先下降后升高最后趨于平緩，以處理后9 d 最高。處理后6、9、12 d，T1—T4 處理Y（Ⅱ）均高于T0 處理，T2—T4 處理Y（Ⅱ）均高于T1 處理，且T2—T4 處理間差異很小。處理后12 d，T3 和T4 處理Y（Ⅱ）分別較T0 處理提高31.35%和31.59%。

圖8 衣藻質(zhì)量濃度對鹽脅迫下小麥幼苗葉片Y（Ⅱ）的影響Fig.8 Effect of Chlamydomonas debaryana concentration on Y（Ⅱ）of leaves of wheat seedlings under salt stress

2.3.5 ETR 如圖9 所示，處理后3～12 d，隨著處理后時間的推進，CK 小麥幼苗葉片ETR 輕微波動，高于T0—T4 處理；而T0 處理在處理后3～9 d 急速下降，并在12 d 時達到最小，在處理后6～12 d，明顯低于T1—T4 處理；T1 處理ETR 下降；T2 處理ETR 先下降后緩慢升高；T3—T4 處理ETR 均變化不大，在處理后6～12 d，高于T0—T2處理。

圖9 衣藻質(zhì)量濃度對鹽脅迫下小麥幼苗葉片ETR的影響Fig.9 Effect of Chlamydomonas debaryana concentration on ETR of leaves of wheat seedlings under salt stress

3 結(jié)論與討論

光合色素分子參與光合作用的原初反應(yīng)且是類囊體的重要組成部分，光合色素含量在一定程度上可以表征植物光合作用的強弱，反映植物的健康程度[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫條件下植物葉片的光合色素含量顯著下降[18-19]，葉綠素a/b 出現(xiàn)嚴重失調(diào)，從而導致光合作用減弱[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫條件下，小麥葉片的葉綠素含量和葉綠素a/b 均明顯下降，這與朱玉雪等[21]的研究結(jié)果一致。而施加藻液的各處理（T1—T4）小麥葉片的葉綠素a和總?cè)~綠素含量及類胡蘿卜素含量均高于T0處理，尤其是T3、T4處理，兩者葉綠素a和葉綠素b含量無明顯差異。這是因為微藻分泌的胞外多糖等物質(zhì)可增強植物抗氧化酶活性，降低植物葉綠體內(nèi)的活性氧含量，從而抑制光合色素分子的降解，提高小麥各種光合色素含量，改善葉綠素a/b，進而提升光合速率[22-23]。

當植物受到鹽脅迫時，氣體交換參數(shù)會發(fā)生顯著變化，凈光合速率下降，造成這種變化的原因是氣孔或者非氣孔因素，它們的區(qū)別在于Pn、Ci、Gs三者的變化趨勢。當高等植物的Gs、Ci、Pn 同時上升或下降時，氣孔因素占主導作用；當Pn 與Gs、Ci 變化趨勢相反時，非氣孔因素占主導作用[24]。在本研究中，在處理后3～12 d，各衣藻藻液處理（T1—T4）小麥葉片Pn 總體上均高于T0 處理，說明衣藻能改善鹽脅迫下小麥葉片Pn。T0 處理小麥幼苗的Pn、Gs 和Ci 在處理后3～12 d 明顯低于CK，說明在鹽脅迫條件下，小麥葉片Pn 下降的主導因素是氣孔因素。此外，施加衣藻藻液的各處理（T1—T4）在處理后6～12 d，小麥葉片Gs、Ci 均高于T0 處理，說明衣藻影響鹽脅迫下小麥葉片Pn 的因素主要是氣孔因素。本研究中，T2—T4 處理在處理后6～12 d Pn 明顯高于T0處理，以T3處理效果最佳。

原初反應(yīng)后所固定的光能主要有3 個去向，主要部分流向PSⅡ，另外兩部分用于熱耗散和以熒光的形式散發(fā)出去。葉綠素熒光檢測技術(shù)正是基于此原理，通過檢測植物發(fā)出的熒光信號來表征葉片光系統(tǒng)對光能的吸收、傳遞、耗散和分配的內(nèi)在特征[25-26]。其中，F(xiàn)v/Fm 在高等植物中一般維持在0.80～0.85，而在植物受到外部脅迫時會迅速下降；此外，qP、ETR、Y（Ⅱ）也會下降，而qN 因光合機構(gòu)產(chǎn)生更多過剩光能而增加。因此，F(xiàn)v/Fm、qP、ETR、Y（Ⅱ）和qN 可以體現(xiàn)小麥受鹽脅迫的程度和葉片吸收、轉(zhuǎn)化光能的能力[27]。本研究中，T0 處理小麥葉片F(xiàn)v/Fm、qP、ETR、Y（Ⅱ）在處理后3～12 d均低于CK；而qN 高于CK。處理后12 d T0 處理Fv/Fm、qP、ETR、Y（Ⅱ）較處理后3 d 均降低，這與其他人對鹽脅迫下小麥[28]和桑樹[27]的研究結(jié)果類似。這些結(jié)果說明小麥的光合生理過程對鹽脅迫響應(yīng)明顯，鹽脅迫導致小麥葉片對光能的吸收和轉(zhuǎn)換能力變?nèi)酰琍SⅡ反應(yīng)中心開放程度降低，產(chǎn)生的過剩光能增加。本研究中，施加衣藻藻液處理（T1—T4）Fv/Fm、ETR、Y（Ⅱ）、qP總體上在處理后6、9、12 d均高于T0處理，而qN低于T0處理，這與其他促生長物質(zhì)或肥料[29-32]對小麥葉綠素熒光參數(shù)的影響類似。在處理后9、12 d，T3 處理Fv/Fm、qP、ETR、Y（Ⅱ）和qN 與T4 處理差異不大，而T4 處理衣藻藻液的用量是T3處理的2 倍，從效果和經(jīng)濟性兩方面評估，添加1.0 g/L 衣藻藻液為宜。說明衣藻能夠有效改善鹽脅迫下小麥葉片對光能的吸收和轉(zhuǎn)換能力，維持PSⅡ反應(yīng)中心的開放程度和PSⅡ的功能，增加對過剩光能的熱耗散以提高對光合機構(gòu)的保護作用，從而提升小麥葉片整體的光合作用能力。