從NLRP3/Caspase-1/GSDMD信號通路探討健心顆粒對糖尿病心肌病大鼠心肌焦亡的影響

程慧娟，陳永忠，林倩倩，郭進(jìn)建*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；2.福建三博福能腦科醫(yī)院，福建 福州 350025）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是指糖尿病患者所產(chǎn)生的一種嚴(yán)重心肌疾病，是排除高血壓、冠心病、心臟瓣膜病及其他心血管疾病后的特異性心肌結(jié)構(gòu)與功能的異常?；颊咄鶗霈F(xiàn)心律失常、心力衰竭、心源性休克甚至猝死，給家庭和社會帶來極大危害。有研究表明，DCM 的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞焦亡關(guān)系密切［1-2］。因此，抑制心肌細(xì)胞的焦亡可以有效防御DCM 的發(fā)生、發(fā)展，干預(yù)焦亡信號通路將是治療DCM 的新策略［3］。DCM 屬中醫(yī)學(xué)“消渴”“消癉”“心痛”“心衰”“喘證”等范疇，而現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為，因其兼有“消渴”及“心病”的癥狀，故可命名為“消渴病心病”。此病屬本虛標(biāo)實，以陰液虧損、氣陰兩虛為本，日久陰損及陽，并出現(xiàn)血瘀、痰濁、水飲之標(biāo)實，而且這些邪實可兼見同病，形成痰飲內(nèi)阻、痰瘀互結(jié)、瘀滯飲停等變化。臨床研究證實，健心顆粒能改善DCM 患者的左室功能，降低空腹血糖及血漿N 末端B 型利鈉肽原（NT-proBNP）水平［4］。既往動物實驗研究已表明，可通過調(diào)控NLRP3/Caspase-1/GSDMD 通路改善DCM 模型的心肌焦亡和纖維化［5］。本研究通過制備DCM 大鼠模型，觀察健心顆粒對大鼠心肌細(xì)胞焦亡和NLRP3/Caspase-1/GSDMD信號傳導(dǎo)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF 級健康雄性SD 大鼠40 只，約6 周齡，體質(zhì)量（100±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2012-0002。所有大鼠飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥科學(xué)院清潔級動物實驗中心，實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2016-0005。實驗過程及方法均符合福建省中醫(yī)藥科學(xué)院動物倫理委員會要求（倫理審批號FJATCM-IAEC 2020019）。

1.2 實驗藥物制備 健心顆粒（福建省第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，批號：Z20100010）組方：黃芪10 g，紅參5 g，蒲黃3 g，丹參5 g，豬苓5 g，白術(shù)5 g，桂枝3 g，葶藶子5 g；卡托普利片（國藥集團(tuán)汕頭金石制藥有限公司，25 mg/片，批號：H44024904）。分別將健心顆粒和粉碎后的卡托普利充分溶解于沸水中，蒸發(fā)濃縮成含生藥濃度為1 g/mL 的藥液，放入無菌瓶中密封保存，存于4 ℃冰箱中。

1.3 主要試劑與儀器 ① 主要試劑：鏈脲佐菌素（美國Sigma 公司，批號：S0130）；TUNEL 細(xì)胞焦亡試劑盒（武漢博士德公司，批號：MK1015）；GSDMD抗體（美國Affinity公司，批號：AF4012）；Caspase-1抗體（美國Proteintech 公司，批號：22915-1-ap）；抗-GAPDH（美國Proteintech 公司，批號：60004-1-Ig）；NLRP3 抗體（批號：A00034-2），白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒（批號：MM-0047R1）；白細(xì)胞介素-18（IL-18）ELISA 試劑盒（批號：MM-0194R1）均購自福州諾敦斯生物科技有限公司。② 主要儀器：酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS）；恒溫箱（日本SANYO 公司）；瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；冷凍離心機(jī)（廣州吉迪儀器有限公司）；qPCR 儀（鯤鵬基因科技有限責(zé)任公司）；漩渦混合器（福州康和爾生物科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 動物模型制備與分組 將40 只SD 雄性大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組8 只和造模組32 只?？瞻捉M不予處理，正常飲食；造模組予高糖高脂飼料喂養(yǎng)8 周后，禁食不禁水10 h 后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素35 mg/kg，7 d 后尾靜脈取血測量血糖值，參考TI 等［6］的診斷標(biāo)準(zhǔn)，如測出空腹血糖≥16.7 mmol/L 則表明糖尿病大鼠模型建立成功，繼續(xù)以高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠。參照文獻(xiàn)［7］在鏈脲佐菌素注射后8 周，大鼠心臟體積增大，射血分?jǐn)?shù)降低，心臟出現(xiàn)心肌間質(zhì)纖維化和左心室擴(kuò)大，提示DCM 大鼠造模成功并隨機(jī)分為模型組、西藥組、中藥組及西藥＋中藥組。

2.2 給藥及取材 空白組、模型組均給予生理鹽水5 mL，西藥組給予卡托普利5 mg/kg，中藥組給予健心顆粒3.2 g/kg，西藥＋中藥組給予健心顆粒3.2 g/kg＋卡托普利5 mg/kg，早晚各灌胃1 次，共8 周。8 周后，心臟彩超檢測后處死各組大鼠，并用3%戊巴比妥鈉按35 mg/kg 體質(zhì)量的劑量腹腔注射麻醉，開腹，取腹主動脈血，取血量約1～2 mL，離心取血清，置于-80 ℃冰箱中保存。隨后暴露及剝離大鼠心臟，用生理鹽水沖洗，剪去心臟周圍組織，并用吸水紙吸干后即刻稱重。隨后，予刀片沿著大鼠心臟左心室短軸切取相應(yīng)心肌組織，用PBS 將心肌組織上的血液沖洗干凈，按TUNEL、qPCR、Western blot 檢測要求將其分成多份，每份約100 mg。做好標(biāo)記，分別放入4%多聚甲醛溶液中固定，待行常規(guī)的脫水、浸蠟和包埋。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 心臟彩超檢測5 組大鼠左室腔徑、室壁厚度及心功能 大鼠麻醉后，脫毛，通過PHILIPS EPIQ 7C 超聲成像系統(tǒng)進(jìn)行心臟彩超檢查。測量室間隔厚度（IVST）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左室舒張末經(jīng)（LVEDD）、左室收縮末徑（LVESD）。

2.3.2 TUNEL 法檢測心肌細(xì)胞焦亡情況 心肌組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用蛋白酶K 室溫孵育10 min，TBS 洗滌3 次后加入50 μL 的TUNEL 反應(yīng)混合溶液，置于濕盒中37 ℃孵育2 h，TBS 洗滌3 次；滴加50 μL 轉(zhuǎn)化劑POD，置于濕盒中37℃孵育30 min，TBS 沖洗3 次，之后加入DAB 底物溶液，室溫孵育15 min，再經(jīng)TBS 洗滌3 次；蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，用中性樹脂封片，高倍顯微鏡200 倍下分析。

2.3.3 qPCR 檢測大鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA 表達(dá)水平 提取5 組大鼠心肌組織中總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行cDNA 擴(kuò)增；繼續(xù)將熒光染料、cDNA 以及靶標(biāo)基因上下游引物進(jìn)行混合，完成實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測。運(yùn)用2-ΔΔCt法計算目的基因表達(dá)水平，引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列

2.3.4 Western blot 檢測大鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白表達(dá)量 將心肌組織置于研磨管中，添加RIPA裂解液進(jìn)行研磨，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，收集上清液層檢測蛋白濃度（BCA 法）。樣品經(jīng)過上樣；電泳；轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)20～30 min）；封閉；TBST 洗膜，將膜與稀釋的一抗在4℃下孵育過夜；次日，室溫孵育稀釋的二抗1～2 h。滴加ECL 曝光液于膜上，成像儀內(nèi)曝光成像，Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶灰度值。

2.3.5 ELISA 法檢測大鼠血清IL-1β、IL-18 的含量 腹主動脈取血，離心取血清，根據(jù)試劑盒說明書對各組大鼠血清中IL-1β、IL-18 的含量進(jìn)行檢測。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 27.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料符合正態(tài)分布的以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時兩兩比較采用LSD-t法，方差不齊時兩兩比較采用Games-Howell 分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 5組大鼠IVST、LVEF、LVEDD、LVESD 結(jié)果比較 見表2。

表2 5 組大鼠IVST、LVEF、LVEDD、LVESD 結(jié)果比較（±s）

表2 5 組大鼠IVST、LVEF、LVEDD、LVESD 結(jié)果比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與西藥組比較，3） P＜0.05；與中藥組比較，4） P＜0.05。

LVESD/mm 3.44±0.57 5.66±0.591）4.72±0.632）4.79±0.532）4.16±0.292）3）4）組別空白組模型組西藥組中藥組西藥＋中藥組n8 8 8 8 8 IVST/mm 2.15±0.30 1.27±0.161）1.60±0.322）1.57±0.272）1.88±0.142）3）4）LVEF/%80.00±5.28 44.96±7.311）53.80±5.612）52.00±3.442）59.80±2.472）3）4）LVEDD/mm 5.19±0.38 6.93±0.521）6.20±0.522）6.39±0.512）5.70±0.392）3）4）

3.2 5組大鼠心肌細(xì)胞焦亡情況比較 與空白組比較，模型組心肌焦亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西藥組、中藥組及西藥＋中藥組心肌細(xì)胞焦亡率均顯著降低（P＜0.05）；與西藥組比較，西藥＋中藥組心肌細(xì)胞焦亡率降低更明顯（P＜0.05）。見圖1、表3。

圖1 5 組大鼠心肌細(xì)胞焦亡情況（TUNEL 染色，×200）

表3 5 組大鼠心肌細(xì)胞焦亡情況比較（±s）

表3 5 組大鼠心肌細(xì)胞焦亡情況比較（±s）

焦亡率/%13.36±3.42 84.91±7.401）33.60±6.942）37.28±5.112）24.83±3.902）3）4）組別空白組模型組西藥組中藥組西藥＋中藥組n8 8 8 8 8

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05；與西藥組比較，3）P＜0.05；與中藥組比較，4）P＜0.05。

3.3 5組大鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA 表達(dá)水平比較 見表4。

表4 5 組大鼠心肌NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA 表達(dá)水平比較（±s）

表4 5 組大鼠心肌NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA 表達(dá)水平比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與西藥組比較，3） P＜0.05；與中藥組比較，4） P＜0.05。

組別空白組模型組西藥組中藥組西藥＋中藥組GSDMD 1.01±0.02 3.88±1.761）1.37±0.842）1.48±0.592）1.17±0.502）n8 8 8 8 8 NLRP3 1.04±0.06 10.08±4.181）3.74±2.872）3.94±2.832）2.22±1.302）Caspase-1 1.00±0.04 8.44±1.911）2.26±0.632）2.46±0.942）1.21±0.522）3）4）

3.4 5組大鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)量比較 見表5、圖2。

圖2 5 組大鼠心肌NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白條帶圖

表5 5 組大鼠心肌NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白表達(dá)量比較（±s）

表5 5 組大鼠心肌NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白表達(dá)量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與西藥組比較，3） P＜0.05；與中藥組比較，4） P＜0.05。

GSDMD 0.16±0.07 0.79±0.221）0.44±0.122）0.47±0.132）0.27±0.062）3）4）組別空白組模型組西藥組中藥組西藥＋中藥組n8 8 8 8 8 NLRP3 0.26±0.02 0.94±0.051）0.59±0.072）0.62±0.052）0.43±0.052）3）4）Caspase-1 0.17±0.05 0.96±0.231）0.62±0.142）0.64±0.152）0.34±0.082）3）4）

3.5 5組大鼠血清IL-1β、IL-18含量比較 見表6。

表6 5 組大鼠血清IL-1β、IL-18 含量比較（±s） ng/L

表6 5 組大鼠血清IL-1β、IL-18 含量比較（±s） ng/L

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與西藥組比較，3） P＜0.05；與中藥組比較，4） P＜0.05。

組別空白組模型組西藥組中藥組西藥＋中藥組IL-18 175.59±7.48 219.13±7.971）198.72±7.082）200.09±11.092）187.18±4.122）3）4）n8 8 8 8 8 IL-1β 46.67±1.30 59.15±1.571）53.12±2.122）54.24±1.572）50.51±1.452）3）4）

4 討 論

健心顆粒是我省著名心血管病專家陳美華、林求誠團(tuán)隊結(jié)合近代醫(yī)家及多年臨床經(jīng)驗研制而成，該方配伍精妙，療效確切，為我院常用院內(nèi)制劑。方中黃芪、紅參為君，大補(bǔ)元?dú)?、振奮心陽，以治其本；氣虛不運(yùn)，致血行瘀滯，故臣以蒲黃、丹參活血行瘀，通利血脈；佐以桂枝通陽化氣，豬苓行竅水，白術(shù)燥濕利水，此三者取“五苓散”之意，行溫陽化飲利水之效；肺主通調(diào)三焦水道，水道通則水飲除，故取葶藶子宣肺利水為使，開上源以利下流。全方藥為八味，共奏益氣、活血、溫陽、利水之功。

現(xiàn)代藥理學(xué)分析表明，白術(shù)、紅參、黃芪等均具有較好的降血糖作用，因此，健心顆粒適用于糖尿病引起的心力衰竭。已有前期研究表明，健心顆粒可有效提高心力衰竭大鼠心肌代謝能力，改善心室重構(gòu)［8］。

DCM 患者心肌細(xì)胞的最終結(jié)局是細(xì)胞死亡，因此能夠干預(yù)細(xì)胞死亡相關(guān)信號通路的措施顯然是治療DCM 的關(guān)鍵，可有效改善心肌損傷，并延緩DCM 向晚期心力衰竭發(fā)展。細(xì)胞焦亡是一種新發(fā)現(xiàn)的程序性細(xì)胞死亡過程。焦亡細(xì)胞的胞膜失去完整性，產(chǎn)生1～2 nm 的孔隙，導(dǎo)致細(xì)胞器和細(xì)胞漿腫脹、破裂，細(xì)胞成分及促炎性介質(zhì)通過膜孔釋放，引起炎癥反應(yīng)。細(xì)胞焦亡的經(jīng)典型途徑依賴Caspase-1 介導(dǎo)，而非經(jīng)典型途徑依賴Caspase-4/5/11 介導(dǎo)，通過調(diào)控有關(guān)基因的表達(dá)可有效減輕高糖所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的焦亡［9］。在對DCM 的分子研究中發(fā)現(xiàn)，依賴NLRP3/Caspase-1 的細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑在糖尿病心肌病的病變進(jìn)展中發(fā)揮了重要的作用［10］。當(dāng)機(jī)體處于高糖狀態(tài)，NLRP3 炎性小體表達(dá)會上調(diào)，促進(jìn)前體Caspase-1 裂解，裂解后的Caspase-1 不僅切割炎性因子前體pro-IL-1β、pro-IL-18 使之活化為成熟的IL-1β、IL-18，同時還切割GSDMD，從而在細(xì)胞膜上形成微孔，胞內(nèi)離子外流，膜外水分內(nèi)流，使細(xì)胞腫脹、裂解，進(jìn)一步導(dǎo)致眾多炎癥因子如IL-1β、IL-18 等釋放，最終誘發(fā)細(xì)胞焦亡［11-13］。

本研究中，與空白組比較，模型組大鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA 表達(dá)水平和蛋白表達(dá)量升高，表明DCM 可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞焦亡相關(guān)基因的表達(dá)異常。經(jīng)卡托普利、健心顆粒干預(yù)治療后，大鼠心室重構(gòu)明顯改善，心肌細(xì)胞焦亡率顯著減輕，心肌組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)量降低，血清炎性因子IL-1β、IL-18 水平亦下降，其中中藥組作用效果與西藥組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而西藥＋中藥組作用效果最優(yōu)，提示健心顆?？赡苁峭ㄟ^下調(diào)DCM 大鼠心肌細(xì)胞焦亡相關(guān)基因NLRP3、Caspase-1、GSDMD 表達(dá)，抑制炎癥因子釋放，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)心肌組織的作用。

綜上，本研究從細(xì)胞焦亡的角度進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞焦亡在DCM 的發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用。健心顆?？赡芡ㄟ^調(diào)控NLRP3/Caspase-1/GSDMD 信號通路改善DCM 大鼠心肌細(xì)胞焦亡，抑制炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到治療DCM 的目的。本研究為健心顆粒的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)，未來可進(jìn)一步添加信號通路抑制劑進(jìn)行通路驗證，深入探索健心顆粒治療DCM 的具體作用機(jī)制。