LASP1基因?qū)θ私Y(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響及其機(jī)制

徐益平，尚韜

0 引言

結(jié)直腸癌（colorectal cancer, CRC）是全球常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，CRC發(fā)病率在所有腫瘤中位居第三，死亡率僅次于肺癌位居第二[1]。遠(yuǎn)處侵襲和轉(zhuǎn)移是CRC相關(guān)死亡發(fā)生的重要原因之一，盡管CRC治療手段不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的療效和預(yù)后仍不理想[2-3]。因此，開發(fā)新的分子診療手段，防治結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移，對(duì)于提高結(jié)直腸癌患者長(zhǎng)期生存和改善預(yù)后意義重大。上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）指上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)表型的細(xì)胞重編程過(guò)程，在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。LIM和SH3蛋白1（LASP1）是CRC發(fā)展過(guò)程中一種轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白，可通過(guò)介導(dǎo)EMT、誘導(dǎo)癌細(xì)胞侵襲性表型影響結(jié)直腸癌進(jìn)展[4]。粘附斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）/蛋白激酶B（AKT）可介導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲能力[5]。研究報(bào)道LASP1可通過(guò)誘導(dǎo)FAK/AKT信號(hào)通路促進(jìn)非小肺細(xì)胞癌的增殖和侵襲能力[6]。LASP1能否通過(guò)FAK/AKT信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移還未明確。本研究擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探究LASP1介導(dǎo)FAK/AKT在結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲中的作用，以期完善CRC轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，為其防治帶來(lái)新辦法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

LOVO人結(jié)腸癌細(xì)胞（賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司，iCell-h126）；pCMV6-ddk-myc、pCMV6-ddk-myc-LASP1、LASP1-siRNA、NC-siRNA（上海吉瑪公司合成提供）；Lipofectamine 3000 試劑（美國(guó)Invitrogen抗體公司，L3000-008）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone試劑公司， SH30243.01）；Transwell小室、Basement Membrane Matrix基質(zhì)膠（美國(guó)康寧試劑公司， 3422、356234）；BCA蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技公司， pc0020）；FAK、p-FAK、AKT、p-AKT蛋白抗體（美國(guó)Affinity抗體公司，AF6397、AF3398、AF6261、AF0016）；LASP1蛋白抗體（美國(guó)Abcam抗體公司，ab117806）；RIPA裂解液、Tunel細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物公司，P0013D、C1090）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（江蘇康為世紀(jì)生物公司，CW2569）；MTT試劑盒、總RNA提取試劑TRIzol（生工生物工程（上海）公司，E606334-0500、B511311）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

BB150細(xì)胞培養(yǎng)箱、Micro17R低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；610020-9Q化學(xué)發(fā)光儀（中國(guó)上海勤翔儀器公司）；CMaxPlus酶標(biāo)儀（美國(guó)MD公司）；CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)BIO RAD公司）。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

LOVO細(xì)胞使用含10%胎牛血清、1%的青霉素改良的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用Lipofectamine 3000試劑將pCMV6-ddk-myc（空白質(zhì)粒）、pCMV6-ddk-myc-LASP1（LASP1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒）、NC-siRNA（sc-37007）（空白沉默質(zhì)粒）、LASP1-siRNA（sc-105607）（LASP1沉默質(zhì)粒）轉(zhuǎn)染至LOVO細(xì)胞，并根據(jù)轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒進(jìn)行相應(yīng)分組，分別為pCMV6-NC組、pCMV6-LASP1組、NC-siRNA組、LASP1-siRNA組。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)LASP1基因表達(dá)

提取各組細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)LASP1表達(dá)。反應(yīng)條件為變性95℃ 10 min，擴(kuò)增反應(yīng)，95℃ 15 s，60℃ 60 s，40次，溶解曲線，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。采用2-△△CT法對(duì)結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于平板。每孔加入10 μl MTT溶液與細(xì)胞混合，放回培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后取出。酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處吸光度值，進(jìn)行細(xì)胞存活計(jì)算。

1.6 Tunel染色

平板接種細(xì)胞后用4%多聚甲醛通透細(xì)胞。每平板細(xì)胞中加入50 μl Tunel檢測(cè)液，室溫下避光孵育1 h。PBS漂洗三次，制片、封片。熒光顯微鏡下觀察拍照并計(jì)數(shù)Tunel陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)

Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板，細(xì)胞加入上層小室，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出后，棉簽擦掉上室底層細(xì)胞。4%多聚甲醛固定下層小室細(xì)胞10 min，PBS洗3次，0.1%結(jié)晶紫染液染色計(jì)數(shù)遷移至下室中的細(xì)胞數(shù)量。30 μl Matrigel稀釋液包被Transwell小室后4℃孵育過(guò)夜，上室加入細(xì)胞，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棉簽擦掉上室底層細(xì)胞和剩余Matrigel稀釋液，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次，0.1%結(jié)晶紫染液染色計(jì)數(shù)侵襲至下室中的細(xì)胞數(shù)量。

1.8 劃痕實(shí)驗(yàn)

各組細(xì)胞接種于平板，200 μl移液器吸頭劃線創(chuàng)建傷痕，分別24、48 h觀察劃線內(nèi)細(xì)胞愈合情況，并拍照計(jì)數(shù)。

1.9 Western blot實(shí)驗(yàn)

RIPA裂解收集細(xì)胞，離心收集底部細(xì)胞沉淀。BCA法測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度，隨后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉孵育，TBST清洗。加入檢測(cè)的稀釋后的FAK、p-FAK、AKT、p-AKT、LASP1一抗抗體，4℃下?lián)u床振蕩孵育過(guò)夜。隔天室溫下振蕩30 min，將上層液體輕輕吸出，TBST清洗3遍。5%脫脂奶粉封閉液稀釋，稀釋對(duì)應(yīng)二抗抗體振蕩孵育1.5 h，TBST清洗。ECL化學(xué)發(fā)光顯影，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)含量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間數(shù)據(jù)比較采用One-way-ANOAY單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染結(jié)果鑒定

與pCMV6-NC組相比，pCMV6-LASP1組細(xì)胞LASP1mRNA表達(dá)顯著上升（P=0.002）。與NCsiRNA組比較，LASP1-siRNA組細(xì)胞LASP1mRNA表達(dá)顯著下降（P=0.001），見(jiàn)表2。結(jié)果顯示細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

表2 qRT-PCR檢測(cè)LOVO細(xì)胞轉(zhuǎn)染后LASP1的表達(dá)Table 2 LASP1 mRNA expression in transfected LOVO cells detected by qRT-PCR

2.2 LASP1對(duì)LOVO細(xì)胞增殖的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與pCMV6-NC組相比，pCMV6-LASP1組的細(xì)胞存活率顯著上升（P=0.000），與NC-siRNA組比較，LASP1-siRNA組的細(xì)胞存活率顯著下降（P=0.000），見(jiàn)表3。

表3 LASP1過(guò)表達(dá)或沉默對(duì)LOVO細(xì)胞存活的影響Table 3 Effects of overexpression or silencing of LASP1 on the survival of LOVO cells

2.3 LASP1對(duì)LOVO細(xì)胞遷移侵襲的影響

Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與pCMV6-NC組相比，pCMV6-LASP1組細(xì)胞的遷移以及侵襲數(shù)量顯著上升（分別P=0.003、P=0.000），24和48 h傷口愈合率均顯著升高（分別P=0.004、P=0.009）；與NC-siRNA組比較，LASP1-siRNA組細(xì)胞的遷移以及侵襲數(shù)量顯著下降（分別P=0.002、P=0.001）、24 h和48 h傷口愈合率均顯著降低（P=0.006、P=0.004），見(jiàn)圖1。

圖1 LASP1過(guò)表達(dá)或沉默對(duì)LOVO細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響Figure 1 Effects of LASP1 overexpression or silence on migration and invasion of LOVO cells

2.4 LASP1對(duì)LOVO細(xì)胞凋亡的影響

Tunel染色結(jié)果顯示，與pCMV6-NC組相比，pCM V 6-L A S P 1 組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P=0.003）；與NC-siRNA組比較，LASP1-siRNA組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P=0.000），見(jiàn)圖2。

圖2 LASP1過(guò)表達(dá)或沉默對(duì)LOVO細(xì)胞凋亡的影響 (Tunel染色)Figure 2 Effects of LASP1 overexpression or silence on apoptosis of LOVO Cells (Tunel staining)

2.5 LASP1對(duì)LOVO細(xì)胞LASP1、FAK/AKT通路蛋白表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與pCMV6-NC組相比，pCMV6-LASP1組細(xì)胞LASP1、p-FAK/FAK、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)顯著上升（分別P=0.002、P=0.010、P=0.004）；與NC-siRNA組比較，LASP1-siRNA組細(xì)胞LASP1、p-FAK/FAT、p-AKT/AKT蛋白表達(dá)顯著下降（分別P=0.000、P=0.005、P=0.002），見(jiàn)圖3。

圖3 LASP1過(guò)表達(dá)或沉默對(duì)LOVO細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Effects of LASP1 overexpression or silence on related protein expression in LOVO cells

3 討論

LASP1基因位于染色體17q11-21.3，屬于大肌動(dòng)蛋白結(jié)合神經(jīng)蛋白家族成員，在人體大部分組織內(nèi)低表達(dá)[7-8]。LASP1的兩端為L(zhǎng)IM和SH3結(jié)構(gòu)區(qū)域，可分別與肌動(dòng)蛋白和其他信號(hào)受體發(fā)生作用，參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲等過(guò)程[8]。LASP1在晚期結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著高于早期，可介導(dǎo)EMT促進(jìn)CRC遷移，而敲除LASP1表達(dá)可以抑制CRC的轉(zhuǎn)移侵襲[9]。而在體模型表明，LASP1過(guò)表達(dá)促進(jìn)了小鼠結(jié)直腸原位腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展[10]。本研究通過(guò)構(gòu)建LASP1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LASP1不同表達(dá)對(duì)LOVO細(xì)胞的影響，結(jié)果與朱龍海等[11]研究相符，表明LASP1基因的表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞遷移侵襲相關(guān)。

FAK為促轉(zhuǎn)移功能蛋白，磷酸化表達(dá)增加可促進(jìn)CRC細(xì)胞EMT及遷移和侵襲能力[12-13]。研究表明，F(xiàn)AK表達(dá)降低可抑制CRC細(xì)胞與胞外基質(zhì)粘連作用，進(jìn)而抑制CRC細(xì)胞遷移[14]。AKT相關(guān)通路為調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和抗凋亡的重要通路，結(jié)直腸癌出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、漿膜層浸潤(rùn)以及腫瘤低分化患者其癌組織p-AKT表達(dá)顯著升高，p-AKT表達(dá)與CRC發(fā)展、預(yù)后相關(guān)[15]。Xu等研究表明FAK蛋白與AKT蛋白可相互作用，敲減CRC細(xì)胞FAK表達(dá)可抑制p-AKT表達(dá)，從而抑制CRC細(xì)胞干細(xì)胞樣特性與轉(zhuǎn)移能力[16]。其他相關(guān)研究表明，F(xiàn)AK/AKT信號(hào)通路激活，可增強(qiáng)CRC細(xì)胞遷移、侵襲能力和EMT[5,17]。Zhou等研究結(jié)果表明LASP1可通過(guò)激活A(yù)KT促進(jìn)CRC進(jìn)展[18]。本研究結(jié)果表明，LASP1可調(diào)控CRC細(xì)胞中FAK/AKT信號(hào)通路的表達(dá)，由此推測(cè)LASP1可介導(dǎo)FAK/AKT信號(hào)通路參與CRC細(xì)胞增殖、遷移及侵襲過(guò)程。

綜上，本研究結(jié)果表明LASP1基因表達(dá)促進(jìn)了LOVO細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能，而敲減LOVO細(xì)胞LASP1表達(dá)起相反作用，LASP1介導(dǎo)FAK/AKT通路表達(dá)是其促進(jìn)CRC發(fā)展機(jī)制之一。由于本課題組條件有限，未能進(jìn)行動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究LASP1介導(dǎo)FAK/AKT表達(dá)對(duì)CRC進(jìn)展的影響。以后我們將繼續(xù)探索LASP1介導(dǎo)FAK/AKT調(diào)控CRC進(jìn)展的機(jī)制，為臨床防治CRC轉(zhuǎn)移提供新的方向。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。