大柴胡湯加減方對濕熱證膽囊膽固醇結石小鼠膽固醇代謝基因SRBI、ABCG5/G8表達的影響

王素英，章小燕，閔 莉*

（1.福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，福建 福州 350122；2.福建省中醫(yī)健康管理2011 協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350122；3.中醫(yī)健康狀態(tài)辨識研究室，福建 福州 350122）

我國膽結石發(fā)病率逐年增多，其中膽囊膽固醇結石（cholesterol gallstones，CS）是臨床最常見的膽囊結石類型，故進一步研究CS 的發(fā)病機制對指導其臨床防治意義重大［1-2］。膽結石形成機制復雜且不完善，膽固醇代謝異常致使膽汁內(nèi)膽固醇過飽和是CS 發(fā)生的重要機制之一［3-5］。肝臟主司膽汁分泌，是膽固醇合成、吸收、外排的重要場所。研究發(fā)現(xiàn)，血清中高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）可能是致石性膽汁內(nèi)膽固醇的主要來源；B 類清道夫受體Ⅰ（scavenger receptor class-B typeⅠ，SRBI）是HDL-C 的重要受體，可將其逆轉(zhuǎn)運至肝臟，促使肝臟分泌的膽汁內(nèi)膽固醇增多，進而導致CS 的發(fā)生［6-8］。三磷酸腺苷結合盒轉(zhuǎn)運體G5/G8（ATP binding cassette transporter G5/G8，ABCG5/G8）促進肝臟內(nèi)膽固醇外排入膽囊，是誘發(fā)CS 的重要基因［9］。

中醫(yī)認為膽石癥常伴濕熱［10］。大柴胡湯源自《傷寒論》，具有清熱祛濕、利膽消石之效，是治療CS 濕熱證的常用藥與代表方［11-12］；現(xiàn)代研究證實大柴胡湯具有保肝、利膽、降脂等作用［13］。大柴胡湯加減方（modified dachaihu decoction，MDD）為2020年膽石癥濕熱證的中醫(yī)診療指南中推薦用藥［12］，可調(diào)節(jié)FXR/FGF15/FGFR4 通路，對CS 濕熱證小鼠起到良好的治療效果［14］。據(jù)此，本次實驗擬通過構建CS 濕熱證小鼠模型，從肝臟膽固醇代謝相關基因SRBI、ABCG5/8 的表達差異，進一步探究MMD 治療濕熱型CS 的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 C57BL/6J 雄性小鼠24 只，體質(zhì)量（18±2）g，購自杭州子源實驗動物科技有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0004，在福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF 級動物實驗室適應性喂養(yǎng)1周，實驗動物使用許可證號：SYXK（閩）2020-0002。本實驗方案通過福建中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查批準（審批號：FJTCM IACUC 2020071）。

1.2 實驗藥物及飼料 大柴胡湯加減方由柴胡15 g，黃芩10 g，茵陳15 g，郁金15 g，金錢草15 g，茯苓15 g，厚樸10 g，枳實10 g，生大黃6 g 和炙甘草6 g 組成，購自福建中醫(yī)藥大學附屬第三人民醫(yī)院中藥房。以上中藥水煎煮2 次、濃縮為含生藥1.17 g/mL 的大柴胡湯加減方藥液。熊去氧膽酸膠囊（Losan Pharma GmbH 公司，批號：L20182A）購自福建中醫(yī)藥大學附屬第三人民醫(yī)院西藥房，將膠囊打開用超純水溶解，配制成濃度為2.5 mg/mL 的熊去氧膽酸溶液。常規(guī)飼料由福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。2%高膽固醇致石飼料（成分：全價飼料粉料82.5%、牛油15%、膽固醇2%、膽酸0.5%，批號：20210107）購自無錫帆泊生物技術有限公司。

1.3 實驗試劑 小鼠總膽固醇（TC）、總膽汁酸（TBA）、磷脂（PL）、HDL 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號：M202101-18、M202101-45、M202101-32、M202110-26）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，批號：J05N11Y130004）；GAPDH 一抗（批號：10015666）、SRBI 一抗（批號：00091630）、鼠二抗（批號：20000261）、兔二抗（批號：20000250）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；ABCG5/G8 一抗（美國Affinity Biosciences 公司，批號：88X7997、41W9164）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR 試劑盒均購自日本TAKARA公司，批號：AK71623A、AK41790A。

1.4 實驗儀器 人工氣候箱（韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司）；體視顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限責任公司）；生物組織包埋機、石蠟切片機（德國Leica 公司）；多功能酶標儀（瑞士Tecan 公司）；基因擴增儀、ABI 熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司）；超微量紫外分光光度計（美國Thermo Scientific 公司）；化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

2 方 法

2.1 動物分組及造模 按照體質(zhì)量分層隨機分組法將適應性喂養(yǎng)1 周后的雄性小鼠24 只分為空白組、模型組、中藥組和西藥組，每組各6 只?？瞻捉M常規(guī)飼養(yǎng)；其余3 組小鼠采用“2%高膽固醇致石飼料＋內(nèi)濕＋外濕”的方法造模13 周，建立CS 濕熱證模型，即造模全周期始終予以2%高膽固醇致石飼料喂養(yǎng)，第10～13 周每天增加10 h 的外部濕熱環(huán)境（人工氣候箱設置的溫度31～33 ℃、濕度95%的環(huán)境）影響，在處于濕熱環(huán)境的同時給予20%蔗糖水。若小鼠出現(xiàn)嗜臥懶動、精神不振、體質(zhì)量增長減緩、飲食減少、大便質(zhì)軟、小便短、皮毛油膩稀疏等表現(xiàn)，經(jīng)解剖后觀察到膽囊結石即可判定為CS 濕熱證造模成功［14］。

2.2 藥物干預 造模成功后，所有小鼠按照體質(zhì)量0.02 mL/（g·d）計算灌胃量，根據(jù)課題組前期研究基礎及體質(zhì)量等效劑量換算公式［14-16］，中藥組和西藥組小鼠分別給予1.17 g/mL 大柴胡湯加減方藥液和2.5 mg/mL 熊去氧膽酸溶液灌胃，空白組和模型組則予以生理鹽水灌胃，共干預4 周。

2.3 取材 末次干預結束后禁食不禁水12 h，采用摘眼球取血法，收集小鼠血液樣本，離心后取其血清至新的EP 管內(nèi)并做好標記。隨后將小鼠頸椎脫臼處死、解剖，摘取完整膽囊，并用生理鹽水洗凈后，置于體視顯微鏡下觀察、拍照記錄，隨后保存膽汁。最后摘取小鼠肝左葉，將其切成3 個方塊，1 塊置于4%多聚甲醛固定液中用于后續(xù)HE 染色觀察，另外2 塊置于EP 管內(nèi)凍存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)mRNA 和蛋白表達量的檢測。

2.4 觀察指標

2.4.1 小鼠一般情況及膽囊結石觀察 參考課題組前期及他人研究［14，17］，自造模起每周觀察記錄小鼠的精神狀態(tài)、活動度、體質(zhì)量、飲食［18-19］、皮毛、二便等變化情況，造模前后及干預后進行曠場實驗［20-21］，即準備2 個同等規(guī)格的白色敞箱（50 cm×50 cm×50 cm，底面被劃分成大小均勻的25 個方格），夜間在黑暗的房間內(nèi)同時開始2 組小鼠實驗（每組4 名操作者），1 名操作者將小鼠放于敞箱中央，其余3 名操作者不被告知小鼠組別，并分別觀察記錄5 min 內(nèi)小鼠水平穿越格子數(shù)、直立次數(shù)和靜止時間，以輔助判斷4 組小鼠濕熱證候。解剖小鼠摘取其完整膽囊，觀察、記錄4 組小鼠膽囊結石情況。

2.4.2 膽汁成分與血清血脂含量測定 參考ELISA試劑盒說明書，設置標準孔、樣品孔與空白孔，依次加入不同濃度的標準品、樣本（膽汁/血清）、蒸餾水各50 μL，除空白孔外，各孔加入HRP 標記的檢測抗體100 μL，37 ℃溫育后重復洗滌5 次，再往所有孔加入底物A、B 各50 μL，37 ℃避光孵育后，加入終止液50 μL，在450 nm 波長處測定各孔的吸光值（OD 值），計算膽汁中TC、TBA、PL 和血清中TC、HDL 含量。

2.4.3 肝組織病理形態(tài)學 將肝組織石蠟標本切片（厚度約4 μm）、采用HE 染色，中性樹脂封片，光鏡下觀察肝組織病理形態(tài)學改變。

2.4.4 qPCR 檢測肝組織中SRBI、ABCG5/G8 mRNA相對表達水平 將肝組織研磨成漿，提取組織內(nèi)RNA 并測定其純度和濃度。在逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的指導下操作，去除基因組cDNA 并將提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)SYBR 試劑盒的說明，配置反應液與cDNA、所測目的基因引物（PCR 引物及內(nèi)參由福州瑞真生物技術有限公司設計合成，見表1）混合加樣，依次進行預變性（95 ℃/30 s）、變性（95 ℃/5 s）、退火（60 ℃/30 s），共40 個循環(huán)，完成PCR 擴增。以GAPDH 為內(nèi)參對照，根據(jù)各樣本的Ct 值，計算2-ΔΔCt代表SRBI、ABCG5/G8 的mRNA 相對表達量進行后續(xù)統(tǒng)計分析。

表1 引物序列

2.4.5 Western blot 檢測肝組織SRBI、ABCG5/G8 蛋白表達量 提取小鼠肝臟組織總蛋白并用BCA 法檢測濃度，配置10%PAGE 凝膠，往泳道內(nèi)依次加入Marker 和4 組蛋白樣品、電泳（濃縮膠30 V/30 min，分離膠90 V/90 min）后將蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF 膜上（250 mA/60 min），再分別經(jīng)GAPDH、SRBI、ABCG5、ABCG8 一抗（1∶10 000、1∶800、1∶3 000、1∶3 000）4 ℃孵育過夜，洗滌后鼠、兔二抗（1∶5 000）孵育2 h，清洗干凈在ECL 避光條件下顯影、成像，以條帶上SRBI、ABCG5/G8 蛋白的灰度值/GAPDH 蛋白的灰度值，代表相應4 組SRBI、ABCG5/G8 蛋白相對表達量進行后續(xù)統(tǒng)計分析。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.00 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，GraphPad Prism 8 軟件進行數(shù)據(jù)圖片繪制。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，2 組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 4組小鼠一般情況比較 空白組在整個造模與干預期間，精神狀態(tài)良好，好攀爬、較為活躍，平均飲食攝入量穩(wěn)定，體質(zhì)量逐步增長，二便正常，皮毛柔順無缺損。造模的3 組在造模1～9 周時，精神狀態(tài)尚好，少在籠內(nèi)走動、好聚堆，飲食量和體質(zhì)量增長均明顯高于空白組小鼠，皮毛油膩成綹，大便質(zhì)軟；在造模10～13 周時，3 組陸續(xù)出現(xiàn)精神萎靡、嗜臥懶動，常聚堆于角落或藏匿于墊料下方，飲食量明顯減少，體質(zhì)量下降，眵多，皮毛油膩稀疏且常因啃咬而出現(xiàn)皮毛塊狀缺損，小便色深黃味重，大便稀軟常不成形，表現(xiàn)出明顯的濕熱證候。干預后，中藥組精神狀態(tài)有所改善，常在籠內(nèi)走動、活動度增高，飲食量和體質(zhì)量增長有所恢復，小便淡黃，大便成形，皮毛柔順完整、眵少，濕熱證候明顯改善；模型組與西藥組無明顯變化。見圖1。

圖1 4 組小鼠一般情況比較

3.2 4 組小鼠膽囊結石情況比較 空白組膽囊體積適中，膽汁淡黃清澈、透光度高、無雜質(zhì)。與空白組相比，模型組膽囊內(nèi)肉眼可見沙粒樣結石沉淀，膽汁顏色變深呈棕褐色，膽囊體積增大。中藥組和西藥組膽囊體積較空白組均增大，膽汁顏色較深；與模型組比較，中藥組和西藥組膽囊內(nèi)結石消失，膽汁渾濁程度降低，以中藥組小鼠膽汁透明度更高。見圖2。

圖2 4 組小鼠膽囊結石情況

3.3 4組小鼠膽汁TC、TBA、PL含量比較 見表2。

表2 4 組小鼠膽汁TC、TBA、PL 含量比較（±s）

表2 4 組小鼠膽汁TC、TBA、PL 含量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與西藥組比較，3） P＜0.05。

組別空白組模型組中藥組西藥組n 6 6 6 6 TC/（mmol/L）4.81±0.39 9.41±0.371）6.67±0.362）7.57±0.832）TBA/（μmol/L）19.62±0.45 12.86±1.251）16.72±0.722）15.86±0.982）PL/（ng/mL）194.56±8.31 104.68±13.921）164.39±13.492）3）144.19±14.722）

3.4 4組小鼠血清HDL-C、TC 含量比較 見表3。

表3 4 組小鼠血清中HDL-C、TC 含量比較（±s）

表3 4 組小鼠血清中HDL-C、TC 含量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

TC/（mmol/L）2.00±0.32 7.23±0.201）5.22±0.472）6.19±1.122）組別空白組模型組中藥組西藥組n6 6 6 6 HDL-C/（μmol/L）169.80±2.43 122.16±6.181）146.45±2.612）141.83±7.712）

3.5 4組小鼠肝組織病理學形態(tài) 空白組肝細胞形態(tài)結構正常，細胞核大而居中，細胞間排列緊密、有序；模型組肝細胞腫脹變形，胞質(zhì)內(nèi)充斥大量的脂滴空泡，細胞核多被擠至細胞邊緣，細胞間排列松散、混亂；中藥組、西藥組肝細胞內(nèi)脂滴空泡明顯減少、變小，肝組織脂肪樣變性明顯減輕，細胞間排列相對清楚，其中中藥組肝臟組織形態(tài)更趨近于正常組。見圖3。

圖3 4 組小鼠肝臟組織形態(tài)（HE 染色，×200）

3.6 4組小鼠肝組織SRBI、ABCG5/G8 mRNA 表達水平比較 見表4。

表4 4 組小鼠肝組織SRBI、ABCG5/G8 mRNA相對表達水平比較（±s）

表4 4 組小鼠肝組織SRBI、ABCG5/G8 mRNA相對表達水平比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

ABCG8 1.01±0.02 2.18±0.101）1.50±0.442）1.93±0.38組別空白組模型組中藥組西藥組n6 6 6 6 SRBI 1.03±0.04 2.25±0.401）1.37±0.162）1.47±0.202）ABCG5 1.05±0.04 2.19±0.041）1.53±0.46 1.95±0.13

3.7 4組小鼠肝組織SRBI、ABCG5/G8 蛋白表達量比較 見圖4、表5。

圖4 4 組小鼠肝臟SRBI、ABCG5/G8 蛋白條帶圖

表5 4 組小鼠肝臟SRBI、ABCG5/G8蛋白表達量比較（±s）

表5 4 組小鼠肝臟SRBI、ABCG5/G8蛋白表達量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

ABCG8 0.18±0.05 0.41±0.022）0.30±0.032）0.24±0.022）組別空白組模型組中藥組西藥組n6 6 6 6 SRBI 0.29±0.02 0.52±0.191）0.40±0.07 0.49±0.08 ABCG5 0.10±0.04 0.24±0.12 0.21±0.13 0.23±0.10

4 討 論

CS 屬中醫(yī)學“膽脹”“脅痛”“黃疸”等范疇，因濕熱、痰瘀、氣郁、蟲毒、陰虛等多種病理因素相互作用、影響，膽汁排泌不暢，而日久淤滯成石。研究發(fā)現(xiàn)，濕熱壅滯乃膽石癥關鍵病機及臨床常見證型［22-23］；故采用清熱祛濕、利膽消石之法為主對CS進行治療，臨床亦常用大柴胡湯為基礎方隨癥加減治療CS 濕熱證且療效頗佳［24-26］。本次研究選用的大柴胡湯加減方源自膽石癥濕熱證中醫(yī)診療指南推薦用藥［12］，在原方的基礎上，去半夏、白芍與姜棗，加郁金與柴胡共解肝膽之郁，配以茵陳、黃芩清利少陽、陽明之濕熱；厚樸與枳實相配，可強化燥濕行氣之效；輕用生大黃泄陽明壅滯之濕熱，重用金錢草加強清熱祛濕、利膽消石之效；茯苓利水濕、健脾胃，與炙甘草共為佐藥，可調(diào)和諸藥。全方以攻為主，滌壅滯之濕熱，疏肝膽之淤，又注意顧護脾胃，是清熱祛濕、利膽消石之佳劑。

現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，膽汁中膽固醇過飽和是CS 發(fā)生的關鍵機制，也是其突出的病理表現(xiàn)［3-5］。膽汁中的成分主要有TC、TBA、PL，若膽汁成分比例異常，即TC 增多或TBA、PL 比例降低均會導致膽汁中膽固醇過飽和析出形成CS［5，27-28］。經(jīng)臨床及動物實驗發(fā)現(xiàn)，CS 患者/小鼠血脂成分異常，血清中TC 含量異常升高而HDL-C 含量則明顯降低［29-30］。TC 的血清濃度可反映機體脂代謝情況，與飲食關系密切；HDL-C 與SRBI 特異性結合逆轉(zhuǎn)運膽固醇至肝臟被認為是CS 患者膽汁中膽固醇的主要來源［6-7，31］。ABCG5/G8 參與轉(zhuǎn)運肝臟內(nèi)膽固醇至膽囊，與CS 的發(fā)生、發(fā)展密切相關［9］。肝臟是膽固醇代謝的重要器官，若脂質(zhì)代謝異常，肝臟組織形態(tài)則可能發(fā)生異常。本次實驗中，模型組小鼠肝臟脂肪變性明顯，膽汁中TC 含量顯著增多、TBA和PL 含量顯著下降，血清TC 含量升高、HDL-C 則顯著降低，且肝臟中SRBI、ABCG5、ABCG8 mRNA與蛋白表達均有上調(diào)趨勢，與上述研究報道一致。

薛生白曰：“內(nèi)外相引，故病濕熱”，故本次實驗在濕熱模型制備時，兼顧了內(nèi)外濕熱因素的影響。造模的小鼠長期食用2%高膽固醇致石飼料，屬膏粱厚味，滋膩滯礙脾胃，使其運化無權，而生濕熱；同時，高膽固醇高脂飲食是誘發(fā)CS 的重要危險因素［32］，通過長期飲食因素的干擾，既保證了CS 模型的建立又促使?jié)駸醿?nèi)生?？禎嵑透弑陶洌?3］認為塑造病證結合動物模型，應該先確保“病”已形成后，再建立“證”模型，如此病癥模型才會穩(wěn)固。根據(jù)課題組前期研究結果，高膽固醇致石飼料喂養(yǎng)小鼠9周便可形成CS［15，34］。故本次實驗在造模10～13周增加外部濕熱環(huán)境因素的干擾，同時給予小鼠20%糖水進一步增加內(nèi)濕因素的影響。結果顯示，模型組小鼠膽囊內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的沙粒樣結石沉淀，膽汁顏色變深、膽囊體積增大，即CS 模型建立成功?，F(xiàn)階段關于動物濕熱證模型的評價尚無統(tǒng)一的規(guī)范化標準，所以本次研究中，以中醫(yī)學在臨床中人的濕熱證候表現(xiàn)為參照，來評判動物濕熱證模型建立是否成功。在造模10～13 周，造模的3 組小鼠均表現(xiàn)出精神萎靡，嗜臥懶動，飲食減少，體質(zhì)量增長遲緩，小便黃赤，大便稀軟，面垢眵多，皮毛油膩稀疏等表現(xiàn)，與《脾胃論》中記載的濕熱證候表現(xiàn)“人感之多四肢困倦，精神短少，懶于動作，胸滿氣促，肢節(jié)沉疼……小便黃而數(shù)，大便溏而頻……不思飲食”高度契合，表明造模的3 組小鼠表現(xiàn)出明顯的濕熱證候。經(jīng)大柴胡湯加減復方干預后，小鼠的濕熱證候較模型組與西藥組明顯改善。

熊去氧膽酸是臨床治療膽結石的常用藥，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、利膽、消石之效［19，24］。因大柴胡湯加減方亦有上述功效［12-13］，且更添清熱祛濕之用，故通過將中藥組與西藥組治療效果進行比較，可以較為直觀地闡釋大柴胡湯加減方治療CS 的作用機制，并從方證對應的角度進一步驗證CS 模型小鼠的濕熱病理。故實驗結果顯示中藥組小鼠膽汁結石狀況、濕熱證候、肝臟脂肪病變程度、血脂含量、膽汁成分及SRBI、ABCG4/G8的mRNA與蛋白表達情況的改善程度整體上均優(yōu)于西藥組，且更趨近于空白組。以上差異無統(tǒng)計學意義，可能是由于樣本量較少的緣故。

綜上表明，SRBI、ABCG5/G8 表達異常升高可能是CS 濕熱證的分子生物學機制之一。大柴胡湯加減方能通過抑制SRBI、ABCG5/G8 的表達，調(diào)節(jié)膽固醇代謝，減少膽固醇過飽和膽汁的分泌，改善肝臟脂肪變性，發(fā)揮清熱祛濕、利膽消石的作用，從而達到治療濕熱型膽石癥的效果。