二氫楊梅素通過JAK2/STAT3 通路調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化對異氟醚所致成年小鼠早期認(rèn)知功能障礙的影響

劉 偉 方 軍 張抗抗 （滕州市中心人民醫(yī)院麻醉科，滕州 277599）

異氟醚作為常用的吸入式麻醉劑，可通過誘導(dǎo)認(rèn)知功能障礙相關(guān)的神經(jīng)毒性或降低海馬乙酰膽堿水平引發(fā)術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）［1］。POCD 的主要特征為患者在麻醉或手術(shù)后出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，表現(xiàn)為思維、注意力、記憶等認(rèn)知功能改變，提高患者的住院時間及病死率，其病理生理學(xué)機(jī)制至今仍然未知，因此有必要對異氟醚所致POCD 的發(fā)生及治療機(jī)制進(jìn)行深入探究［2-3］。有研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞活化介導(dǎo)的中樞神經(jīng)炎癥是POCD 發(fā)生的主要原因之一，因此有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化可能對POCD 的治療具有重要意義［4］。二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）具有抗炎及神經(jīng)保護(hù)作用，已被多項研究證實可改善認(rèn)知和運動能力，研究發(fā)現(xiàn)其在丙泊酚誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙大鼠中可通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化改善認(rèn)知功能障礙［4-5］。蛋白酪氨酸激酶2/信號 轉(zhuǎn) 導(dǎo) 和 轉(zhuǎn) 錄 活 化 因 子3（Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3）通路是調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化的關(guān)鍵通路，抑制其激活可減輕小膠質(zhì)細(xì)胞活化誘發(fā)的炎癥反應(yīng)［6］。有報道稱，DMY 可通過抑制JAK2/STAT3 通路改善脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，但DMY是否可通過調(diào)控JAK2/STAT3 通路改善POCD 還未可知［7］。因此，本研究使用異氟醚處理小鼠，探究DMY 通過JAK2/STAT3通路調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化對異氟醚所致成年小鼠早期認(rèn)知功能障礙的影響，以期為DMY在POCD中的治療機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 50 只SPF 級雄性C57BL/6 小鼠（20～25 g）購自南方醫(yī)科大學(xué)，許可證號：SCXK（粵）2016-0041，12 h/12 h 明暗交替、室內(nèi)環(huán)境溫度（25±10） ℃，通風(fēng)飼養(yǎng)7 d。

1.1.2 主要試劑與儀器 二氫楊梅素（YG10356，上海韻泰信息科技有限公司）；免疫組化試劑盒（PK-7800，北京博蕾德生物科技有限公司）；BCA 試劑盒、蛋白提取試劑盒（LCB004、MB2820，上海榕柏生物技術(shù)有限公司）；兔抗CD68 抗體（bs-0649R-2，上海恒斐生物科技有限公司）；HRP-IgG 抗體、兔抗精 氨 酸 酶（Arginase）、β-actin、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、兔抗離子鈣結(jié)合銜接分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）抗體（7074、93668、4970、4904、9145、3230、3771、13120、17198，Cell Signaling Technology）；IL-10、IL-1β 試劑盒（C9264、C9278，上海名勁生物科技有限公司）。GenoSens 2200 Touch 凝膠成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）；LONZA ELx808 酶標(biāo)儀（北京澤平科技有限責(zé)任公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型構(gòu)建 將50 只C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為對照組（10只）和模型組（40只）。模型構(gòu)建：將小鼠置于鋪有薄層鈣石灰的40 cm×35 cm×30 cm麻醉箱中，持續(xù)4 h 輸入異氟醚（1.4%，4 L/min），4 h后小鼠仰臥或側(cè)臥時間若超出60 s 即翻正反射消失，則造模成功［8］，成功率為100%；對照組小鼠不進(jìn)行任何處理；造模成功后次日，將模型組小鼠以10只/組分為異氟醚組、DMY-L組（100 mg/kg DMY）、DMY-H 組（200 mg/kg DMY）、DMY-H+AG490 組（200 mg/kg DMY+JAK2抑制劑AG490 0.4 mg/kg）［4，9］。DMY-L 組、DMY-H 組、DMY-H+AG490 組小鼠灌胃相應(yīng)劑量DMY 或AG490，對照組、異氟醚組灌胃等量生理鹽水，為時1周（1次/d）。

1.2.2 大鼠行為學(xué)觀察

1.2.2.1 曠場實驗 處理結(jié)束后次日，將小鼠置于觀察箱（100 cm×100 cm）中，通過Smart 系統(tǒng)記錄5 min內(nèi)其運動路程及站立次數(shù)，以評估小鼠自主活動能力；每只小鼠實驗結(jié)束后使用75%乙醇擦去觀察箱殘留氣味，避免干擾后續(xù)實驗。

1.2.2.2 新舊事物識別 記錄5 min 內(nèi)小鼠對新舊物體的探索次數(shù)，指標(biāo)越高表示其記憶能力越好。

1.2.2.3 水迷宮實驗 將自制的水迷宮水池（直徑：150 cm，高：50 cm，水深：25 cm）均等劃分為4 個象限，于距第一象限池壁35 cm處放置1個距離水面3 cm 的黑色圓形平臺（高：22 cm，直徑：12 cm），于第三象限將小鼠放入水中，引導(dǎo)至平臺停留20 s 后推入水中，再次尋找平臺，進(jìn)行為時5 d 的訓(xùn)練（4 次/d），全程使用計算機(jī)攝像系統(tǒng)觀察其運動軌跡，第6天移去平臺，記錄小鼠穿越平臺次數(shù)及進(jìn)入水中至到達(dá)平臺的時間（逃避潛伏期），以評估其認(rèn)知功能。

1.2.3 免疫組化法測定海馬組織Iba1 表達(dá) 行為學(xué)測試結(jié)束后每組選取5 只小鼠取其腦組織，分離海馬組織于多聚甲醛中過夜固定，常規(guī)石蠟包埋后進(jìn)行連續(xù)切片（4 μm），使用過氧化氫孵育（10 min），消除內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復(fù)后孵育血清進(jìn)行封閉，0.5 h 后Iba1 一抗過夜孵育，次日使用生物素標(biāo)記的二抗孵育（20 min），DAB顯色后脫水透明，進(jìn)行封片，通過Image Pro Plus 6.0 觀察Iba1 棕黃色陽性細(xì)胞并計數(shù)（×400）。

1.2.4 ELISA 檢測小鼠海馬組織IL-10、IL-1β 水平 取剩余小鼠腦組織，剝離海馬組織，12 500 r/min離心20 min 后取其勻漿上清液，一部分根據(jù)IL-10、IL-1β ELISA 試劑盒于450 nm 處測定二者水平（n=5），剩余部分上清液進(jìn)行Western blot實驗。

1.2.5 Western blot 檢測海馬組織CD68、iNOS、精氨酸酶蛋白及JAK2/STAT3 通路蛋白表達(dá) 從1.2.4 蛋白上清液中提取總蛋白，BCA 法檢測其濃度后取蛋白樣品進(jìn)行100 ℃沸水浴變性（10 min），冷卻后以40 μg/孔進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳，切下目的條帶于低溫下轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%牛血清白蛋白 封 閉2 h，一 抗（兔 抗CD68、iNOS、Arginase、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2、β-actin抗體，1∶1 000）過夜孵育后，山羊抗兔HRP-IgG 二抗（1∶5 000）孵育1 h，滴加ECL 化學(xué)液顯影，蛋白凝膠成像儀成像，Image J 分析條帶灰度后計算CD68、iNOS、精氨酸酶、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2蛋白水平（n=5）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 SPSS23.0 軟件分析實驗所得數(shù)據(jù)后用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間數(shù)據(jù)兩兩比較采用LSD 檢驗；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DMY 對小鼠自主活動及新舊事物識別能力的影響 與對照組相比，異氟醚組小鼠站立次數(shù)及運動路程顯著減少（P＜0.05）；與異氟醚組相比，DMYL 組、DMY-H 組小鼠站立次數(shù)及運動路程顯著增加（P＜0.05）；與DMY-L 組相比，DMY-H 組小鼠站立次數(shù)及運動路程顯著增加（P＜0.05）；與DMY-H 組相比，DMY-H+AG490 組站立次數(shù)及運動路程顯著增加（P＜0.05），見表1。

表1 DMY 對小鼠自主活動及新舊事物識別能力的影響（±s，n=10）Tab.1 Effects of DMY on autonomous activity and recognition ability of new and old things in mice （±s，n=10）

表1 DMY 對小鼠自主活動及新舊事物識別能力的影響（±s，n=10）Tab.1 Effects of DMY on autonomous activity and recognition ability of new and old things in mice （±s，n=10）

Note：Compared with control group， 1） P＜0.05； compared with isoflurane group， 2） P＜0.05； compared with DMY-L group， 3） P＜0.05； compared with DMY-H group， 4） P＜0.05.

Standing times/time 67.20±8.33 43.08±4.301）50.40±5.052）57.63±4.122）3）64.90±5.244）Groups Control Isoflurane DMY-L DMY-H DMY-H+AG490 Movement distance/cm 2 120.35±225.40 864.12±109.821）1 226.70±122.172）1 673.12±140.392）3）2 070.85±153.224）

2.2 DMY 對小鼠認(rèn)知功能的影響 與對照組相比，異氟醚組小鼠穿越平臺次數(shù)顯著減少，逃避潛伏期顯著增加（P＜0.05）；與異氟醚組相比，DMY-L組、DMY-H 組小鼠穿越平臺次數(shù)顯著增加，逃避潛伏期顯著減少（P＜0.05）；與DMY-L 組相比，DMY-H組小鼠穿越平臺次數(shù)顯著增加，逃避潛伏期顯著減少（P＜0.05）；與DMY-H 組相比，DMY-H+AG490 組穿越平臺次數(shù)顯著增加，逃避潛伏期顯著減少（P＜0.05），見表2。

表2 DMY對小鼠認(rèn)知功能的影響（±s，n=10）Tab.2 Effects of DMY on cognitive function in mice（±s，n=10）

表2 DMY對小鼠認(rèn)知功能的影響（±s，n=10）Tab.2 Effects of DMY on cognitive function in mice（±s，n=10）

Note：Compared with control group， 1） P＜0.05； compared with isoflurane group， 2） P＜0.05； compared with DMY-L group， 3） P＜0.05； compared with DMY-H group， 4） P＜0.05.

Escape latency/s 14.10±1.12 27.86±2.501）22.73±1.372）18.66±1.112）3）15.40±1.204）Groups Control Isoflurane DMY-L DMY-H DMY-H+AG490 Times of crossing platform/time 8.93±1.02 2.01±0.571）4.80±0.612）6.61±0.752）3）8.70±0.634）

2.3 DMY 對小鼠海馬組織Iba1表達(dá)的影響 與對照組相比，異氟醚組小鼠海馬組織Iba1 陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加（P＜0.05）；與異氟醚組相比，DMY-L 組、DMY-H 組Iba1 陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）；與DMY-L組相比，DMY-H組Iba1陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）；與DMY-H組相比，DMY-H+AG490組Iba1陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05），見表3、圖1。

圖1 DMY對小鼠海馬組織Iba1表達(dá)的影響（×200）Fig.1 Effect of DMY on Iba1 expression in mouse hippocampus （×200）

表3 DMY對小鼠海馬組織Iba1表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.3 Effect of DMY on Iba1 expression in mouse hippocampus （±s，n=5）

表3 DMY對小鼠海馬組織Iba1表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.3 Effect of DMY on Iba1 expression in mouse hippocampus （±s，n=5）

Note：Compared with control group， 1） P＜0.05； compared with isoflurane group， 2） P＜0.05； compared with DMY-L group， 3） P＜0.05； compared with DMY-H group， 4） P＜0.05.

Number of positive cells/individual 7.82±1.33 98.40±8.271）65.24±6.392）40.52±5.032）3）19.06±3.274）Groups Control Isoflurane DMY-L DMY-H DMY-H+AG490

2.4 DMY 對小鼠海馬組織IL-10、IL-1β 水平的影響 與對照組相比，異氟醚組小鼠海馬組織IL-10水平顯著降低，IL-1β 水平顯著升高（P＜0.05）；與異氟醚組相比，DMY-L組、DMY-H組IL-10水平顯著升高，IL-1β 水平顯著降低（P＜0.05）；與DMY-L 組相比，DMY-H 組IL-10 水平顯著升高，IL-1β 水平顯著降低（P＜0.05）；與DMY-H 組相比，DMY-H+AG490組IL-10 水平顯著升高，IL-1β 水平顯著降低（P＜0.05），見表4。

表4 DMY 對小鼠海馬組織IL-10、IL-1β 水平的影響（±s，n=5）Tab.4 Effect of DMY on levels of IL-10 and IL-1β in hippocampus of mouse （±s，n=5）

表4 DMY 對小鼠海馬組織IL-10、IL-1β 水平的影響（±s，n=5）Tab.4 Effect of DMY on levels of IL-10 and IL-1β in hippocampus of mouse （±s，n=5）

Note：Compared with control group， 1） P＜0.05； compared with isoflurane group， 2） P＜0.05； compared with DMY-L group， 3）P＜0.05； compared with DMY-H group， 4）P＜0.05.

IL-10/（μg·L-1）22.77±2.30 10.34±0.981）13.90±1.032）17.92±1.522）3）21.74±2.104）Groups Control Isoflurane DMY-L DMY-H DMY-H+AG490 IL-1β/（μg·L-1）5.65±0.61 11.51±0.891）9.58±0.462）7.18±0.442）3）6.03±0.384）

2.5 DMY 對小鼠海馬組織CD68、iNOS、精氨酸酶表達(dá)的影響 與對照組相比，異氟醚組小鼠海馬組織精氨酸酶表達(dá)顯著減少，CD68、iNOS 表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與異氟醚組相比，DMY-L 組、DMY-H組精氨酸酶表達(dá)顯著增加，CD68、iNOS 表達(dá)顯著減少（P＜0.05）；與DMY-L 組相比，DMY-H 組精氨酸酶表達(dá)顯著增加，CD68、iNOS 表達(dá)顯著減少（P＜0.05）；與DMY-H 組相比，DMY-H+AG490 組精氨酸酶表達(dá)顯著增加，CD68、iNOS 表達(dá)顯著減少（P＜0.05），見表5、圖2。

圖2 DMY 對小鼠海馬組織CD68、iNOS、精氨酸酶表達(dá)的影響Fig.2 Effect of DMY on expressions of CD68， iNOS and Arginase in mouse hippocampus

表5 DMY 對小鼠海馬組織CD68、iNOS、Arginase 表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.5 Effect of DMY on expressions of CD68， iNOS and Arginase in mouse hippocampus （±s， n=5）

表5 DMY 對小鼠海馬組織CD68、iNOS、Arginase 表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.5 Effect of DMY on expressions of CD68， iNOS and Arginase in mouse hippocampus （±s， n=5）

Note：Compared with control group， 1） P＜0.05； compared with isoflurane group， 2） P＜0.05； compared with DMY-L group， 3） P＜0.05； compared with DMY-H group， 4） P＜0.05.

CD68/β-actin 0.65±0.08 1.73±0.221）1.36±0.152）1.01±0.102）3）0.74±0.084）Groups Control Isoflurane DMY-L DMY-H DMY-H+AG490 iNOS/β-actin 0.41±0.06 1.60±0.201）1.19±0.142）0.87±0.092）3）0.60±0.064）Arginase/β-actin 1.83±0.31 0.40±0.071）0.71±0.102）1.12±0.132）3）1.63±0.234）

2.6 DMY 對小鼠海馬組織JAK2/STAT3 通路蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，異氟醚組小鼠海馬組織p-STAT3/STAT3 及p-JAK2/JAK2 表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與異氟醚組相比，DMY-L 組、DMY-H 組p-STAT3/STAT3 及p-JAK2/JAK2 表達(dá)顯著減少（P＜0.05）；與DMY-L 組相比，DMY-H 組p-STAT3/STAT3及p-JAK2/JAK2 表達(dá)顯著減少（P＜0.05）；與DMY-H組 相 比，DMY-H+AG490 組p-STAT3/STAT3 及p-JAK2/JAK2表達(dá)顯著減少（P＜0.05），見表6、圖3。

圖3 DMY 對小鼠海馬組織JAK2/STAT3 通路蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of DMY on JAK2/STAT3 pathway protein expression in mouse hippocampus

表6 DMY 對小鼠海馬組織JAK2/STAT3 通路蛋白表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.6 Effect of DMY on JAK2/STAT3 pathway protein expression in mouse hippocampus （±s，n=5）

表6 DMY 對小鼠海馬組織JAK2/STAT3 通路蛋白表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.6 Effect of DMY on JAK2/STAT3 pathway protein expression in mouse hippocampus （±s，n=5）

Note：Compared with control group， 1） P＜0.05； compared with isoflurane group， 2） P＜0.05； compared with DMY-L group， 3）P＜0.05； compared with DMY-H group， 4）P＜0.05.

p-JAK2/JAK2 0.53±0.06 1.88±0.281）1.38±0.172）0.71±0.102）3）0.30±0.09 Groups Control Isoflurane DMY-L DMY-H DMY-H+AG490 p-STAT3/STAT3 0.39±0.05 1.62±0.211）1.20±0.152）0.89±0.102）3）0.54±0.074）

3 討論

大量研究表明，吸入性麻醉劑異氟醚可通過濃度及時間依賴性方式影響動物的學(xué)習(xí)和記憶能力［1，8］。POCD是一種手術(shù)并發(fā)癥，研究發(fā)現(xiàn)，由麻醉引發(fā)的神經(jīng)炎癥是POCD 發(fā)生的主要原因［10-11］。小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要免疫細(xì)胞，在正常狀態(tài)下處于非活化狀態(tài)，一旦受到炎癥刺激就會被顯著激活，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子表達(dá)，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致POCD［10］。因此，本研究通過使小鼠吸入異氟醚成功構(gòu)建異氟醚麻醉模型，以探究有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化對異氟醚所致POCD治療的影響。

小膠質(zhì)細(xì)胞在炎癥狀態(tài)下可分化為M1型及M2型，M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞可促進(jìn)IL-1β 等炎癥因子表達(dá)，而M2 型 則 促 進(jìn)IL-10 等 抗 炎 因 子 表 達(dá)［10-12］。DMY 可穿過血腦屏障，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功效，有報道稱，DMY 在APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠中可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活起到神經(jīng)保護(hù)作用［13］。DMY 可通過激活A(yù)MP 依賴的蛋白激酶［adenosine 5'-monophosphate （AMP）-activated protein kinase，AMPK］途徑抑制炎癥、氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡，從而改善鉛誘導(dǎo)的小鼠認(rèn)知功能障礙［14］。還有研究表明，DMY 可通過促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1向M2型轉(zhuǎn)化改善丙泊酚誘導(dǎo)的大鼠認(rèn)知功能障礙［4］。本研究結(jié)果表明，DMY 可有效改善異氟醚所致成年小鼠運動、記憶等認(rèn)知功能障礙。M1型和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志分子分別為iNOS 和精氨酸酶［4］。CD68 作為一種溶酶體蛋白，是活化的小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，在細(xì)胞活化后表達(dá)顯著增加［15］。本研究還發(fā)現(xiàn)，與異氟醚組相比，DMY 可顯著增加IL-10 及精氨酸酶表達(dá)，減少小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba1 陽性細(xì)胞數(shù)及IL-1β、CD68、iNOS 表達(dá)，表明DMY 可有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，并促進(jìn)其由M1 型向M2 型轉(zhuǎn)化，減輕炎癥損傷。

多項研究表明JAK2/STAT3 參與小膠質(zhì)細(xì)胞的活化［6，16］。STAT3 在小膠質(zhì)細(xì)胞對各種刺激的應(yīng)答中具有重要調(diào)節(jié)作用，其激活可促進(jìn)促炎因子表達(dá)［17］。Kappa 阿 片 受 體 激 動 劑 通 過 抑 制JAK2/STAT3 通路改善大鼠體外循環(huán)POCD［18］。伐尼克蘭通過抑制JAK2/STAT3通路減少老年雄性C57BL/6N小鼠剖腹手術(shù)后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)、DNA 損傷及術(shù)后認(rèn) 知 障 礙［19］。高 遷 移 率 族 蛋 白B1（high mobility group protein box 1，HMGB1）分泌到胞外可刺激炎癥介質(zhì)釋放，加劇炎癥反應(yīng)，而DMY 可通過抑制JAK2/STAT3 通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1 釋放，從而抑制炎癥反應(yīng)［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，DMY 可有效抑制異氟醚所致成年小鼠海馬組織JAK2/STAT3通路激活，還發(fā)現(xiàn)STAT3抑制劑AG490可進(jìn)一步增強(qiáng)DMY 對異氟醚所致成年小鼠認(rèn)知功能障礙的改善作用，該結(jié)果表明，DMY 對異氟醚所致成年小鼠認(rèn)知功能障礙的改善可能與其抑制JAK2/STAT3通路激活有關(guān)。

綜上所述，DMY 可能通過抑制JAK2/STAT3 通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化，促進(jìn)其M1/M2 型轉(zhuǎn)化，從而改善異氟醚所致成年小鼠早期認(rèn)知功能障礙。本研究不僅為DMY 在POCD 中的治療機(jī)制研究提供參考，還為POCD 治療新型藥物的探究提供了方向。但由于模型數(shù)量限制，本研究未對DMY 在POCD 中的其他可能機(jī)制進(jìn)行探究，課題組將在未來的研究中進(jìn)一步補(bǔ)充。