外周血淋巴細胞亞群在兒童EB病毒感染中的變化及臨床意義

楊 冀 魏 兵 于 穎 于卉影 （北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗室，沈陽 110016）

EB 病毒（EBV）是皰疹病毒科嗜淋巴細胞病毒屬的雙鏈DNA病毒，人群血清EBV抗體陽性率超過90%［1］。EBV 主要目標為人類B 淋巴細胞，感染后可終身存在［2］。兒童機體免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟，抵抗病原體能力較弱。EBV 感染多發(fā)于學(xué)齡前期及學(xué)齡期兒童，多數(shù)患者起病輕微，無明顯癥狀或僅表現(xiàn)為上呼吸道感染。但也有部分患兒會累及其他器官，或發(fā)生EBV 感染相關(guān)性疾病，最常見的為傳染性單核細胞增多癥（infectious mononucleosis，IM），還包括腫瘤（伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌）和免疫性疾病（噬血細胞性淋巴組織細胞增生癥、干燥綜合征、多發(fā)性硬化）等［3-8］。本研究分析了淋巴細胞亞群在兒童EBV 感染診斷和預(yù)后評估中的作用，探索其在兒童EBV 感染過程中的規(guī)律，以期為臨床診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 選取2017年3月至2021年11月北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院兒科病房收治并送本實驗室進行淋巴細胞亞群檢測的EBV 感染患兒48 例作為觀察組，男32 例，女16 例，年齡1.10～9.00 歲，平均年齡（4.25±2.07）歲，其中15 例患兒為EBV 感染所致IM，18 例為EBV 感染合并MP 感染。另選擇同期就診的急性支氣管肺炎患兒23例，男9例，女14例，年齡0.50～5.75歲，平均年齡（3.00±3.10）歲，MP 感染患兒48 例，男25 例，女23 例，年齡0.33～10.00 歲，平均年齡（4.44±2.37）歲，作為對照組。收集患兒臨床資料，包括年齡、性別、熱程、臨床癥狀及實驗室檢查結(jié)果，包括EBV 抗體檢測、MP 抗體檢測、EBV-DNA 核酸載量、肝功能檢測。對119 例患兒的臨床資料進行回顧性分析，本研究經(jīng)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會審批［倫審Y（2022）023號］。

1.1.2 納入及排除標準 納入標準：符合臨床兒童主要非腫瘤性EBV 感染相關(guān)疾病診斷［9］；年齡≤14 歲。排除標準：使用免疫抑制劑及激素者；免疫功能缺陷疾病者；嚴重臟器功能不全者。

1.1.3 主要材料與試劑 絕對計數(shù)管、淋巴細胞亞群檢測試劑盒和紅細胞裂解液購自美國BD 公司；EBV 抗體檢測試劑盒購自歐蒙醫(yī)學(xué)診斷有限公司；EB病毒核酸定量檢測試劑盒購自圣湘生物公司。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞術(shù)檢測 抽取患兒EDTA-K2抗凝的外周血2 ml，向帶有微球的絕對計數(shù)管內(nèi)加入淋巴細胞亞群檢測混合抗體20 μl，利用反向加樣法加入混勻的外周血50 μl，振蕩混勻，室溫避光孵育30 min。加入紅細胞裂解液450 μl，振蕩混勻，室溫避光靜置15 min，F(xiàn)ASC CantoⅡ流式細胞儀檢測，BD Diva軟件分析淋巴細胞亞群比例。

1.2.2 EBV 抗體檢測 抽取患兒靜脈血2 ml 于促凝管，ELISA 檢測血清中衣殼抗原（CA-IgG 和CAIgM）、早期抗原IgG（EA-IgG）、核抗原IgG（NA-IgG）及抗體親和力。所有操作和陽性標準均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.3 EBV 核酸定量檢測 取患兒EDTA-K2抗凝的外周血1 ml，裂解紅細胞，PCR 檢測EBV-DNA 載量，以血EBV-DNA＞4.0×102拷貝數(shù)/ml為陽性。

1.2.4 肝功能檢測 采用生化法檢測肝功能，ALT≥50 U/L和/或AST≥40 U/L為肝功能異常。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件（IBM Corporation，USA）和GraphPad Prism 7.0 軟件（San Diego，USA）進行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布計量資料采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗；非正態(tài)分布計量資料兩組間比較采用WhitneyU秩和檢驗；多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；相關(guān)性分析采用Pearson分析；ROC 曲線分析各項指標檢測效能；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EBV 感染患兒外周血CD8+T 細胞增多 EBV感染患兒外周血淋巴細胞計數(shù)最高，顯著高于MP感染患兒和急性支氣管肺炎患兒（P＜0.05）。與急性支氣管肺炎和MP 感染患兒相比，EBV 感染患兒外周血淋巴細胞增多以T 淋巴細胞為主，其中CD8+T 細胞數(shù)量和比例均顯著升高（P＜0.05），而CD4+T 細胞比例降低（P＜0.05），數(shù)量無顯著變化，CD4+/CD8+明顯降低（P＜0.05）。EBV 感染患兒外周血B 細胞比例相較其他兩組患兒明顯降低（P＜0.05），但數(shù)量無顯著變化；NK 細胞數(shù)量略有增加但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，比例無顯著變化（表1）。

表1 急性支氣管肺炎、MP感染和EBV感染患兒外周血淋巴細胞亞群比較（±s）Tab.1 Comparison of peripheral blood lymphocyte subsets in children with acute bronchopneumonia， MP infection and EBV infection （±s）

表1 急性支氣管肺炎、MP感染和EBV感染患兒外周血淋巴細胞亞群比較（±s）Tab.1 Comparison of peripheral blood lymphocyte subsets in children with acute bronchopneumonia， MP infection and EBV infection （±s）

Note：1）P＜0.05 vs acute bronchopneumonia； 2）P＜0.05 vs MP infection.

EBV infection（n=48）4 973.80±2 500.801）2）3 801.27±2 073.331）2）1 832.03±1 535.811）2）1 484.44±916.82 687.84±567.84 448.14±289.86 74.92±7.811）2）33.66±13.981）2）32.57±5.701）2）12.51±5.70 11.55±7.211）2）1.26±0.811）2）Lymphocyte subsets Lymphocyte count/（cell·μl-1）CD3+T cells count/（cell·μl-1）CD3+CD8+T cells count/（cell·μl-1）CD3+CD4+T cells count/（cell·μl-1）NK cells count/（cell·μl-1）B cells count/（cell·μl-1）CD3+T cells percentage/%CD3+CD8+T cells percentage/%CD3+CD4+T cells percentage/%NK cells percentage/%B cells percentage/%CD4+/CD8+Acute bronchopneumonia（n=23）3 683.55±2 024.30 2 639.21±1 522.35 723.78±484.26 1 731.28±1 227.53 407.95±266.40 620.32±392.44 69.48±8.05 19.93±7.45 43.34±11.91 12.12±6.15 17.26±5.38 2.84±2.24 MP infection（n=48）2 784.70±1 319.661）1 897.10±921.30 577.32±225.91 1 154.90±724.06 326.91±233.62 476.67±263.52 69.03±7.00 21.10±5.18 40.91±7.36 12.10±5.53 17.52±5.44 2.04±0.86

2.2 EBV 感染患兒外周血淋巴細胞變化與BEVDNA 載量相關(guān) EBV 感染患兒外周血淋巴細胞與BEV-DNA 載量相關(guān)性分析顯示，淋巴細胞計數(shù)（P=0.000 3，r=0.549 5）、CD3+T細胞計數(shù)（P=0.000 3，r=0.564 0）、CD3+T 細胞比例（P=0.008 5，r=0.395 1）、CD3+CD8+T 細 胞 計 數(shù)（P＜0.000 1，r=671 3）、CD3+CD8+T 細胞比例（P＜0.000 1，r=0.700 9）、NK 細胞計數(shù)（P=0.000 6，r=0.546 7）與病毒載量呈正相關(guān)，CD3+CD4+T 細胞比例（P=0.000 2，r=-0.585 9）、B 細胞計數(shù)（P=0.003 8，r=-0.470 3）、B 細胞比例（P＜0.000 1，r=-0.622 4）與病毒載量呈負相關(guān)。其中CD3+CD8+T 細胞計數(shù)和CD3+CD8+T 細胞比例與病毒載量相關(guān)程度最強（圖1）。

圖1 淋巴細胞亞群與BEV-DNA載量的相關(guān)性Fig.1 Correlation between lymphocyte subsets and BEVDNA load

2.3 EBV 感染患兒外周血CD8+T 細胞和B 細胞變化與疾病進展相關(guān) 與非IM 患兒相比，IM 患兒淋巴細胞數(shù)量增加（P＜0.001），其中淋巴細胞和NK 細胞 數(shù) 量 增 加（P＜0.001），B 細 胞 數(shù) 量 減 少（P＜0.001），T 細胞數(shù)量增加以CD8+T 細胞為主（P＜0.001），而CD4+T細胞數(shù)量無變化；細胞亞群比例方面，淋巴細胞和CD8+T 細胞比例升高（P＜0.001），而CD4+T 細 胞（P=0.004）和B 細 胞 比 例 下 降（P＜0.001），CD4+/CD8+降低（P=0.001，表2）。與肝功能正常的EBV 感染患兒相比，肝功能異?；純和庵苎馨图毎麛?shù)量增加（P＜0.001），其中T 細胞（P＜0.001）和NK 細胞（P=0.001）數(shù)量增加，B 細胞數(shù)量減少（P=0.049），T 細胞數(shù)量增加以CD8+T 細胞為主（P＜0.001），而CD4+T 細胞數(shù)量無差異；細胞亞群比例上，淋巴細胞（P=0.002）和CD8+T 細胞比例（P＜0.001）升高，CD4+T 細胞（P=0.002）和B 細胞（P＜0.001）比例降低，CD4+/CD8+降低（P＜0.001，表3）。

表2 IM與非IM的EBV感染患兒外周血淋巴細胞亞群比較（±s）Tab.2 Comparison of peripheral blood lymphocyte subsets in EBV-infected children with IM and non-IM （±s）

表2 IM與非IM的EBV感染患兒外周血淋巴細胞亞群比較（±s）Tab.2 Comparison of peripheral blood lymphocyte subsets in EBV-infected children with IM and non-IM （±s）

Lymphocyte subsets Lymphocyte count/（cell·μl-1）CD3+T cells count/（cell·μl-1）CD3+CD8+T cells count/（cell·μl-1）CD3+CD4+T cells count/（cell·μl-1）NK cell count/（cell·μl-1）B cells count/（cell·μl-1）CD3+T cells percentage/%CD3+CD8+T cells percentage/%CD3+CD4+T cells percentage/%NK cells percentage/%B cells percentage/%CD4+/CD8+IM （n=15）6 736.45±2 523.07 5 467.32±1 898.20 3 192.55±1 689.57 1 545.72±847.45 1 068.35±641.17 256.49±87.20 80.72±3.44 54.44±12.83 24.72±13.38 14.44±4.73 4.37±2.17 0.72±0.72 non-IM（n=33）4 674.80±2 592.39 3 556.37±2 144.66 1 750.70±1 561.24 1 419.88±900.97 621.38±545.01 435.38±278.05 73.18±12.58 32.55±13.75 32.96±12.25 11.82±5.10 11.91±7.22 1.30±0.81 P＜0.001＜0.001＜0.001 0.443＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.004 0.032＜0.001 0.001

表3 肝功能異常與肝功能正常的EBV感染患兒外周血淋巴細胞亞群比較（±s）Tab.3 Comparison of peripheral blood lymphocyte subsets in EBV-infected children with abnormal liver function and normal liver function （±s）

表3 肝功能異常與肝功能正常的EBV感染患兒外周血淋巴細胞亞群比較（±s）Tab.3 Comparison of peripheral blood lymphocyte subsets in EBV-infected children with abnormal liver function and normal liver function （±s）

Lymphocyte subsets Lymphocyte count/（cell·μl-1）CD3+T cells count/（cell·μl-1）CD3+CD8+T cells count/（cell·μl-1）CD3+CD4+T cells count/（cell·μl-1）NK cell count/（cell·μl-1）B cells count/（cell·μl-1）CD3+T cells percentage/%CD3+CD8+T cells percentage/%CD3+CD4+T cells percentage/%NK cells percentage/%B cells percentage/%CD4+/CD8+Abnormal liver function（n=17）6 033.28±1 942.42 4 884.82±1 506.14 2 781.98±1 225.56 1 410.16±689.10 870.75±565.44 319.39±156.74 79.98±5.07 44.45±11.79 24.73±12.61 13.48±5.27 5.97±3.97 0.69±0.60 Normal liver function（n=25）4 004.25±2 566.49 2 974.09±2 119.93 1 257.08±1 500.49 1 429.87±1 052.69 469.13±466.48 495.58±325.04 72.84±7.30 27.83±12.09 32.79±10.34 10.84±4.94 14.87±6.80 1.63±0.80 P＜0.001＜0.001＜0.001 0.749 0.001 0.049 0.002＜0.001 0.002 0.134＜0.001＜0.001

2.4 淋巴細胞亞群對EBV 感染患兒的診斷效能分析 淋巴細胞亞群診斷效能分析顯示，外周血淋巴細胞計數(shù)、CD3+T 細胞計數(shù)、CD3+CD8+T 細胞計數(shù)、NK 細胞計數(shù)、CD3+T 細胞比例和CD3+CD8+T 細胞比例的AUC 分別為0.750、0.773、0.826、0.689、0.718和0.779（P＜0.05）。其中CD3+CD8+T 細胞計數(shù)特異度和準確度最高分別為91.55%和78.99%，CD3+T細胞比例和CD3+CD8+T 細胞比例敏感度最高同為70.83%（表4、圖2）。

表4 淋巴細胞亞群診斷EBV感染的價值Tab.4 Diagnosis of lymphocyte subsets in EBV infection

圖2 淋巴細胞亞群診斷EBV感染的ROC曲線Fig.2 ROC curve of lymphocyte subsets in diagnosis of EBV infection

3 討論

EBV 在外界生存能力弱，人類是其主要的感染宿主且普遍易感［10］。EBV 感染后，多數(shù)輕癥患者發(fā)病隱匿，且無明顯臨床癥狀；少數(shù)重癥患者可隨著疾病進展轉(zhuǎn)化成為一些重型疾病，因此，EBV 感染的準確診斷、及時治療以及預(yù)后評估尤為重要。兒童EBV 感染常見臨床特點依次為扁桃體紅腫、淋巴結(jié)腫大、發(fā)熱、脾大、咳嗽、眼瞼浮腫、肝功能異常及皮疹等［11］。小兒急性支氣管肺炎和MP 感染發(fā)病率較高，與EBV 感染臨床癥狀相似，且MP 感染常合并EBV 感染。EBV 感染人體B 細胞并利用B 細胞分化途徑建立生發(fā)中心模型，在循環(huán)記憶B 細胞中長期維持［2］。同時，EBV 感染后可激活細胞毒性T 細胞（cytotoxic T cell，CTL）清 除 病 原 體，CTL 主 要 為CD8+T 細胞，與本研究結(jié)果相符。與小兒急性支氣管肺炎和MP 感染肺炎患兒相比，EBV 感染患兒外周血淋巴細胞數(shù)量增加，且主要為CD8+T 細胞數(shù)量和比例升高，CD4+T 細胞和B 細胞比例下降，CD4+/CD8+明顯降低。由于淋巴細胞總數(shù)顯著增加，因此B 細胞僅表現(xiàn)為比例下降，數(shù)量變化不明顯。本研究選取臨床常見且臨床癥狀較為相近的急性支氣管肺炎和MP 感染患兒作為對照，而非健康兒童，急性支氣管肺炎和MP 感染是感染性疾病，也可引起機體免疫應(yīng)答，導(dǎo)致淋巴細胞亞群改變。但淋巴細胞亞群診斷效能分析顯示，外周血淋巴細胞計數(shù)、CD3+T 細胞、CD3+CD8+T 細胞和NK 細胞對EBV 感染仍具有較好的檢驗效能，表明淋巴細胞亞群檢測具備鑒別EBV 感染、MP 感染和急性支氣管肺炎的能力。

外周血BEV-DNA 載量能夠反映病毒體內(nèi)復(fù)制水平及機體免疫防御能力。研究顯示，兒童EBV 感染中，與低病毒載量患兒相比，高病毒載量患兒退熱時間長，住院天數(shù)多，且眼瞼水腫、扁桃體腫大、淋巴結(jié)腫大、肝臟腫大和脾腫大發(fā)生率高，提示BEV-DNA 載量與疾病嚴重程度有關(guān)［12-13］。EBV 持續(xù)大量復(fù)制是誘發(fā)鼻咽癌的一個重要因素，且病毒載量高的患者復(fù)發(fā)率高，生存期差［14］。此外，慢性淋巴細胞白血病患者BEV-DNA 載量顯著高于健康人群，相較于EBV 負荷低患者，高負荷患者死亡風(fēng)險比增加3.14倍［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，EBV 感染患兒外周血淋巴亞群改變與BEV-DNA 載量顯著相關(guān)，其中CD3+CD8+T細胞計數(shù)和CD3+CD8+T細胞比例與病毒載量相關(guān)程度最強。淋巴細胞亞群可反映機體當前免疫功能、狀態(tài)和平衡水平等，因此，可通過監(jiān)測外周血淋巴細胞亞群實時觀察患兒機體免疫應(yīng)答狀態(tài)，評估機體清除病原體的能力。

EBV 感染相關(guān)性疾病臨床表現(xiàn)多樣，IM 是最常見的一種。EBV 感染產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可間接損傷肝臟，導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨酶水平升高［16］。肝組織病理顯示肝小葉和肝門管區(qū)內(nèi)可見感染的淋巴細胞浸潤，組織細胞變性壞死，部分可見肝纖維化，呈現(xiàn)慢性活動性肝炎［17］。本研究EBV 感染患兒中，與非IM 和肝功能正?；純合啾?，IM 和肝功能異?；純毫馨图毎麛?shù)量、T 細胞數(shù)量和比例、CD8+T 細胞數(shù)量和比例、NK細胞數(shù)量增加更為顯著，而B細胞數(shù)量和比例及CD4+/CD8+降低也更為顯著。提示外周血淋巴細胞亞群變化程度越顯著，患兒發(fā)展為IM 和/或發(fā)生臟器受累的可能性越大。EBV 感染引起的肝功能損害可能與CD8+T細胞大量增殖有關(guān)［18］。

免疫功能低下可能是EBV 感染及相關(guān)疾病發(fā)生的重要原因，外周血淋巴細胞亞群可很好地反映機體免疫狀態(tài)。因此，監(jiān)測淋巴細胞亞群對EBV 感染患兒疾病診斷及評估疾病進展和預(yù)后具有重要意義，有利于指導(dǎo)臨床用藥。