乳酸調(diào)控小鼠巨噬細(xì)胞M2型極化的關(guān)鍵靶點(diǎn)分子篩選①

楊穎穎 黃 瑾 劉新宇 邱 煒 （貴州醫(yī)科大學(xué)生物與工程學(xué)院， 貴陽 550000）

巨噬細(xì)胞是特異性及非特異性免疫的重要參與者，具有抗原提呈、維持組織穩(wěn)態(tài)、吞噬及降解等功能。在不同條件刺激下，巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)出不同的表型，發(fā)揮的功能也不同，被稱為巨噬細(xì)胞的極化［1］。根據(jù)激活條件的不同，將其分為經(jīng)典途徑激活的M1 型和替代途徑激活的M2 型［2］。M1 型巨噬細(xì)胞可由IFN-γ 及LPS 誘導(dǎo)活化，高表達(dá)CD86、CD11c 等標(biāo)志分子，分泌大量IL-12、iNOS、TNF-α 等細(xì)胞因子，但分泌IL-10 較少，具有促進(jìn)炎癥發(fā)生、抗腫瘤等功能；M2 型巨噬細(xì)胞可由IL-4 及IL-13 等細(xì)胞因子誘導(dǎo)活化，高表達(dá)Arg-1 等標(biāo)志分子，分泌大量IL-10、HIF-1、VEGF 等細(xì)胞因子，但分泌IL-12較少，具有促進(jìn)損傷修復(fù)及腫瘤形成等功能［3-4］。存在于腫瘤組織中的巨噬細(xì)胞，即腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAM），是腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中數(shù)量最多的免疫細(xì)胞［5］。近年來，已有大量研究證明，TAM主要表現(xiàn)為M2 型巨噬細(xì)胞的特點(diǎn)，且有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成及免疫逃逸等作用［6-7］。

生理?xiàng)l件下，人體大多數(shù)組織的pH 穩(wěn)定在7.35～7.45。對(duì)多種惡性實(shí)體腫瘤的研究表明，大部分TME pH 波動(dòng)在6.4～7.0，最低可至5.6［8-9］。代謝過程中乳酸的大量堆積被認(rèn)為是TME 呈酸性的最主要原因。在正常生理?xiàng)l件下，乳酸濃度為1.5～3.0 mmol/L，在大部分實(shí)體腫瘤的TME中，乳酸濃度為10～20 mmol/L，少部分可達(dá)到30 mmol/L［10］。乳酸的來源為“Warburg 效應(yīng)”，即無論氧氣充足與否，腫瘤細(xì)胞都傾向于有氧糖酵解作為主要的能量代謝途徑［11］。通過有氧糖酵解，葡萄糖被轉(zhuǎn)化為大量的乳酸。谷氨酰胺分解途徑，作為人體含量最多的氨基酸，谷氨酰胺常被腫瘤細(xì)胞攝取從而釋放能量，在這個(gè)過程中，乳酸作為副產(chǎn)物被大量堆積［12］。已有大量研究證實(shí)，TME 中的乳酸亦能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的形成、血管生成及免疫逃逸［13］。然而，關(guān)于乳酸與TAM 之間相互作用的研究還比較少，相互作用機(jī)制還不甚明確，本研究將以此為出發(fā)點(diǎn)展開。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是個(gè)極其復(fù)雜且漫長的過程，其產(chǎn)生的具體機(jī)制尚未研究清楚，缺乏特效藥物。VEGF、HIF-1 等細(xì)胞因子均能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展［14-15］。近年來，隨著貝伐珠單抗、雷莫蘆單抗等針對(duì)VEGF 受體的靶向藥物及帕博麗珠單抗等免疫治療藥物的問世，腫瘤患者的生存率得到了明顯提高，惡性腫瘤治療進(jìn)入了“免疫治療”時(shí)代。但巨噬細(xì)胞相關(guān)的免疫治療藥物還是空白。因此本研究篩選乳酸調(diào)控小鼠腹腔巨噬細(xì)胞M2 型極化的關(guān)鍵靶點(diǎn)分子，為巨噬細(xì)胞相關(guān)的腫瘤免疫治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8 周齡雌性C57 小鼠（Mus musculus）購自貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，已通過動(dòng)物倫理審批（審批號(hào)：2000269）。Trizol RNA 分離試劑、Lipo3000（美國Thermo Fisher 公司）；流式抗體（美國BD公司）；TB Green試劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本寶生物公司）；FBS、OPTI-MEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；Deionized Water 及BSA、可溶淀粉、Cell Counting Kit 8、PBS（北京索萊寶科技有限公司）；ELISA試劑盒（上海愛必信公司）；CO2培養(yǎng)箱、QuantStudio3 qPCR 儀（美國Thermo Fisher 公司）；流式細(xì)胞儀（美國艾森公司）；F-4600 熒光分光光度計(jì)（日本Hitachi公司）；精密酸度計(jì)（上海大普儀器有限公司）；倒置顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離及處理 將30 只C57 小鼠隨機(jī)分為3 組，每組10 只分開提取腹腔巨噬細(xì)胞。提取細(xì)胞前3 d 給每只小鼠腹腔注射含5%淀粉的生理鹽水0.5 ml，1 次/d。第3 天使其麻醉后引頸處死小鼠。75%乙醇消毒小鼠后，用RPMI1640 對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔灌洗并將灌洗液收集在50 ml 離心管中，800 r/min 離心5 min，棄上清液，得到細(xì)胞沉淀。配制含10%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，平鋪于6 孔板內(nèi)，放入含5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，2 h后換液，去除未貼壁的細(xì)胞，即得到小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。將純化后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分為2 個(gè)組，分別加入下列培養(yǎng)基：RPMI1640 完全培養(yǎng)基（對(duì)照）；將1 mmol/L 乳酸加至RPMI1640 培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基中乳酸的終濃度為20 mmol/L。各組處理24 h后收集細(xì)胞。

1.2.2 腹腔巨噬細(xì)胞的消化及活力檢測 吸棄上清，加入適量的Ⅳ型膠原酶，放入37 ℃含有5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中15 min，收集細(xì)胞懸液，800 r/min離心5 min棄上清，PBS漂洗后用完全培養(yǎng)基重懸。收集細(xì)胞至96 孔板中，每孔加入100 μl 的細(xì)胞懸液。每組做3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)；處理24 h后吸棄培養(yǎng)基，向每個(gè)孔中加入CCK-8 溶液10 μl；將培養(yǎng)板放入37 ℃含有5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h；用酶標(biāo)儀檢測出每個(gè)孔在450 nm處的吸光度。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)鑒定巨噬細(xì)胞 消化、收集細(xì)胞至1.5 ml離心管，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/100 μl，900 r/min 離心5 min，PBS 漂洗細(xì)胞，800 r/min 離心5 min，棄上清；1%BSA 重懸細(xì)胞，加入適量熒光標(biāo)記抗體的染色緩沖液，冰上孵育20 min。PBS 漂洗細(xì)胞，800 r/min 離心5 min，300 μl PBS 重懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀讀取數(shù)據(jù)。

1.2.4 qPCR 法檢測VEGF、HIF-1、Arg-1等基因轉(zhuǎn)錄水平變化 Trizol 法提取兩組細(xì)胞的總RNA，采用TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑按說明書合成cDNA，-20 ℃保存待用。采用TaKaRa TB Green Premix Ex Taq Ⅱ檢 測 巨 噬 細(xì) 胞VEGF、HIF-1、Arg-1、IL-10等表達(dá)。反應(yīng)體系總體積10 μl，其 中 包 括TB Green 5 μl、正 反 向 引 物 各0.4 μl、RNase Free dH2O 3.2 μl、cDNA 1 μl。擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 30 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)； 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 h，95 ℃ 1 s，Tm 56 ℃。引物序列見表1。反應(yīng)結(jié)束后，以β-actin 為參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences of qPCR

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析及qPCR 驗(yàn)證 用Trizol 法提取各組細(xì)胞的總RNA。隨后通過Agilent 2100 bioanalyzer 精確檢測RNA 完整性，確定合格后得到后期轉(zhuǎn)錄組測序使用的totalRNA。以片段化的mRNA為模板，隨機(jī)寡核苷酸為引物，在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成cDNA 第一條鏈。由dUTP 取代dNTPs中的dTTP，USER 酶降解含U 的cDNA 第二條鏈后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并獲得文庫。庫檢合格后，把不同文庫按照濃度及數(shù)據(jù)量的需求pooling 后進(jìn)行Illumina測序。上述得到的單鏈環(huán)狀DNA 文庫即為Raw reads，隨后對(duì)其進(jìn)行質(zhì)控，利用HISAT2 軟件將質(zhì)控后的clean reads 與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，獲取定位信息。利用subread 軟件中的featureCounts 工具統(tǒng)計(jì)每個(gè)基因從起始到終止范圍內(nèi)覆蓋的reads 數(shù)并進(jìn)行過濾。然后對(duì)每個(gè)樣本分別進(jìn)行基因表達(dá)水平的定量分析。應(yīng)用edgeR 軟件，按ROBINSON等［16］的方法對(duì)定量分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定義差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2（fold change）|＞1，P＜0.05。據(jù)差異倍數(shù)大小及表達(dá)量高低選擇4 個(gè)基因Tpt1、Malat1、Hes6、Slc4a7 進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證，校驗(yàn)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠性，方法同1.2.4，引物序列見表2。

表2 部分差異表達(dá)基因qPCR驗(yàn)證引物序列Tab.2 Primer sequences of some differentially expressed genes verified by qPCR

1.2.6 基因互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及關(guān)鍵差異表達(dá)基因的篩選 將篩選到的差異表達(dá)基因按數(shù)據(jù)庫編號(hào)，其與蛋白網(wǎng)絡(luò)互作數(shù)據(jù)庫進(jìn)行STRING 比對(duì)后，按照confidence score＞0.7提取得到差異表達(dá)基因互作關(guān)系。利用Cytoscape軟件將篩選出的差異表達(dá)基因構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)圖，并按照節(jié)點(diǎn)數(shù)篩選關(guān)鍵基因。

1.2.7 siRNA 轉(zhuǎn)染及驗(yàn)證 選擇蛋白互作節(jié)點(diǎn)數(shù)最多的兩個(gè)差異表達(dá)基因Malat1及Tpt1構(gòu)建siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染。收集細(xì)胞平鋪于6 孔板上，以每個(gè)視野細(xì)胞融合率在70%～80%為佳；轉(zhuǎn)染前1 h 將培養(yǎng)基更換為OPTI-MEM。采用250 μl DEPC 水稀釋目的基因siRNA（由上海吉熒生物技術(shù)有限公司合成，序列見表3），125 μl DEPC水稀釋NC siRNA。在250 μl OPTI-MEM 中加入4 μl Lipo3000，充分混勻后室溫孵育5 min，制成溶液1；在250 μl OPTI-MEM 中加入6.5 μl 上述稀釋好的siRNA，制成溶液2；將溶液1和溶液2 充分混合，室溫靜置15 min；將混合孵育好的溶液1和溶液2加入細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)，再加入1.5 mlOPTI-MEM 培養(yǎng)基，即每個(gè)孔的總液體量為2 ml。轉(zhuǎn)染6 h 后，更換為含10%血清的1640 培養(yǎng)基，24 h后收取細(xì)胞。提取一部分轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總RNA 并逆轉(zhuǎn)錄。以上述逆轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，檢測Tpt1及Malat1的表達(dá)水平，計(jì)算出轉(zhuǎn)染效率。再次處理剩余的轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，qPCR 法檢測轉(zhuǎn)染后巨噬細(xì)胞Arg-1、VEGF、CD11c等基因的相對(duì)表達(dá)量變化情況。

表3 siRNA序列Tab.3 siRNA sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism8 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s形式表示。組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 即代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GO 分析使用Metascape 軟件，KEGG 分析采用cluster Profiler R package 軟件檢驗(yàn)差異表達(dá)基因在KEGG 通路中的統(tǒng)計(jì)富集性，校正P＜0.05 被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠巨噬細(xì)胞的鑒定 F4/80 及CD11b 是鼠源巨噬細(xì)胞的標(biāo)志性表面標(biāo)志物。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，獲得的小鼠腹腔細(xì)胞表達(dá)F4/80 的陽性率為97.40%，CD11b的陽性率為93.37%（P＜0.000 1），表明已成功獲得高純度的小鼠腹腔來源巨噬細(xì)胞（圖1）。

圖1 巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物鑒定Fig.1 Identification of macrophage surface markers

2.2 乳酸對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響 結(jié)果顯示，隨著乳酸濃度增加，細(xì)胞活力也逐漸下降。在乳酸濃度為20 mmol/L 時(shí)，對(duì)細(xì)胞活力影響較小，且該濃度亦為大部分實(shí)體腫瘤TME 中的乳酸濃度。當(dāng)乳酸濃度升至40 mmol/L 時(shí)，細(xì)胞活力明顯下降，細(xì)胞大量死亡。故本實(shí)驗(yàn)選擇20 mmol/L 乳酸處理細(xì)胞（圖2）。

圖2 乳酸對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effect of lactic acid on macrophage activity

2.3 乳酸促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2 型極化 M2 型巨噬細(xì)胞高表達(dá)Arg-1，同時(shí)分泌大量IL-10、VEGF及HIF-1α。通過qPCR 法檢測Arg-1、IL-10、VEGF及HIF-1α的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，Arg-1、IL-10、VEGF及HIF-1α的表達(dá)量均上調(diào)，表明乳酸能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2型極化（圖3）。

圖3 乳酸促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M2型極化Fig.3 Lactic acid promotes M2-type polarization of macrophages

2.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

2.4.1 差異表達(dá)基因的篩選及GO 富集分析 與對(duì)照組相比，經(jīng)20 mmol/L 乳酸處理后，得到差異表達(dá)基因共6 295 個(gè)，其中上調(diào)基因2 690 個(gè)，下調(diào)基因3 605 個(gè)。GO 富集分析結(jié)果顯示，上調(diào)差異表達(dá)基因主要參與細(xì)菌防御反應(yīng)、胞質(zhì)基因翻譯、胎盤發(fā)育等生物過程；核糖體、胞質(zhì)、核糖體亞單位等細(xì)胞組分；結(jié)構(gòu)分子活性、核糖體結(jié)構(gòu)組成、受體調(diào)節(jié)活性等分子功能（圖4A）。下調(diào)差異表達(dá)基因主要參與ncRNA 代謝、加工、核糖體生物合成等生物過程；核仁、前核糖體、小亞基加工體等細(xì)胞組分；RNA 催化活性、轉(zhuǎn)移酶活性、核酸酶活性等分子功能（圖4B）。

圖4 上調(diào)差異表達(dá)和下調(diào)差異表達(dá)基因的GO分析Fig.4 GO analysis of up-regulated and down-regulated differentially expressed genes

2.4.2 差異表達(dá)基因的KEGG 富集分析 KEGG富集分析結(jié)果顯示，上調(diào)差異表達(dá)基因主要富集在核糖體（mmu03010）、癌癥通路（mmu05200）、MAPK（mmu04010）、PI3K-Akt（mmu04151）等 信 號(hào) 通 路（圖5A）。下調(diào)差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞因子受體相互作用（mmu04060）、嘌呤代謝（mmu00230）、NOD 樣受體信號(hào)通路（mmu04621）、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（mmu04650）等信號(hào)通路（圖5B）。

圖5 上調(diào)差異表達(dá)基因和下調(diào)差異表達(dá)基因的KEGG分析Fig.5 KEGG analysis of up-regulated and down-regulated differentially expressed genes

2.4.3 差異表達(dá)基因的qPCR 驗(yàn)證 根據(jù)差異倍數(shù)（|log2（fold change）|）的大小，選擇了排名靠前的上調(diào)表達(dá)基因Tpt1、Malat1和下調(diào)表達(dá)基因Hes6、Slc4a7進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證。結(jié)果顯示，4 個(gè)基因qPCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果趨勢一致（圖6）。

圖6 部分差異表達(dá)基因qPCR驗(yàn)證Fig.6 Some differentially expressed genes were verified by qPCR

2.4.4 基因互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建及關(guān)鍵差異表達(dá)基因的篩選 利用Cytoscape 軟件將篩選出的差異表達(dá)基因構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)圖（附圖1，www.immune99.com）。網(wǎng)絡(luò)圖中，與某基因相對(duì)應(yīng)的蛋白相互作用的節(jié)點(diǎn)數(shù)越多，說明該基因可能在乳酸對(duì)巨噬細(xì)胞調(diào)控過程中發(fā)揮的功能越重要。篩選出關(guān)鍵上調(diào)差異表達(dá)基因Malat1、Tpt1、FADD、Per1、Gipr等（表4）。

表4 部分上調(diào)關(guān)鍵差異表達(dá)基因Tab.4 Some key up-regulated differentially expressed genes

2.5 關(guān)鍵基因驗(yàn)證

2.5.1Tpt1和Malat1siRNA 有效片段的篩選 分別設(shè)計(jì)了2條針對(duì)小鼠Tpt1和Malat1基因的siRNA，同時(shí)采用與哺乳動(dòng)物無關(guān)的siRNA 作為陰性對(duì)照（NC），qPCR 檢測轉(zhuǎn)染24 h 后巨噬細(xì)胞內(nèi)Tpt1和Malat1的 表 達(dá)。結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn)，Tpt1siRNA-1 序 列 及Malat1siRNA-1 序列的抑制效果最明顯，抑制率分別為77%及81%（P＜0.01）。后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選取這兩個(gè)序列進(jìn)行轉(zhuǎn)染（圖7）。

圖7 Tpt1及Malat1的 siRNA對(duì)其mRNA表達(dá)的影響Fig.7 Tpt1 and Malat1 siRNA and their effect on mRNA expressions

2.5.2Tpt1及Malat1對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響 結(jié)果顯示，抑制Tpt1及Malat1基因表達(dá)并再次進(jìn)行乳酸處理后，巨噬細(xì)胞VEGF及Arg-1的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，CD11c出現(xiàn)上調(diào)，表明乳酸對(duì)巨噬細(xì)胞M2 型極化的促進(jìn)作用明顯下降（圖8、圖9）。

圖8 Tpt1對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響Fig.8 Effects of Tpt1 on polarization of macrophages

圖9 Malat1對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響Fig.9 Effects of Malat1 on polarization of macrophages

3 討論

巨噬細(xì)胞的極化受多種因素的調(diào)控，是一個(gè)動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化的過程，M1/M2 型只是人為將其極端化的兩種亞型。但實(shí)際上，巨噬細(xì)胞的亞型分類眾多，并不局限于M1 和M2。目前，比較公認(rèn)的是高表達(dá)CD11c 和IL-12 者 鑒 定 為M1 型；高 表 達(dá)Arg-1、VEGF、HIF-1 及IL-10 者鑒定為M2 型［17］。因此，通過qPCR 實(shí)驗(yàn)檢測CD11c、Arg-1、VEGF、HIF-1等基因相對(duì)表達(dá)量的變化來評(píng)估乳酸對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。結(jié)果表明，20 mmol/L乳酸能上調(diào)巨噬細(xì)胞Arg-1、VEGF、HIF-1、IL-10等基因的表達(dá)，說明乳酸能促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞M2型極化。

通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析了乳酸對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的影響，篩選出差異表達(dá)基因共6 295 個(gè)，其中上調(diào)基因2 690 個(gè)，下調(diào)基因3 605 個(gè)。GO 分析結(jié)果顯示，上調(diào)差異表達(dá)基因主要參與細(xì)菌防御反應(yīng)、胞質(zhì)基因翻譯、結(jié)構(gòu)分子活性、核糖體結(jié)構(gòu)組成等。下調(diào)差異表達(dá)基因主要參與ncRNA 代謝、核糖體生物合成、核酸酶活性等。通過KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)差異表達(dá)基因主要涉及PI3K-Akt、癌癥通路、MAPK 等信號(hào)通路。PI3K-Akt 通路即磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶通路，該通路被激活后能促進(jìn)細(xì)胞增殖［18-19］。此外，PI3K-Akt 通路還可通過P13K/Akt/mTOR 途徑調(diào)節(jié)VEGF 蛋白合成，促進(jìn)腫瘤血管生成［18，20］。而癌癥通路的激活能直接促進(jìn)癌細(xì)胞的形成、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，在惡性腫瘤形成及發(fā)展過程中有不可或缺的作用。MAPK 即絲裂原活化蛋白激酶，參與細(xì)胞有絲分裂、增殖及凋亡［21］。MAPK 的激活，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖。同時(shí)，通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MOL/LPs）和聚焦黏附激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）的表達(dá)和活化，MAPK 參與了腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移［22-23］。以上均說明乳酸能促進(jìn)巨噬細(xì)胞中腫瘤相關(guān)通路的激活并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。下調(diào)差異表達(dá)基因主要涉及NOD 樣受體、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性等信號(hào)通路。NOD 樣受體是參與天然免疫的一種特殊模式識(shí)別受體，可被巨噬細(xì)胞識(shí)別并呈遞給其他免疫細(xì)胞，啟動(dòng)免疫應(yīng)答［24］。自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，即ADCC 作用，通過自然殺傷細(xì)胞與癌細(xì)胞IgG的Fc部分結(jié)合，可殺滅癌細(xì)胞［25］。在乳酸微環(huán)境中，巨噬細(xì)胞的NOD 樣受體信號(hào)通路和ADCC、抗原呈遞功能被抑制，削弱了天然免疫應(yīng)答，機(jī)體免疫功能受損，這可能是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸的原因之一。

通過構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)圖，篩選出了Tpt1、Malat1等關(guān)鍵上調(diào)差異表達(dá)基因。Tpt1可編碼細(xì)胞質(zhì)蛋白TCTP（translationally controlled tumor protein）。通過Toll樣受體，TCTP可刺激趨化因子CXCL1（C-X-C Motif Chemokine 1）和CXCL2（C-X-C Motif Chemokine 2）的分泌以及中性粒細(xì)胞在TME 內(nèi)的聚集，從而減弱其抗腫瘤活性［26］。目前已有證據(jù)證實(shí)Tpt1 在多種腫瘤組織中過表達(dá)：在卵巢癌和宮頸癌中，Tpt1 的過表達(dá)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［27-28］；在胃癌組織中，過表達(dá)的Tpt1 可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G1/S 轉(zhuǎn)換而促進(jìn)胃癌的增殖、侵襲及遷移［29］。這說明Tpt1 與腫瘤關(guān)系密切，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要參與者與促進(jìn)者。Malat1 即肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1，是長鏈非編碼RNA 的一種，通過作用于SR 蛋白調(diào)控細(xì)胞周期從而發(fā)揮生物學(xué)作用。Malat1 在非小細(xì)胞肺癌、腎癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等組織中均呈高表達(dá)，能促進(jìn)腫瘤組織的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，敲低Malat1 的表達(dá)能夠抑制癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡［30］：在乳腺癌中，通過激活PI3K-Akt 通路，Malat1能誘導(dǎo)Her-2 陽性細(xì)胞的EMT 樣表型，提高細(xì)胞侵襲力，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［31］；在前列腺癌中，沉默Malat1 能使前列腺癌細(xì)胞恢復(fù)正常細(xì)胞的糖酵解表型，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的清除［32-33］。作為最早被發(fā)現(xiàn)的長鏈非編碼RNA，Malat1 作為腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)劑的作用是明確的。通過轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，分別驗(yàn)證了Tpt1及Malat1表達(dá)被抑制后，乳酸能下調(diào)巨噬細(xì)胞VEGF、Arg-1表達(dá)，上調(diào)CD11c表達(dá)，這說明乳酸可能通過上調(diào)巨噬細(xì)胞Tpt1及Malat1表達(dá)從而促進(jìn)其M2型極化。

綜上所述，基因Tpt1及Malat1可能為乳酸調(diào)控小鼠巨噬細(xì)胞M2 型極化的關(guān)鍵靶點(diǎn)分子。但本實(shí)驗(yàn)僅為體外研究結(jié)果，下一步將通過構(gòu)建腫瘤動(dòng)物模型，進(jìn)一步探討乳酸微環(huán)境中Tpt1及Malat1調(diào)控小鼠巨噬細(xì)胞M2 型極化的分子機(jī)制，以期為巨噬細(xì)胞相關(guān)的腫瘤免疫治療提供理論基礎(chǔ)及新思路。