腦心肌炎病毒（EMCV）感染昆明小鼠模型的建立①

鄭劍綱 郝至立 曹志剛 孫盼盼④ 孫 娜 李宏全

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，太谷 030801）

腦 心 肌 炎 病 毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）屬于小核糖核酸病毒科，心病毒屬，病毒粒子外表呈光滑球形，無囊膜，為單股正鏈RNA 病毒［1-3］。EMCV 于1945 年在佛羅里達(dá)州邁阿密由HELWIG 和SCHMIDT 首次從一只突然死于肺水腫和心肌炎的雄性長臂猿中分離得到，將浮腫液注射小鼠體內(nèi)后，出現(xiàn)后肢麻痹和心肌炎等癥狀，隨后這種病原體被命名為EMCV［4］。1949 年后，EMCV感染發(fā)生于獼猴、狒狒、狗、老虎、獼猴、蝙蝠、豬和人等不同物種，且分布于世界各地［5-11］。EMCV 感染大多數(shù)物種后癥狀輕微，但可引起母豬繁殖障礙、仔豬急性心肌炎，誘發(fā)仔豬猝死等［12-16］。目前針對(duì)EMCV感染還沒有特效藥和商品化疫苗。

小鼠模型具有成本低、繁殖飼養(yǎng)快速方便、遺傳背景明確等有利因素，使其成為藥物臨床前評(píng)價(jià)研究等最為重要的模式動(dòng)物。EMCV 小鼠模型的建立既往研究鮮見報(bào)道，主要集中于EMCV 感染小鼠后臨床癥狀和組織病理損傷的觀察［17-21］。本研究擬建立EMCV 感染昆明小鼠模型，為后續(xù)EMCV 致病機(jī)制和藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和病毒 6～8 周齡SPF 級(jí)昆明小鼠192 只雌雄各半（質(zhì)量合格證號(hào)：110011210115 155452），購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司［SCXK（京）2021-0006］。自由采食和飲水，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物委員會(huì)倫理要求（倫理審查號(hào)：SXAU-EAW-2021M01027）。EMCV NJ08 株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)姜平教授惠贈(zèng)，本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了擴(kuò)增和保存。根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算其毒力為108.5TCID50/ml［22］。

1.1.2 主要試劑 TRIzol（invitrogen，美國）；2×SYBR Green qPCR Master Mix（Low ROX，Biotool，美國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，中國）；蘇木素染色液、伊紅染色液和中性樹膠（Solarbio，中國）。

1.1.3 主要儀器 烘片機(jī)、全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、熒光正置顯微鏡（型號(hào)：HI1220、型號(hào)：RM2255、型號(hào)：DM3000，德國Leica）；生物組織包埋機(jī)（型號(hào)：KDBM，中國科迪）；高速冷凍離心機(jī)、核酸蛋白濃度測定儀（型號(hào)：5418、型號(hào)：D30，德國Eppendorf）；PCR儀（型號(hào)：TC-96，美國Bio-Rad）；渦旋振蕩儀（型號(hào)：GENIUS3，德國IKA）；熒光定量PCR 儀（型號(hào)：7500，美國Applied Biosystems）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，分為正常組和EMCV 高、中、低劑量感染組。EMCV高 劑 量 組 小 鼠 腹 腔 注 射0.2 ml 100 TCID50/20 g EMCV，中劑量組小鼠腹腔注射0.2 ml 10 TCID50/20 g EMCV，低劑量組小鼠腹腔注射0.2 ml 1 TCID50/20 g EMCV，空白組腹腔注射等體積的生理鹽水。每天觀察小鼠臨床癥狀。于EMCV 感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d，每組隨機(jī)選取8只，經(jīng)摘取眼球采血，脫頸處死小鼠，收集不同臟器進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2.2 檢測各組小鼠心臟、腦、脾臟和肝臟指數(shù)摘取心臟、腦、脾臟和肝臟后，用濾紙吸干殘留血后，并依據(jù)下列公式計(jì)算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/小鼠質(zhì)量(g)×10。

1.2.3 qRT-PCR 檢測病毒載量和炎癥因子 用TRIzol 法提取小鼠血液、心臟、腦、脾臟和肝的總RNA，用核酸蛋白濃度測定儀檢測RNA 的濃度和純度，按照TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR 檢測不同劑量EMCV 感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d 時(shí)血液、心臟、腦、脾臟和肝的病毒載量。使用本實(shí)驗(yàn)室保存的1.59×108Copies/μl EMCV 3D 重組質(zhì)粒為模板，10 倍比稀釋，加入3D基因正反向引物進(jìn)行擴(kuò)增。標(biāo)準(zhǔn)曲線由各稀釋度模板的起始拷貝數(shù)及其對(duì)應(yīng)的Ct值構(gòu)成。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測每ml 樣品中EMCV 3D 拷貝數(shù)。EMCV 3D基因引物序列為F：5'-TTAGGGCGGGTTTGTAT-3'，R：5'-TTTGTTAGCGGGAGTTA-3'。相 對(duì)qRT-PCR 檢測9 d 時(shí)心和腦IL-1β、IL-6 和TNF-α 的相對(duì)表達(dá)量。IL-1β F：5'-GCCACCTTTTGACAGTGATGAGA-3'，R：5'-GACAGCCCAGGTCAAAGGTT-3'；IL-6 F：5'-GTCCTTCCTACCCCAATTTCCA-3'，R：5'-TAACGCACTAGGTTTGCCGA-3'；TNF-α F：5'-GATCGGTCCCCTTTGGGATG-3'，R：5'-GGTTTGCTACGCAGTGGGC-3'；β-Actin F：5'-CTGAGCTGCGTTTTACACCC-3'，R：5'-CGCCTTCACCGTTCCAGTTT-3'。

1.2.4 組織病理切片 取小鼠心尖和左腦，于10%甲醛溶液中固定24 h。經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片、烘片、脫蠟、蘇木素-伊紅染色和中性樹膠封片后，鏡檢觀察心臟和腦組織病理變化。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀觀察 與空白組相比，昆明小鼠經(jīng)腹腔接種0.2 ml 100 TCID50/20 g EMCV 后第3 d 開始出現(xiàn)精神沉郁、被毛粗亂等癥狀；感染5～11 d 不斷有小鼠出現(xiàn)震顫、弓背及后肢癱瘓等癥狀，后肢癱瘓癥狀出現(xiàn)24～48 h 后小鼠出現(xiàn)死亡，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，高劑量組共出現(xiàn)死亡小鼠7 只。其他未出現(xiàn)癥狀的小鼠感染15 d 與空白組相比均未出現(xiàn)異常，但在組織中能檢測到EMCV病毒的復(fù)制。中劑量和低劑量組小鼠直到第15天未出現(xiàn)異常癥狀。

2.2 不同劑量EMCV 在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響 由圖1 可知，與空白組相比，高劑量EMCV 感染小鼠5 d 時(shí)，能顯著提高心臟指數(shù)（P＜0.05），極顯著提高脾臟指數(shù)（P＜0.01），對(duì)于腦和肝臟指數(shù)并無顯著影響。在7 d、9 d、11 d、13 d 和15 d時(shí)，不同劑量的EMCV 感染對(duì)于小鼠的臟器指數(shù)無顯著影響（P＞0.05），表明在EMCV 感染小鼠前期造成心臟和脾臟腫大。

2.3 不同劑量EMCV 感染小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的病毒載量 利用qRT-PCR 檢測不同劑量EMCV 感染的昆明小鼠5 d、7 d、9 d、11 d、13 d 和15 d 時(shí)，心臟、腦、肝臟、脾臟和外周血中EMCV 載量，結(jié)果見圖2。高劑量EMCV 感染昆明小鼠，隨著時(shí)間增加，在心臟、腦、肝臟、脾臟和外周血中EMCV載量逐漸增加，在9 d 時(shí)達(dá)到頂峰，然后隨著時(shí)間增加病毒載量逐漸下降，其中腦組織的病毒載量最高。與高劑量組相比，中劑量和低劑量EMCV 感染小鼠不同時(shí)間點(diǎn)后，心臟、腦、肝臟、脾臟和外周血中EMCV 載量很低，且部分低劑量EMCV感染小鼠未能檢測到EMCV的復(fù)制情況。

圖2 qRT-PCR 檢測不同劑量EMCV 感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d 和15 d 時(shí)心臟、腦、肝臟、脾臟和外周血中EMCV載量Fig.2 qRT-PCR was used to detect EMCV loads in different organs and peripheral blood infected with different doses of EMCV on 5 d， 7 d， 9 d， 11 d， 13 d and 15 d

2.4 不同劑量EMCV 感染小鼠9 d 時(shí)炎癥因子mRNA表達(dá) 利用qRT-PCR檢測不同劑量EMCV感染昆明小鼠9 d 時(shí)，心臟和腦中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA 表達(dá)情況，結(jié)果見圖3。與空白組相比，高劑量EMCV 感染9 d 時(shí)，能極顯著提高心臟中IL-1β（P＜0.01）、IL-6（P＜0.001）和TNF-α（P＜0.01） mRNA 表達(dá)，中劑量EMCV 感染9 d 時(shí)則顯著提升心臟中IL-1β mRNA 表達(dá)（P＜0.05）。與空白對(duì)照組相比，高劑量EMCV感染9 d時(shí)能極顯著提高腦組織中IL-1β 和TNF-α mRNA 表達(dá)（P＜0.001），顯著增加IL-6 mRNA 表達(dá)（P＜0.05）。中劑量EMCV 感染9 d 時(shí)能極顯著提高腦組織中TNF-α mRNA 的表達(dá) （P＜0.01）。與空白組相比，低劑量EMCV 感染對(duì)心臟和腦組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達(dá)無顯著影響（P＞0.05）。

圖3 qRT-PCR 檢測不同劑量EMCV 感染9 d 時(shí)心臟和腦IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 qRT-PCR detected relative expressions of IL-1β，IL-6 and TNF-α mRNA in heart and brain infected with different doses of EMCV for 9 d

2.5 小鼠心臟組織病理損傷情況 不同劑量EMCV 感染昆明小鼠5 d、7 d、9 d、11 d、13 d 和15 d時(shí)，對(duì)心臟組織進(jìn)行HE 染色。由圖4 可知，空白組心肌細(xì)胞纖維清晰可見，心肌纖維平行排列，且整齊均勻。胞漿染色均勻，細(xì)胞核呈橢圓形，位于細(xì)胞中部。與空白組相比，高劑量EMCV感染5 d時(shí)心臟組織炎癥細(xì)胞增多；7 d時(shí)心臟組織有大面積炎癥細(xì)胞浸潤；9 d 時(shí)心肌細(xì)胞出現(xiàn)空泡狀病變；11 d 時(shí)炎癥細(xì)胞浸潤減少，空泡狀病變消失，心肌間隙增寬，后期回歸正常。中劑量EMCV 僅在感染前期導(dǎo)致少量炎癥細(xì)胞浸潤和心肌間隙增寬。低劑量EMCV感染與空白組形態(tài)基本一致。

圖4 不同劑量EMCV感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d和15 d時(shí)心臟組織病理學(xué)切片（HE染色，×200）Fig.4 Histopathological sections of heart tissue infected with different doses of EMCV on 5 d，7 d，9 d，11 d，13 d and 15 d （HE staining， ×200）

2.6 小鼠腦組織病理損傷情況 空白組大腦腦膜正常，皮質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，白質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤。與空白組相比，高劑量EMCV 感染5 d 時(shí)，腦膜下血管擴(kuò)張，7 d 和9 d 時(shí)腦膜增厚，膜下出血，后期腦膜恢復(fù)正常，膜下出血逐漸吸收；中劑量EMCV感染7 d時(shí)，腦膜增厚和腦水腫，9 d 時(shí)白質(zhì)有出血點(diǎn)，中劑量感染其他時(shí)間點(diǎn)和低劑量感染與空白組形態(tài)基本一致（圖5）。與空白組相比，高劑量EMCV 感染5 d時(shí)，腦白質(zhì)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，7 d 和9 d 時(shí)，白質(zhì)內(nèi)血管高度擴(kuò)張，炎癥細(xì)胞浸潤，形成血管套，后期逐漸恢復(fù)正常；中劑量EMCV感染前期，出現(xiàn)輕微的炎癥細(xì)胞浸潤和血管擴(kuò)張，后期逐漸恢復(fù)正常。低劑量感染與空白組形態(tài)基本一致（圖6）。

圖5 不同劑量EMCV感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d和15 d時(shí)腦皮質(zhì)和腦膜組織病理學(xué)切片（HE染色，×200）Fig.5 Histopathological sections of cerebral cortex and meninges infected with different doses of EMCV on 5 d， 7 d， 9 d， 11 d， 13 d and 15 d （HE staining， ×200）

圖6 不同劑量EMCV感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d和15 d時(shí)腦白質(zhì)組織病理學(xué)切片（HE染色，×200）Fig.6 Histopathological sections of cerebral white matter infected with different doses of EMCV on 5 d， 7 d，9 d， 11 d， 13 d and 15 d （HE staining， ×200）

3 討論

目前，大量研究集中于EMCV 感染小鼠臨床癥狀的觀察，而系統(tǒng)建立EMCV 感染昆明小鼠模型鮮見報(bào)道，這在一定程度上限制了抗EMCV 臨床藥物的開發(fā)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)莪術(shù)醇體外能夠顯著抑制EMCV 的復(fù)制，為了驗(yàn)證其體內(nèi)抗病毒活性，首先需建立EMCV感染昆明小鼠模型［23］。EMCV感染昆明小鼠模型的建立為抗EMCV藥物的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

首先采用100 TCID50/20 g的EMCV感染小鼠5 d時(shí)，能夠顯著提高心臟和脾臟指數(shù)。施開創(chuàng)等［19］使用103.67TCID50的EMCV GXLC 株腹腔注射小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)心臟重量與體質(zhì)量的比值在3～14 d 都會(huì)保持明顯升高。本實(shí)驗(yàn)僅在感染5 d 時(shí)顯著升高，這可能取決于選取相對(duì)較低的劑量和不同的毒株。EMCV 感染首先在位于扁桃體的巨噬細(xì)胞復(fù)制，然后隨著游走的巨噬細(xì)胞遍布全身［24］。脾臟紅髓中存在大量平滑肌細(xì)胞和纖維，外周圍繞脾索巨噬細(xì)胞，EMCV 在巨噬細(xì)胞中復(fù)制后，造成該類細(xì)胞脫離消失，而平滑肌細(xì)胞直接與血液中的凝血因子接觸，使血小板激活聚集，激發(fā)凝血系統(tǒng)，使紅細(xì)胞在脾臟中聚集，充血腫大。

本實(shí)驗(yàn)中，采用100 TCID50/20 g EMCV 感染昆明小鼠，隨著時(shí)間增加，心臟、腦和脾臟中的EMCV載量逐漸增加，在9 d 時(shí)達(dá)到頂峰，然后隨著時(shí)間增加病毒載量逐漸下降。殷雪婷［21］研究發(fā)現(xiàn)EMCV HLJ感染小鼠后，在組織器官中廣泛分布，各器官都能檢測到病毒的存在，其中心和腦病毒載量最高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，100 TCID50/20 g的EMCV感染可以導(dǎo)致病毒在小鼠體內(nèi)大量復(fù)制。

心臟和腦是EMCV 感染的靶器官，可以導(dǎo)致心肌炎和腦炎，最終導(dǎo)致心力衰竭和癱瘓。炎癥因子被認(rèn)為在心臟衰竭的發(fā)病過程中具有非常重要的作用，IL-1β 降低心臟收縮力，IL-6 導(dǎo)致負(fù)性肌力，TNF-α引起心肌收縮障礙、心肌炎、心室擴(kuò)張和心臟發(fā)育不全［25-27］。研究表明，致心肌炎型EMCV-M 感染小鼠后，心肌中IL-1β、TNF-α 表達(dá)與心肌病變程度 呈 正 相 關(guān)［19］。施 開 創(chuàng) 等［19］研 究 還 表 明EMCV GXLC 感染小鼠后，腦組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表達(dá)顯著上升。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，100 TCID50/20 g EMCV感染9 d時(shí)，能極顯著提升心臟和腦組織中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA表達(dá)，表明100 TCID50/20 g EMCV 感染小鼠造成了靶器官心和腦的炎癥反應(yīng)。

EMCV 感染小鼠誘發(fā)的心肌炎特點(diǎn)為心肌壞死和炎癥細(xì)胞浸潤，并且導(dǎo)致心力衰竭和擴(kuò)張型心肌?。?8］。研究發(fā)現(xiàn)EMCV復(fù)制主要位于大腦海馬體和小腦顆粒層的小區(qū)域壞死性病灶內(nèi)［29］。從胸椎到腰椎脊髓，控制骨骼肌活動(dòng)和張力的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元也會(huì)受到影響，從而導(dǎo)致癱瘓［30］。病理學(xué)組織切片結(jié)果顯示，100 TCID50/20 g EMCV感染能夠引起小鼠心臟組織大面積炎癥細(xì)胞浸潤和空泡化病變。也引起腦組織腦膜下血管擴(kuò)張、腦膜增厚、膜下出血、腦白質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤和形成血管套的病理變化。結(jié)果表明100 TCID50/20 g EMCV 感染小鼠造成了靶器官心和腦的病理損傷。

綜 上 所 述，腹 腔 注 射0.2 ml 100 TCID50/20 g EMCV 可引起小鼠發(fā)病，成功建立了EMCV 感染昆明小鼠模型。本實(shí)驗(yàn)通過測定不同時(shí)間點(diǎn)EMCV感染小鼠的不同臟器中病毒RNA，并觀察了心和腦組織病理學(xué)改變，了解EMCV進(jìn)入小鼠引起的變化。