苦蕎黃酮提取物通過抑制NF-κB 信號(hào)通路減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血模型大鼠神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激①

艾奇淵 王 勇 徐瑞春 彭 臻 李勁松 （貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，都勻 558000）

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage， SAH）指腦底部或表面病變血管破裂，血液直接流入蛛網(wǎng)膜引起的臨床綜合征，雖然血管介入技術(shù)等治療方法已取得很大進(jìn)展，但SAH 患者預(yù)后仍不樂觀，早期腦損傷是SAH 患者死亡的主要原因［1-2］。苦蕎是雙子葉蓼科蕎麥屬植物的成熟種子，其生物黃酮含量尤為豐富［3］。黃酮是廣泛存在于植物界的酚類組分，因其減少自由基形成和清除存在自由基的抗氧化生物活性而在抗腫瘤、抗炎和心血管疾病治療方面顯示出卓越的治療效果［4-5］。研究表明，氧化應(yīng)激在SAH 患者腦死亡的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，出血后產(chǎn)生的過量活性氧（reactive oxygen species，ROS）能夠激活相關(guān)信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［6］。神經(jīng)炎癥以炎癥細(xì)胞和炎癥細(xì)胞因子增加為主要標(biāo)志，是介導(dǎo)SAH 后早期腦損傷的另一發(fā)病機(jī)制［7］。因此有效控制SAH 患者神經(jīng)炎癥，減緩腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)預(yù)防早期腦損傷具有重要意義。核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號(hào)通路長(zhǎng)久以來被認(rèn)為是典型的炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在表達(dá)炎癥基因中占有樞紐性地位［8］。此外，研究發(fā)現(xiàn)多種心腦血管疾病與氧化應(yīng)激和NF-κB信號(hào)通路激活有關(guān)［9］。本研究通過探索苦蕎黃酮提取物對(duì)SAH 模型大鼠NF-κB 等信號(hào)通路的影響，以期為防治SAH患者早期腦損傷提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)新生Sprague-Dawley大鼠60 只，雌雄各半，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)自貴州中醫(yī)藥大學(xué)（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所），動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（黔）2021-0003。本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核通過（批準(zhǔn)號(hào)：202105001）。

1.1.2 主要試劑 伊文思藍(lán)染色液購(gòu)自北京伊塔生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPx）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京賽泓瑞生物科技有限公司；IL-6、IL-1β 和TNF-α 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海賓智生物科技有限公司；苦蕎黃酮提取物由南京道斯夫生物科技有限公司提供；基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）、p-ERK、NF-κB P65 和p-NF-κB P65 單克隆抗體均購(gòu)自Abcam 公司；RIPA 裂解液、BCA 試劑盒均購(gòu)自上海碧云天公司。

1.1.3 主要儀器 Perkin Elmer XElx800 型多功能酶標(biāo)檢測(cè)儀；拓赫Tissuelyser-192 多樣品組織勻漿機(jī)；日立F-7000 型熒光分光光度計(jì)；Bio-Rad mini PROTEAN蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模 將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、苦蕎黃酮提取物低、中、高劑量組，每組10 只。將動(dòng)物飼養(yǎng)在25 ℃、50%濕度、充滿聚乙烯和12 h/12 h光/暗交替的人造環(huán)境中自由飲食，7 d適應(yīng)環(huán)境。

模型組、尼莫地平組和苦蕎黃酮提取物低、中、高劑量組大鼠采用血管內(nèi)穿刺法建立SAH 模型［10］：通過腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉溶液（45 mg/kg）麻醉，成功后仰臥固定至手術(shù)板上，75%乙醇消毒頸部皮膚，做頸部正中切口，分離暴露右側(cè)頸部動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，將4-0 尼龍線頭從頸外動(dòng)脈殘端插入右頸內(nèi)動(dòng)脈，穿透大腦前、中動(dòng)脈分叉處。假手術(shù)組大鼠僅在手術(shù)操作過程中將尼龍線頭端送至右頸內(nèi)動(dòng)脈，但不刺破動(dòng)脈管壁。

麻醉復(fù)蘇2 h 后，苦蕎黃酮提取物低、中、高劑量組和尼莫地平組大鼠分別灌胃苦蕎黃酮提取物（250 mg/kg、500 mg/kg、1 000 mg/kg）和 尼 莫 地 平（0.2 mg/kg），模型組和對(duì)照組大鼠灌胃等體積生理鹽水，灌胃7 d［11-12］。

1.2.2 標(biāo)本采集 取各組大鼠尾靜脈血2 ml，4 ℃、1 000 r/min 離心20 min，取上層血清，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。末次干預(yù)后，2.5%戊巴比妥鈉溶液深度麻醉后處死大鼠，斷頭剝離大鼠大腦皮質(zhì)組織，剪取約0.5 g 于4 ℃下加入pH=7.4的PBS中充分洗滌，隨后加入蛋白裂解液，將標(biāo)本充分研成勻漿，4 ℃、1 000 r/min 離心20 min，收集上清液，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱待用。

1.2.3 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 從給藥結(jié)束24 h開始，根據(jù)大鼠活動(dòng)情況，每日按照Longa 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分［13］，0 分表示神經(jīng)功能正常；1 分為輕度神經(jīng)功能缺損，表現(xiàn)為對(duì)側(cè)前爪不能完全伸展；2 分為輕中度神經(jīng)功能缺損，行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3 分為中度神經(jīng)功能缺損，表現(xiàn)為行走時(shí)身體向?qū)?cè)傾斜；4 分為中重度神經(jīng)功能缺損，大鼠無法自發(fā)行走，意識(shí)減退；5 分為重度神經(jīng)功能缺損，大鼠發(fā)生缺血相關(guān)性死亡。

1.2.4 腦含水量測(cè)定 末次給藥后，每組采用2.5%戊巴比妥鈉溶液麻醉處死3 只大鼠，迅速低溫取腦，去除小腦、腦干和軟腦膜等組織后，稱量濕重，然后置于85 ℃烤箱烘烤至恒重，稱量干重，通過公式：腦含水量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%，計(jì)算各組大鼠腦含水量。

1.2.5 血腦屏障通透性 各組取3只大鼠，經(jīng)股靜脈注射2%伊文思藍(lán)染料（5 ml/kg），1 h后采用2.5%戊巴比妥鈉溶液麻醉處死。迅速取出大腦，60 ℃甲酰胺中浸泡24 h，搜集大腦浸出液，采用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)伊文思藍(lán)含量。

1.2.6 ELISA 檢測(cè)大鼠血清炎癥因子水平 取1.2.2 項(xiàng)下各組大鼠血清，ELISA測(cè)定血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書包被酶標(biāo)板，每孔50 μl，4 ℃靜置過夜。將包被好的酶標(biāo)板用PBS 緩沖液沖洗3 次，緩沖液封閉，每孔100 μl，37 ℃下放置30 min。封閉好的板加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)組織勻漿各3孔，每孔50 μl，室溫放置4 h，每孔加入50 μl酶標(biāo)抗體，室溫反應(yīng)1 h，加入底物鄰苯二酚胺1 滴顯色，待標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度明顯時(shí)用硫酸終止反應(yīng)，讀取490 nm下光密度值。

1.2.7 ELISA 檢測(cè)大鼠大腦皮質(zhì)組織中炎癥因子水平 取1.2.2項(xiàng)下各組大鼠大腦皮質(zhì)勻漿，ELISA檢測(cè)其中炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定，詳細(xì)方法見1.2.6。

1.2.8 大腦皮質(zhì)組織中氧化應(yīng)激水平 取1.2.2項(xiàng)下各組大鼠大腦皮質(zhì)勻漿，ELISA 檢測(cè)其中SOD、MDA 和GSH-Px 水平，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定，詳細(xì)方法見1.2.6。

1.2.9 Western blot 檢測(cè)大鼠大腦皮質(zhì)組織NF-κB/ERK 通路相關(guān)蛋白表達(dá) 取1.2.2項(xiàng)下各組大鼠大腦皮質(zhì)勻漿，離心取上清液，按照BCA 試劑盒說明書步驟測(cè)得總蛋白濃度，將各組蛋白濃度調(diào)至相同。然后取同體積蛋白樣品液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，分離蛋白，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。室溫下將膜與5%脫脂奶粉封閉孵育，獲得目的蛋白條帶，加入MMP-9、ERK、p-ERK、NF-κB P65 和p-NF-κB P65（1∶2 000）一抗4 ℃孵育過夜。洗膜，使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，洗膜，電化學(xué)發(fā)光顯像，以GAPDH 作為內(nèi)參，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)比條帶強(qiáng)弱，獲得各組蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，滿足正態(tài)分布的計(jì)量資料均以±s表示，采用單因素方差分析比較多組間差異性，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 苦蕎黃酮提取物對(duì)大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響 與模型組相比，尼莫地平組和苦蕎黃酮提取物中、高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯下降（P＜0.01）；與苦蕎黃酮提取物低劑量組大鼠相比，尼莫地平組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分（±s，分）Tab.1 Scores of neurological deficits of rats in each group （±s，score）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分（±s，分）Tab.1 Scores of neurological deficits of rats in each group （±s，score）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01.

Groups Sham operation Model Nimodipine Low-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Medium-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract High-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Scores of neurological deficits 0 3.45±0.57 0.48±0.161）2.71±0.39 1.67±0.351）0.57±0.161）

2.2 苦蕎黃酮提取物對(duì)大鼠腦含水量和血腦屏障通透性的影響 與模型組大鼠相比，尼莫地平組和苦蕎黃酮提取物中、高劑量組大鼠腦含水量和伊文思藍(lán)滲出量明顯下降（P＜0.01）；與苦蕎黃酮提取物低劑量組大鼠相比，尼莫地平組大鼠腦含水量和伊文思藍(lán)滲出量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠腦含水量和血腦屏障通透性比較（±s）Tab.2 Comparison on water content of brain and permeability of blood-brain barrier of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠腦含水量和血腦屏障通透性比較（±s）Tab.2 Comparison on water content of brain and permeability of blood-brain barrier of rats in each group（±s）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01.

Groups Water content of brain/%Sham operation Model Nimodipine Low-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Medium-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract High-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract 69.42±1.77 77.73±2.75 72.08±1.771）Exudation volume of Evans blue dye/（ng·mg-1）3.13±0.56 15.03±2.42 4.78±0.861）76.95±2.25 11.45±1.94 74.07±1.981）8.39±1.701）72.57±1.641）4.88±0.921）

2.3 苦蕎黃酮提取物對(duì)大鼠血清炎癥因子水平的影響 ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型組相比，苦蕎黃酮提取物中、高劑量組和尼莫地平組大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平明顯降低（P＜0.01）；與苦蕎黃酮提取物低劑量組大鼠相比，尼莫地平組大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 苦蕎黃酮提取物對(duì)大鼠血清炎癥因子水平的影響（±s，pg/ml）Tab.3 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on levels of serum inflammatory factors of rats（±s，pg/ml）

表3 苦蕎黃酮提取物對(duì)大鼠血清炎癥因子水平的影響（±s，pg/ml）Tab.3 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on levels of serum inflammatory factors of rats（±s，pg/ml）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01.

Groups Sham operation Model Nimodipine Low-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Medium-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract High-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract TNF-α 42.37±4.21 109.02±9.02 46.82±3.941）IL-6 31.20±3.60 78.67±6.39 40.51±3.701）IL-1β 21.93±2.97 55.49±5.93 30.18±2.891）89.64±7.86 65.39±6.29 49.12±5.41 66.25±5.981）53.06±4.701）41.17±5.631）47.67±4.891）41.40±3.611）31.82±4.461）

2.4 苦蕎黃酮提取物對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)組織中炎癥因子水平的影響 ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型組相比，苦蕎黃酮提取物中、高劑量組和尼莫地平組大鼠大腦皮質(zhì)組織中TNF-α、IL-6和IL-1β 水平明顯降低（P＜0.01）；與苦蕎黃酮提取物低劑量組大鼠相比，尼莫地平組大鼠大腦皮質(zhì)組織中TNF-α、IL-6 和IL-1β水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 苦蕎黃酮提取物對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)組織中炎癥因子水平的影響（±s，pg/ml）Tab.4 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on levels of inflammatory factors in brain cortex of rats （±s，pg/ml）

表4 苦蕎黃酮提取物對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)組織中炎癥因子水平的影響（±s，pg/ml）Tab.4 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on levels of inflammatory factors in brain cortex of rats （±s，pg/ml）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01.

Groups Sham operation Model TNF-α 6.57±1.43 22.01±2.77 IL-6 15.88±2.81 54.59±5.84 IL-1β 13.71±2.44 39.76±5.11 Nimodipine 7.60±1.781）27.89±3.571）15.70±2.741）Low-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Medium-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract High-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract 17.38±2.55 44.61±3.98 31.62±4.36 12.51±1.661）37.26±3.511）25.72±3.981）8.01±2.341）28.50±3.731）16.86±2.901）

2.5 苦蕎黃酮提取物對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)組織中氧化應(yīng)激水平的影響 ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，與模型組相比，苦蕎黃酮提取物低、中、高劑量組和尼莫地平組大鼠大腦皮質(zhì)組織中SOD 和GSH-Px 水平明顯升高，MDA水平明顯降低（P＜0.01）。見表5。

表5 苦蕎黃酮提取物對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)組織中氧化應(yīng)激水平的影響（±s）Tab.5 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on oxidative stress level in brain cortex of rats （±s）

表5 苦蕎黃酮提取物對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)組織中氧化應(yīng)激水平的影響（±s）Tab.5 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on oxidative stress level in brain cortex of rats （±s）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01.

Groups Sham operation Model SOD/（U·mg-1）112.57±2.33 61.35±1.44 MDA/（nmol·L-1）28.60±3.01 70.69±5.80 GSH-Px/（U·L-1）92.08±6.34 50.18±5.62 Nimodipine 104.81±2.531）31.06±3.101）82.60±8.231）Low-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Medium-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract High-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract 78.22±2.171）62.74±5.281）53.67±6.201）84.76±1.561）47.33±4.691）62.46±6.881）98.40±2.371）34.88±3.781）73.04±7.701）

2.6 苦蕎黃酮提取物對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)組織NF-κB/ERK 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖1、表6 所示，與模型組相比，苦蕎黃酮提取物中、高劑量組和尼莫地平組大鼠大腦皮質(zhì)組織中MMP-9、p-ERK/ERK和p-NF-κB P65/NF-κB P65 水平均明顯降低（P＜0.01）；與苦蕎黃酮提取物低劑量組大鼠相比，尼莫地平組大鼠大腦皮質(zhì)組織中MMP-9、p-ERK/ERK 和p-NF-κB P65/NF-κB P65 水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 Western blot 檢測(cè)大鼠大腦皮質(zhì)組織NF-κB/ERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.1 Expressions of NF-κB/ERK pathway related proteins in brain cortex of rats detected by Western blot

表6 苦蕎黃酮提取物對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)組織NF-κB/ERK 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）Tab.6 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on expressions of NF-κB/ERK pathway related proteins in brain cortex of rats （±s）

表6 苦蕎黃酮提取物對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)組織NF-κB/ERK 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）Tab.6 Effects of fagopyrum tataricum flavonoids extract on expressions of NF-κB/ERK pathway related proteins in brain cortex of rats （±s）

Note：Compared with model group， 1）P＜0.01.

Groups MMP-9 p-ERK/ERK Sham operation Model Nimodipine Low-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract Medium-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract High-dose fagopyrum tataricum flavonoids extract 0.22±0.04 1.36±0.19 0.34±0.061）0.16±0.05 0.79±0.15 0.23±0.051）p-NF-κB P65/NF-κB P65 0.04±0.01 0.38±0.04 0.08±0.041）1.22±0.13 0.60±0.10 0.35±0.05 0.63±0.101）0.45±0.101）0.21±0.041）0.34±0.051）0.24±0.051）0.11±0.041）

3 討論

SAH 是常見的腦部血管急癥，其起病迅速，致死致殘率高，常引起顱內(nèi)壓升高、血腦屏障受損、腦水腫等腦部損傷［14］。臨床研究表明，尼莫地平在腦血管舒張作用方面具有較強(qiáng)的生物學(xué)活性，能夠通過血腦屏障進(jìn)入腦組織發(fā)揮增加腦組織供血量、改善腦缺氧和修復(fù)受損腦神經(jīng)等作用，使用尼莫地平治療SAH 患者也在臨床上取得了良好成效［15］。通過對(duì)比尼莫地平和苦蕎黃酮提取物對(duì)SAH 大鼠的治療效果及對(duì)ERK/NF-κB 信號(hào)通路的抑制作用，一定程度上能夠評(píng)估苦蕎黃酮提取物的臨床效應(yīng)和調(diào)控SAH 大鼠腦組織神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激的作用機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，尼莫地平組和苦蕎黃酮提取物中、高劑量組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦含水量和伊文思藍(lán)滲出量明顯下降。提示適宜濃度的苦蕎黃酮提取物能夠促進(jìn)SAH 大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，減輕腦水腫，修復(fù)血腦屏障，并顯示出劑量依賴性。

本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，苦蕎黃酮提取物中、高劑量組和尼莫地平組大鼠血清及大腦皮質(zhì)組織中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平均明顯下降，且隨劑量升高作用增強(qiáng)。說明中、高劑量苦蕎黃酮提取物能夠有效降低炎癥因子水平，SAH 所致的腦損傷的主要致病機(jī)制為蛛網(wǎng)膜下腔涌入大量血液，反應(yīng)生成大量ROS，誘導(dǎo)TNF-α、IL-6 和IL-1β 等炎癥因子過表達(dá)，這類炎癥因子產(chǎn)生的趨化作用能夠介導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移和血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，炎癥細(xì)胞向出血部位遷移，促使神經(jīng)炎癥發(fā)生發(fā)展［16-17］。因此，苦蕎黃酮提取物能夠通過抑制SAH 引發(fā)的炎癥，發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)的治療效果。此外，大量ROS引發(fā)脂質(zhì)過氧化和DNA損傷，最終導(dǎo)致腦水腫和腦神經(jīng)細(xì)胞死亡，同時(shí)自由基通過改變血管通透性，進(jìn)一步損傷腦組織，是SAH 早期腦損傷的另一重要致病因素［18］。SOD 將超氧化物自由基轉(zhuǎn)化為H2O2，從而保護(hù)細(xì)胞不受氧自由基損傷，MDA 則是脂質(zhì)過氧反應(yīng)的終產(chǎn)物，可與核酸等大分子化合物交聯(lián)，影響線粒體活性，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，二者常用作反映氧化損傷的指標(biāo)。GSH-Px 能夠?qū)⒂卸镜倪^氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時(shí)促進(jìn)H2O2分解，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能不受過氧化物的干擾及損害，其水平越高說明體內(nèi)氧化應(yīng)激水平越低，細(xì)胞功能越完善。既往研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機(jī)體氧化和抗氧化穩(wěn)態(tài)失衡后，會(huì)形成氧化應(yīng)激狀態(tài)，產(chǎn)生過量ROS 分子，造成細(xì)胞凋亡［19］。本研究結(jié)果顯示，苦蕎黃酮提取物低、中、高劑量組和尼莫地平組大鼠大腦皮質(zhì)組織中SOD 和GSH-Px 水平較模型組明顯上升，MDA 水平明顯下降。說明苦蕎黃酮提取物能夠通過調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激水平，中斷SAH 引起的腦細(xì)胞損傷的快速級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，修復(fù)SAH患者早期腦損傷。

SAH 發(fā)生后，ERK 信號(hào)被激活發(fā)生磷酸化，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、免疫炎癥反應(yīng)等病理生理過程。既往研究表明，氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子和組織出血均能夠激活NF-κB 信號(hào)通路，使之磷酸化，并由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核，迅速調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和MMP-9 等下游蛋白水平，產(chǎn)生過度炎癥反應(yīng)，引起組織和細(xì)胞損傷，抑制NF-κB 長(zhǎng)久以來一直是研究新型抗炎藥物的風(fēng)向標(biāo)，通過抑制ERK 和NF-κB 信號(hào)通路，能夠抑制腦組織中炎癥水平，從而減輕腦損傷［20-21］。Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，苦蕎黃酮提取物中、高劑量組大鼠大腦皮質(zhì)組織中MMP-9、p-ERK/ERK 和p-NF-κB P65/NF-κB P65 水平均明顯低于模型組。說明苦蕎黃酮提取物可有效抑制ERK/NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)，通過抑制ERK/NF-κB 信號(hào)通路可調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥水平，修復(fù)腦損傷，發(fā)揮神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用。

綜上所述，苦蕎黃酮提取物通過抑制ERK/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步抑制腦組織神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，減輕SAH 早期腦損傷癥狀。該研究能夠?yàn)殛U明苦蕎黃酮提取物治療SAH 早期腦損傷的作用機(jī)制提供理論支持，將為臨床診斷治療SAH提供新思路。