利多卡因對氧糖剝奪/復氧誘導神經(jīng)細胞損傷的影響及機制

楊文俊，許楠，董家瑞，黃天豐，李潤林

1 揚州大學醫(yī)學院附屬江都人民醫(yī)院麻醉科，江蘇揚州 225200；2 江蘇省蘇北人民醫(yī)院麻醉科

目前腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機制尚未闡明，同時缺乏有效的治療藥物［1-2］。研究表明，神經(jīng)細胞氧化應激、凋亡等可引起神經(jīng)細胞損傷進而促進腦缺血再灌注損傷的發(fā)生［3-4］。利多卡因是常用的一種酰胺類麻醉藥物，具有抗炎作用，并可能通過抑制炎癥反應的發(fā)生減輕急性肺損傷［5］。但利多卡因與腦缺血再灌注損傷關系的相關研究相對較少。miR-125b-5p 在急性心肌梗死中表達下調，上調其表達可抑制心肌細胞凋亡從而改善急性心肌梗死后心臟功能［6］。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路在細胞增殖、凋亡等過程中可發(fā)揮重要調控作用，激活該信號通路可抑制細胞凋亡及促進細胞增殖［7］。但miR-125b-5p/PI3K/Akt 信號軸在腦缺血再灌注損傷中的作用機制尚未有研究報告。2019 年11 月—2020 年10 月，本研究采用氧糖剝奪/復氧（OGD/R）誘導大鼠腎上腺嗜鉻細胞（PC12 細胞）損傷，探討利多卡因對神經(jīng)細胞損傷的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 PC12細胞購自上海弘順生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco 公司；RNeasy Mini Kit 試劑購自北京全式金生物有限公司；反轉錄及實時熒光定量PCR 試劑購自美國Thermo Fisher 公司；Lipofectamine2000、3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基溴化四唑（MTT）試劑與凋亡檢測試劑購自北京索萊寶科技有限公司；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；miR-125b-5p 模擬物（miR-125b-5p mimics）、miR-125b-5p 抑制劑（anti-miR-125b-5p），模擬物及抑制劑陰性對照（miR-NC，anti-miR-NC）購自廣州銳博生物科技有限公司；兔抗鼠剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved-caspase-3）、Bcl2 關聯(lián)X蛋白（Bax）一抗、二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗鼠磷酸化磷脂酰肌醇3 激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）一抗購自美國Santa Cruz公司。低溫離心機購自德國Eppendorf公司；超低溫冰箱購自中國海爾電器優(yōu)先公司；細胞培養(yǎng)板購自北京博爾邁生物技術有限公司；恒溫水浴鍋購自上海赫田科學儀器有限公司，超凈工作臺購自上海赫田科學儀器有限公司；移液槍購自德國Eppendorf公司；PCR 儀購自德國Eppendorf 公司；渦旋振蕩器否自海門市其林貝爾公司；7500 實時熒光定量PCR 儀購自美國ABI公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 將PC12細胞從超低溫冰箱中取出，置于37 ℃恒溫水浴鍋中解凍后，1 000 r/min離心5 min（半徑17.5 cm），棄上清液，向細胞沉淀中加入適量含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，反復吸打至細胞充分溶解，于滅菌的培養(yǎng)瓶中裝入培養(yǎng)液制成細胞懸液，隨后在含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 天更換1 次新鮮培養(yǎng)液，當培養(yǎng)瓶中細胞生長融合至約90%時，進行傳代培養(yǎng)。棄上清液，PBS洗滌后用胰蛋白酶進行消化，當細胞開始漂浮、細胞形態(tài)在倒置顯微鏡下觀察呈圓形時，加入適量完全培養(yǎng)液終止消化。1 000 r/min 離心3 min（半徑17.5 cm），棄上清，加入新鮮培養(yǎng)液接種至培養(yǎng)瓶，在含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 細胞分組及干預、轉染方法 將細胞隨機分為對照組、模型組、低濃度組、中濃度組、高濃度組、miR-NC+模型組、miR-125b-5p+模型組、anti-miRNC+高濃度組、anti-miR-125b-5p+高濃度組。對照組為正常培養(yǎng)的PC12 細胞。模型組細胞接種于無糖平衡鹽溶液中，于37 ℃下5% CO2、1% O2、94% N2培養(yǎng)箱內缺氧處理6 h，棄培養(yǎng)基并更換為含有4.5 g/L葡萄糖的培養(yǎng)基，于37 ℃下5% CO2、95%空氣的培養(yǎng)箱內復氧24 h［8］，制備OGD/R 細胞模型。低濃度組、中濃度組、高濃度組細胞接種于6孔板（1×105/孔）分別加入2.5、5、10 μmol/L利多卡因共孵育24 h［9］，進行OGD/R 處理。miR-NC+模型組、miR-125b-5p+模型組細胞生長融合至70%時，分別用脂質體轉染將miR-NC、miR-125b-5p mimics 轉染至細胞，轉染成功后，進行OGD/R處理。anti-miR-NC+高濃度組、antimiR-125b-5p+高濃度組分別轉染anti-miR-NC、antimiR-125b-5p，轉染成功后加入濃度為10 μmol/L 利多卡因的培養(yǎng)24 h，然后進行OGD/R處理。

1.4 細胞活力檢測 采用MTT 法。收集各組細胞，接種于96 孔板，2×103/孔；每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，37 ℃孵育4 h，棄細胞上清液，用DMSO 溶液溶解形成的MTT 晶體，用酶標儀測量波長490 nm處吸光度值（A值）。

1.5 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術。收集各組細胞，用胰蛋白酶消化處理，1 000 g離心5 min（半徑6 cm），去上清液后，將細胞（1×106）重新懸浮在結合緩沖液中。用Annexin V-FITC （5 μL）和PI（5 μL）對細胞進行染色，用FACS Calibur 流式細胞儀分析細胞凋亡，計算凋亡率。

1.6 miR-125b-5p 表達檢測 采用實時熒光定量PCR 法。取各組細胞，用RNeasy Mini Kit 試劑分離總RNA，用外分光光度計測定RNA 濃度后，將總RNA 合成cDNA，隨后采用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行實時熒光定量PCR擴增。反應體系：cDNA 2 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、MgSO42.5 μL、正反向引物各0.5 μL、dNTPs 2.5 μL，RNase-Free ddH2O 補足體系至25 μL；反應條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s共40 個循環(huán)，72 ℃充分延伸10 min。在延伸階段收集熒光信號，計算樣品的Ct 值并通過2-ΔΔCt法計算miR-125b-5p相對表達量。

1.7 凋亡相關蛋白（Cleaved-caspase-3、Bax 蛋白）、PI3K/Akt信號通路相關蛋白（p-PI3K、p-Akt蛋白）表達檢測 采用Western blotting 法。取各組細胞，用RIPA裂解緩沖液收集細胞提取物，并通過BCA測定試劑盒測定總蛋白濃度。每個樣品裝載40 μg 蛋白質到10% SDS-PAGE 上進行分離，然后將電泳后的蛋白質轉移到硝化纖維素膜上。將膜封閉在5%脫脂牛奶中，加入Cleaved-caspase-3（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、p-PI3K（1∶800）、p-Akt（1∶800）一抗與內參β-actin抗體（1∶2 000）稀釋液，4 ℃孵育過夜，加入二抗稀釋液（1∶3 000）37 ℃孵育2 h。用ECL化學發(fā)光法檢測蛋白條帶，用Quantity One軟件進行定量分析。

1.8 氧化應激相關指標［丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）］檢測 采用微板法、WST-1 法及鉬酸銨法進行檢測。收集各組細胞，棄上清，收集細胞，用反復凍融法進行裂解，將上清液轉移至試管中，每個標準試管加入標準溶液，空白試管中加入蒸餾水，以上試管中均加入反應液，孵育1 h，500 g 離心5 min（半徑6 cm），取上清液，用酶標儀測定波長532、450、405 nm 處的吸光度值（A 值）。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗；兩組比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 利多卡因對OGD/R 誘導后PC12 細胞活力的影響 對照組、模型組、低濃度組、中濃度組、高濃度組細胞活力（A值）分別為1.12 ± 0.10、0.53 ± 0.05、0.67 ± 0.06、0.86 ± 0.07、1.03 ± 0.08。與對照組比較，模型組細胞活力低（P＜0.05）；與模型組比較，低濃度組、中濃度組、高濃度組細胞活力高（P均＜0.05）；不同濃度組細胞活力（A 值）比較差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。相對于模型組，高濃度組細胞活力恢復接近50%，所以選擇高濃度進行后續(xù)實驗。

2.2 利多卡因對OGD/R 誘導后PC12細胞凋亡、氧化應激的影響 見表1。

表1 各組細胞凋亡相關指標及氧化應激相關指標比較（± s）

表1 各組細胞凋亡相關指標及氧化應激相關指標比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與低濃度組比較，&P＜0.05；與中濃度組比較，△P＜0.05。

組別細胞凋亡相關指標氧化應激相關指標CAT（U/mg）11.63 ± 0.93 4.37 ± 0.37*6.03 ± 0.51#8.86 ± 0.72#&10.38 ± 0.91#&△Cleaved-caspase-3 0.38 ± 0.03 0.86 ± 0.07*0.73 ± 0.06#0.58 ± 0.04#&0.41 ± 0.04#&△凋亡率（%）9.02 ± 0.73 28.76 ± 2.28*23.74 ± 1.86#15.18 ± 1.18#&11.53 ± 0.82#&△SOD（U/mg）17.19 ± 1.51 5.37 ± 0.41*7.61 ± 0.55#11.91 ± 1.01#&15.48 ± 1.27#&△Bax 0.45 ± 0.03 0.93 ± 0.07*0.80 ± 0.08#0.62 ± 0.05#&0.51 ± 0.04#&△MDA（μmol/g）17.13 ± 1.23 34.27 ± 2.93*29.13 ± 1.87#23.04 ± 1.52#&19.53 ± 1.63#&△對照組模型組低濃度組中濃度組高濃度組

2.3 利多卡因對OGD/R 誘導后PC12 細胞miR-125b-5p表達的影響 對照組、模型組、低濃度組、中濃度組、高濃度組miR-125b-5p 相對表達量分別為1.00 ± 0.08、0.38 ± 0.03、0.49 ± 0.03、0.63 ± 0.06、0.86 ± 0.08。與對照組比較，模型組miR-125b-5p相對表達量低（P＜0.05）；與模型組比較，低濃度組、中濃度組、高濃度組miR-125b-5p相對表達量高（P均＜0.05）；低濃度組、中濃度組、高濃度組miR-125b-5p相對表達量依次升高（P均＜0.05）。

2.4 miR-125b-5p 高表達對OGD/R 誘導后PC12 細胞的影響 miR-NC+模型組、miR-125b-5p+模型組miR-125b-5p相對表達量分別為1.00 ± 0.09、2.31 ±0.18，比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示轉染成功。

與miR-NC+模型組比較，miR-125b-5p+模型組細胞活力（A值）高，細胞凋亡率及Cleaved-caspase-3、Bax 蛋白相對表達低，MDA 水平低，SOD、CAT 水平高（P均＜0.05），見表2。

表2 miR-NC+模型組與miR-125b-5p+模型組細胞活力、凋亡相關指標及氧化應激相關指標比較（± s）

表2 miR-NC+模型組與miR-125b-5p+模型組細胞活力、凋亡相關指標及氧化應激相關指標比較（± s）

組別miR-NC+模型組miR-125b-5p+模型組P細胞活力（A值）0.54 ± 0.04 1.07 ± 0.09＜0.05細胞凋亡相關指標凋亡率（%）28.72 ± 2.31 10.05 ± 0.91＜0.05 Cleaved-caspase-3 0.87 ± 0.08 0.37 ± 0.03＜0.05 Bax 0.94 ± 0.08 0.42 ± 0.03＜0.05氧化應激相關指標MDA（μmol/g）34.35 ± 3.10 15.83 ± 0.98＜0.05 SOD（U/mg）5.41 ± 0.42 17.04 ± 1.25＜0.05 CAT（U/mg）4.41 ± 0.36 14.59 ± 1.17＜0.05

2.5 miR-125b-5p低表達對利多卡因作用的影響anti-miR-NC+高濃度組、anti-miR-125b-5p+高濃度組miR-125b-5p相對表達量分別為1.00 ± 0.08、0.45 ±0.03，比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與antimiR-NC+高濃度組比較，anti-miR-125b-5p+高濃度組細胞活力（A 值）低，細胞凋亡率及Cleaved-caspase-3、Bax 蛋白相對表達量高，MDA 水平高，SOD、CAT水平低（P均＜0.05）。見表3。

表3 anti-miR-NC+高濃度組與anti-miR-125b-5p+高濃度組細胞活力、凋亡相關指標及氧化應激相關指標比較（± s）

表3 anti-miR-NC+高濃度組與anti-miR-125b-5p+高濃度組細胞活力、凋亡相關指標及氧化應激相關指標比較（± s）

組別miR-NC+模型組miR-125b-5p+模型組P細胞活力（A值）1.031 ± 0.09 0.513 ± 0.05＜0.05細胞凋亡率（%）11.48 ± 0.93 25.13 ± 1.89＜0.05 Cleaved-caspase-3 0.42 ± 0.04 0.84 ± 0.08＜0.05 Bax 0.49 ± 0.04 0.91 ± 0.08＜0.05 MDA（μmol/g）19.61 ± 1.52 36.07 ± 2.27＜0.05 SOD（U/mg）15.51 ± 1.08 6.10 ± 0.51＜0.05 CAT（U/mg）10.32 ± 0.85 4.93 ± 0.41＜0.05

2.6 miR-125b-5p 低表達對PI3K/Akt 信號通路相關蛋白表達的影響 見表4。

表4 各組PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達比較（± s）

表4 各組PI3K/Akt信號通路相關蛋白表達比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與antimiR-NC+高濃度組比較，&P＜0.05。

p-Akt 0.63 ± 0.06 0.29 ± 0.02*0.69 ± 0.06#0.67 ± 0.06 0.31 ± 0.03&組別對照組模型組高濃度組anti-miR-NC+高濃度組anti-miR-125b-5p+高濃度組p-PI3K 0.81 ± 0.07 0.39 ± 0.04*0.83 ± 0.07#0.82 ± 0.07 0.40 ± 0.04&

3 討論

利多卡因是一種酰胺類局部麻醉劑，可注射也可作表面麻醉用于緩解臨床治療中的局部疼痛、神經(jīng)性疼痛和痛覺過敏［10］。然而，除了多種麻醉作用外，利多卡因還被證實在多種疾病中具有治療作用。有研究表明，利多卡因可抑制癌細胞的生長和遷移，從而抑制胃癌、肝癌、結直腸癌等多種癌癥的生長［11-12］；可抑制糖尿病大鼠體內炎癥因子的分泌以及血管平滑肌細胞遷移和增殖，改善血管壁結構重構，從而參與糖尿病心血管疾病的治療［13］；抑制缺氧誘導的細胞凋亡以細胞中炎癥因子的表達，改善缺氧誘導的心機損傷［14］。此外，利多卡因可通過抑制氧化應激、神經(jīng)炎癥反應，減輕神經(jīng)元死亡和凋亡，從而改善缺血/再灌注小鼠的腦損傷［15］。以上結果證實，利多卡因可緩解缺血再灌注損傷。本研究采用OGD/R 刺激神經(jīng)元細胞，體外模仿腦缺血再灌注損傷環(huán)境，導致細胞活力受到抑制，凋亡增加，與之前研究［16］結果一致。進一步分析表明，利多卡因可逆轉OGD/R 介導的細胞活力抑制及凋亡；Caspase-3 激活后產生Cleaved caspase-3，是介導細胞凋亡的關鍵活性形式，此外，Bax 是一個促癌蛋白。本研究還發(fā)現(xiàn)，利多卡因抑制模型組中Cleaved-caspase-3 和Bax 蛋白表達，進一步表明利多卡因可逆轉OGD/R介導的細胞凋亡。此外，利多卡因降低OGD/R 誘導的細胞中MDA 水平，升高SOD、CAT 水平，與之前研究［17］結果相似。提示利多卡因可抑制OGD/R誘導的神經(jīng)細胞氧化應激。

有研究表明，miRNA 在腦缺血再灌注損傷中表達異常，并可通過靶向調控靶mRNA 表達從而參與腦缺血再灌注損傷過程，還可能作為減輕腦缺血再灌注損傷的潛在靶點［18-19］。心肌缺血再灌注損傷后miR-125b-5p表達下調，上調其表達可抑制缺氧/再灌注誘導的小鼠心房肌細胞凋亡，從而減輕細胞損傷［20］。急性肺損傷患者低表達miR-125b-5p，體外上調其在細胞中的表達可通過細胞凋亡及炎癥反應緩解細胞損傷［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，OGD/R導致神經(jīng)細胞中miR-125b-5p表達下調，而利多卡因可升高miR-125b-5p表達，提示利多卡因可能通過上調miR-125b-5p表達而抑制腦缺血再灌注損傷。進一步分析結果顯示，細胞中miR-125b-5p過表達可以逆轉OGD/R介導的細胞凋亡促進，增殖抑制以及氧化應激反應，而抑制其表達可逆轉利多卡因對OGD/R誘導后神經(jīng)細胞的保護作用。提示利多卡因可通過上調miR-125b-5p表達發(fā)揮對神經(jīng)元細胞的抗氧化作用，促進細胞存活。

PI3K 被激活后形成p-PI3K，進而激活下游基因Akt磷酸化形成p-Akt，進一步調控細胞增殖及凋亡，從而參與多種疾病的發(fā)展［22］。本研究結果顯示，OGD/R 誘導后神經(jīng)細胞中p-PI3K、p-Akt 蛋白表達降低，而利多卡因可升高p-PI3K、p-Akt 表達，抑制miR-125b-5p 表達可逆轉利多卡因的以上作用。提示利多卡因可通過miR-125b-5p/PI3K/Akt 信號軸減輕OGD/R誘導的神經(jīng)細胞損傷。

綜上所述，利多卡因可促進OGD/R誘導后神經(jīng)細胞增殖，抑制細胞凋亡、氧化應激，該作用可能與miR-125b-5p/PI3K/Akt信號軸有關。