隱丹參酮對(duì)人乳腺癌MCF7細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制

楊舒涵，王玉琴，劉航，夏麗潔，劉蘇穎，張英

0 引言

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的癌癥[1]。目前，乳腺癌的治療除傳統(tǒng)療法外，還可通過(guò)ER信號(hào)通路接受激素療法（內(nèi)分泌療法）[2-3]。雌激素受體（estrogen receptor, ER）是乳腺癌的分子標(biāo)志物之一，ER-α是一種在乳腺癌進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的核受體[4]，也是研究新型乳腺癌治療藥物的主要靶點(diǎn)之一[5]。雖然內(nèi)分泌療法可以大幅降低乳腺癌的復(fù)發(fā)率和死亡率，但依然約有30%的患者在經(jīng)過(guò)內(nèi)分泌療法治療后會(huì)產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，故仍需尋找更好的乳腺癌治療手段[3]。

腫瘤發(fā)生過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵事件是從靜止的原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)榍忠u性和移動(dòng)性的腫瘤。在這一過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)，導(dǎo)致腫瘤治療變得更為困難。癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancerassociated fibroblasts, CAFs）可通過(guò)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation, EMT）[6]和細(xì)胞外基質(zhì)重塑[7]，誘導(dǎo)原發(fā)部位腫瘤細(xì)胞局部侵襲，且該行為受到腫瘤轉(zhuǎn)移/抑制相關(guān)基因的調(diào)控[8]。腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells, CSCs）是一種具有更高致瘤性的腫瘤細(xì)胞[9]，在腫瘤啟動(dòng)、更新、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演重要角色[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)，由ER-α介導(dǎo)的雌激素信號(hào)可增加乳腺癌細(xì)胞系中CD24-/lowCD44+細(xì)胞群數(shù)量[12]，CD24-/lowCD44+細(xì)胞群數(shù)量在ER+乳腺癌干細(xì)胞的調(diào)節(jié)與維持有重要作用[13]。此外，PI3K/Akt信號(hào)通路[14]、腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物ABCG2[15]等都與腫瘤干細(xì)胞活性相關(guān)。本研究通過(guò)探討抑制腫瘤干細(xì)胞活性的相關(guān)通路與腫瘤干細(xì)胞遷移及侵襲的特征，為未來(lái)開(kāi)發(fā)新型抗癌藥物提供策略。

隱丹參酮（cryptotanshinone, CPT）是丹參中主要的脂溶性二萜類(lèi)醌類(lèi)化合物，分子式為C19H20O3，分子量為296.35，外觀為橙紅色針狀結(jié)晶。研究報(bào)道CPT表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性，具有很高的藥用價(jià)值。本研究以乳腺癌MCF7細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，初步探究CPT對(duì)MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人乳腺癌細(xì)胞系MCF7細(xì)胞（iCell Bioscience Inc, iCell-h129）由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)。

1.2 藥物

隱丹參酮（Cryptotanshinone, CPT），型號(hào)：B21586，購(gòu)自上海源葉生物公司。

1.3 試劑

胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）購(gòu)自美國(guó)MRC公司；青霉素-鏈霉素雙種抗體混合液100×（PS）和胰蛋白酶均購(gòu)自北京全式金公司；磷酸鹽緩沖液（PBS, pH=7.2）購(gòu)自武漢普諾賽公司；順鉑（cisplatin）、噻唑藍(lán)（thiazolyl blue tetrazolium bromide, MTT）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）、重組人胰島素和二甲基亞砜（DMSO）均購(gòu)自上海源葉公司；MEM培養(yǎng)基、Fx CycleTMPI/RNase染液、B27和KnockOutTM血清代替物均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒、Hoechst 33258、RIPA裂解液、PI3K-p85兔多抗、Akt1/2/3兔單抗、β-actin兔單抗、Bcl2兔多抗、Bax兔多抗、山羊抗兔IgG（H+L）、BCA蛋白定量試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自上海碧云天公司；ER-α兔單抗、p-ER-α（phospho S118 ER-α）兔單抗、ABCG2兔單抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司SOX2兔多抗、OCT4兔多抗和Nanog兔多抗均購(gòu)自武漢ABclonal公司；Twist兔多抗和N-Cadherin兔多抗均購(gòu)自上海Absin公司；E-Cadherin兔單抗和Snail兔單抗均購(gòu)自美國(guó)CST公司；PE鼠抗人CD24、APC鼠抗人CD44、β-成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（β-FGF）和重組表皮生長(zhǎng)因子（EGF）均購(gòu)自美國(guó)BD公司；4%多聚甲醛購(gòu)自上海生工公司；0.1%結(jié)晶紫染液購(gòu)自北京索萊寶公司；活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翌圣生物公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Nest公司；Matrigel購(gòu)自美國(guó)Corning公司；超低吸附性6孔板（αplus）、無(wú)水乙醇、冰乙酸和吐溫-20均購(gòu)自連云港鑫伯特公司。

1.4 儀器

流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)ChemiDoc公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自日本Epoch公司；研究級(jí)熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

MCF7細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于50 ml/L CO2、37℃飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基，待其細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，消化計(jì)數(shù)后接種于96孔板中，以每微升60個(gè)細(xì)胞的密度進(jìn)行試驗(yàn)，在細(xì)胞完全黏附后，用不同的藥劑濃度進(jìn)行干預(yù)，并設(shè)定未處理的對(duì)照組（Untreated）、陰性對(duì)照組（DMSO）和DDP組，每組實(shí)驗(yàn)各重復(fù)6次，24 h后，以1 000 r/min速度離心5min， 除去上清液。加入MTT溶液，在37℃條件下，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，1 000 r/min離心5 min后除去上清液，加入二甲基亞砜（DMSO），室溫下振蕩5 min，490 nm酶標(biāo)儀下測(cè)定吸光度值（A）。以未處理組細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)，其他孔的A值與其相比即為該處理組的細(xì)胞存活率，繪制生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞殺傷率（%）=（1-細(xì)胞存活率）×100%。

1.6 Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞以2 ml的容積和1.2×105個(gè)/孔的密度接種于60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞完全貼壁后，以不同濃度CPT（5、15和25 μmol/L）干預(yù)24 h后，收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后用PBS洗滌2次。加入binding buffer和Annexin V-FITC/PI染液重懸細(xì)胞，混勻后置于暗室染色20 min，加binding buffer稀釋細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)lowJo軟件分析結(jié)果。

1.7 Hoechst 33258熒光染色實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞以2 ml的容積和1.2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，以不同濃度CPT（5、15和25 μmol/L）干預(yù)24 h。棄上清液，4%多聚甲醛4℃固定15 min；吸去多聚甲醛溶液，PBS清洗兩次，加入Hoechst 33258染色液，染色液覆蓋孔底，避光染色20 min；PBS清洗2次，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞核形態(tài)，以確定細(xì)胞凋亡程度。

1.8 細(xì)胞周期檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞以1.2×105個(gè)/孔的密度接種于60 mm培養(yǎng)皿中。以不同濃度CPT（5、15和25 μmol/L）干預(yù)24 h后，收集細(xì)胞，清洗2次，于4℃下加入70% 乙醇過(guò)夜固定細(xì)胞，清洗2次，300 μl Fx CycleTMPI/RNase染液重懸細(xì)胞，室溫條件下染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)lowJo軟件分析檢測(cè)結(jié)果。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧 ROS

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF7細(xì)胞，以1.2×105個(gè)/孔的密度接種于60 mm培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至完全貼壁，棄舊培養(yǎng)基后以不同濃度CPT（5、15和25 μmol/L）處理后收集細(xì)胞。去除舊培養(yǎng)基，原位裝載探針，DCFH-DA以無(wú)血清培養(yǎng)基1:1 000稀釋后覆蓋細(xì)胞，于37℃條件下孵育20 min。用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。細(xì)胞收集后懸浮于DCFH-DA 稀釋溶液中，37℃孵育20 min，收集細(xì)胞后轉(zhuǎn)載探針，洗滌細(xì)胞后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

1.10 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞以1.2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，細(xì)胞長(zhǎng)至80%或更高時(shí)，用200 μl槍頭劃痕，用PBS輕輕洗滌，并拍照記錄（0 h），加入不同濃度CPT（5、15和25 μmol/L）干預(yù)24～48 h，拍照記錄。Image J軟件劃痕面積分析模塊得到愈合面積。

1.11 細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞完全貼壁后，分組同1.6，藥物干預(yù)細(xì)胞24 h后，更換無(wú)血清培養(yǎng)基，收集細(xì)胞，在Transwell小室上部加入150 μl約1×104個(gè)細(xì)胞，下部每孔加入500 μl含有50%FBS的培養(yǎng)基，置于37℃下繼續(xù)培養(yǎng)36 h。將上室清洗2次后，加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞，后加入0.1%結(jié)晶紫染液染色，用棉簽將上室內(nèi)部細(xì)胞擦除，拍照記錄。用33%冰乙酸將小室薄膜上的細(xì)胞洗脫收集，用酶標(biāo)儀測(cè)量570 nm處的吸光值。侵襲實(shí)驗(yàn)中，取80 μl matrigel膠鋪于Transwell小室上部，4 h后基質(zhì)膠與小室形成基底膜，之后操作同上述遷移實(shí)驗(yàn)，接種細(xì)胞并培養(yǎng)72 h后，固定，染色，拍照，測(cè)量A值。

1.12 微球體培養(yǎng)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)微球體表面分子CD44與CD24

將乳腺癌MCF7細(xì)胞接種于超低吸附性6孔板，用無(wú)血清培養(yǎng)基 （10 ng/ml β-FGF、20 ng/ml EGF、1:50 B27、5 μg/ml胰島素、0.4% BSA、2% Knock-Out?血清代替物及1%雙抗）連續(xù)懸浮培養(yǎng)3代后，以不同濃度CPT（5、15和25 μmol/L） 處理24 h后收集細(xì)胞，每組加入PE-CD24與APC-CD44染液各1 μl，置于冰上孵育30～60 min，避光。每管加入2～3 ml PBS，混勻后1 000 r/min離心5 min，PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)微球體表面分子CD44與CD24表達(dá)情況，F(xiàn)lowJo軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.13 Western blot檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)

通過(guò)Western blot檢測(cè)Bcl2、Bax、β-actin、N-cadherin、Twist1、E-cadherin、snail、ER-α、p-ER-α、PI3K、Akt、ABCG2、Nanog、Sox2、Oct等蛋白的表達(dá)變化。細(xì)胞以1.2×105個(gè)/孔的密度接種于60 mm培養(yǎng)皿中，完全貼壁后, 棄去舊培養(yǎng)基，以不同濃度CPT（5、15和25 μmol/L）處理24 h后收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，加RAPI裂解液裂解細(xì)胞，每5 min于漩渦振蕩器上振蕩20 s。孵育結(jié)束后，12 000 r/min低溫離心20 min，收集蛋白進(jìn)行定量。蛋白樣品經(jīng)電泳分離后，轉(zhuǎn)膜，封閉，PBST清洗3次，一抗過(guò)夜孵育，PBST清洗3次，加入相應(yīng)二抗，37℃孵育1 h，再經(jīng)PBST清洗后，置于暗室內(nèi)使用ECL溶液染色1 min，通過(guò)調(diào)節(jié)曝光時(shí)間來(lái)進(jìn)行顯色，利用Image J軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行圖像分析。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較時(shí)采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CPT抑制MCF7細(xì)胞的生長(zhǎng)

鏡下結(jié)果顯示：CPT干預(yù)后細(xì)胞體積萎縮，細(xì)胞間連接被破壞，喪失完整的細(xì)胞形態(tài)，見(jiàn)圖1A。MTT法結(jié)果顯示：不同濃度CPT干預(yù)MCF7細(xì)胞24 h后，CPT對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞具有顯著的生長(zhǎng)抑制能力，CPT作用24 h的半數(shù)抑制濃度（IC50）為19.24 μmol/L，細(xì)胞存活率隨著CPT濃度升高而降低，見(jiàn)圖1B。

圖1 MCF7細(xì)胞經(jīng)CPT干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)(A, ×200)與細(xì)胞活力變化(B)Figure 1 Cell morphology(A, ×200) and cell viability(B) of MCF7 cells after CPT intervention

2.2 CPT誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞凋亡

流式結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度CPT處理24 h后，MCF7凋亡率顯著上升。對(duì)照組MCF7細(xì)胞凋亡率為21.8%，在5 μmol/L、15 μmol/L和25 μmol/L CPT處理后，MCF7細(xì)胞凋亡率分別為63.37%、40.77%和52.83%。由此表明，CPT可顯著誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞凋亡（P<0.001），見(jiàn)圖2A。

圖2 CPT干預(yù)下MCF7細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的觀察：流式細(xì)胞術(shù)(A)、Western blot(B)及hoechst 33258染色(C, ×200)Figure 2 Apoptosis of MCF7 cells under CPT intervention observed by flow cytometry(A), Western blot(B) and hoechst 33258 staining(C, ×200)

Western blot結(jié)果顯示，CPT可以減少Bcl2蛋白表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Bax表達(dá)，表明CPT可誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞凋亡，這與流式結(jié)果一致，見(jiàn)圖2B。Hoechst 33258染色結(jié)果顯示：經(jīng)5 μmol/L、15 μmol/L和25 μmol/L CPT作用24 h后細(xì)胞核的形態(tài)變化，當(dāng)濃度升高時(shí)，細(xì)胞凋亡的數(shù)目增加，細(xì)胞核呈現(xiàn)濃縮而致密的藍(lán)色熒光，表現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，CPT處理濃度越高，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象越明顯，見(jiàn)圖2C。

2.3 CPT誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞周期阻滯

與對(duì)照組相比，藥物干預(yù)組均可顯著（P<0.001）減少G0/G1期的細(xì)胞比例，說(shuō)明有更多細(xì)胞進(jìn)入下S期；5 μmol/L CPT作用下，S期細(xì)胞比例由18.06%上升至54.91%；G2/M期細(xì)胞則未有顯著變化，表明CPT可將MCF7細(xì)胞周期阻滯在S期，見(jiàn)圖3。

圖3 流式細(xì)胞檢測(cè)CPT可引起MCF7細(xì)胞周期阻滯Figure 3 CPT induced cell cycle arrest in MCF7 cells detected by flow cytometry

2.4 CPT誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞ROS生成

氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡的關(guān)系已被廣泛研究，活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成的增加與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，在5 μmol/LCPT作用下，MCF7細(xì)胞的ROS水平從1.14%提升至5.36%，而25 μmol/LCPT干預(yù)下，MCF7細(xì)胞的ROS水平提升至41.2%，說(shuō)明CPT可誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞ROS生成，見(jiàn)圖4。

圖4 流式細(xì)胞檢測(cè)顯示CPT誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞ROS產(chǎn)生Figure 4 CPT induced generation of intracellular ROS in MCF7 cells detected by flow cytometry

2.5 CPT抑制MCF7細(xì)胞遷移與侵襲

2.5.1 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 對(duì)照組24 h后劃痕傷口愈合率為24.64%，5、15和25 μmol/LCPT作用24 h后，劃痕傷口愈合率分別為17.81%、0.89%和0.13%，與對(duì)照組相比，顯著降低了劃痕傷口愈合（P<0.001），見(jiàn)圖5A。

圖5 CPT對(duì)MCF7細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響Figure 5 Effect of CPT on migration and invasion abilities of MCF7 cells detected

2.5.2 Transwell遷移與侵襲實(shí)驗(yàn) Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示CPT作用24 h后具有顯著抑制腫瘤細(xì)胞遷移與侵襲的能力（P<0.001）。與對(duì)照組相比，15和25 μmol/L CPT處理MCF7細(xì)胞后，遷移率分別為55.91%和27.95%。此外，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)也表明，15 μmol/L與25 μmol/L C P T 干預(yù)后M C F 7 細(xì)胞侵襲能力被顯著抑制（P<0.001），見(jiàn)圖5B。

Western blot結(jié)果顯示5 μmol/L CPT處理MCF7細(xì)胞24 h后，可降低細(xì)胞中Snail的表達(dá)，15、25 μmol/L CPT處理MCF7細(xì)胞后，可促進(jìn)Snail的表達(dá)，見(jiàn)圖5C。

2.6 微球體培養(yǎng)及CPT減少CD24-/lowCD44+細(xì)胞群與腫瘤干細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)

微球體培養(yǎng)后，部分細(xì)胞出現(xiàn)壞死，其余細(xì)胞則成團(tuán)狀，呈現(xiàn)一種疏松的狀態(tài)，4～5天后，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了干細(xì)胞微球。顯微鏡下觀察，細(xì)胞表面呈球狀，細(xì)胞間有緊密的粘連。MCF7 細(xì)胞經(jīng)無(wú)血清培養(yǎng) 3 代后，可在體外形成穩(wěn)定的干細(xì)胞微球，并可自行再生，見(jiàn)圖6A。

圖6 MCF7細(xì)胞來(lái)源微球體培養(yǎng)(A)、微球體CD24-/low CD44+表達(dá)情況(B)及腫瘤干細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)(C)Figure 6 Culture of tumor spheres derived from MCF7 cells(A) and tumor spheres detection of CD24-/lowCD44+expression(B) and expression of cancer stem cell-related proteins(C)

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)微球體CD24-/lowCD44+細(xì)胞群數(shù)量變化結(jié)果顯示：CPT可以顯著降低CD24-/lowCD44+細(xì)胞群含量（P<0.001），與對(duì)照組相比，15 μmol/L藥物處理下可以將CD24-/lowCD44+細(xì)胞群含量由18.1%降低至3.86%，見(jiàn)圖6B。

MCF7細(xì)胞Sox2、Oct4以及Nanog等腫瘤干細(xì)胞特異性蛋白在經(jīng)過(guò)不同濃度CPT干預(yù)后結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，CPT刺激下Sox2、Oct4以及Nanog等干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)下降。提示CPT可能是通過(guò)減少腫瘤細(xì)胞干性來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用，見(jiàn)圖6C。

2.7 CPT對(duì)p-ER-α、ABCG2、PI3K-p85與Akt蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)不同藥物濃度處理后MCF7細(xì)胞ER-α、磷酸化、雌激素信號(hào)通路下游靶基因PI3K/Akt及ABCG2藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示， CPT可抑制MCF7細(xì)胞ER-α蛋白的表達(dá)與磷酸化，同時(shí)抑制ER信號(hào)通路中PI3K/Akt蛋白的表達(dá)，抑制ABCG2表達(dá)，見(jiàn)圖7。表明CPT可能是通過(guò)干擾雌激素信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖7 ER-α蛋白表達(dá)、磷酸化及下游靶蛋白表達(dá)Figure 7 ER-α protein expression and phosphorylation and downstream target protein expression

3 討論

研究表明，CPT作為丹參的有效成分之一，是一種具有神經(jīng)保護(hù)作用、抗炎、抗菌、抗腫瘤作用的二萜醌類(lèi)化合物，可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期[16]、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]、抑制遷移與侵襲[18]等方式發(fā)揮抗腫瘤作用。約30%的乳腺癌患者在原發(fā)腫瘤切除后5～10年內(nèi)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[19]。

研究發(fā)現(xiàn)CPT能夠通過(guò)促進(jìn)線粒體分裂蛋白Dro1的表達(dá)激活線粒體分裂，從而導(dǎo)致促凋亡蛋白Bax活化和下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[20]。B淋巴細(xì)胞瘤2（Bcell lymphoma 2, Bcl2）是Bcl2家族中的抗凋亡蛋白，通過(guò)阻止線粒體釋放細(xì)胞色素c而提高存活期；而B(niǎo)cl2同源基因Bax，則是一類(lèi)促凋亡蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)外膜通透性釋放細(xì)胞色素c，活化caspase通路來(lái)誘導(dǎo)凋亡。本研究結(jié)果顯示，CPT可在體外抑制乳腺癌MCF7細(xì)胞的增殖，同時(shí)上調(diào)Bax/Bcl2比值，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，CPT可以誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于S期，進(jìn)而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。

EMT是上皮細(xì)胞來(lái)源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過(guò)程，主要特征有E-cadherin蛋白的減少、N-cadherin蛋白及vimentin的增加，上皮基因（Snail, Slug）的抑制與間充質(zhì)基因（Twist1）的激活[21]。在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，Snail可以與E-Cadherin啟動(dòng)子區(qū)上的E-box結(jié)合，進(jìn)而抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄來(lái)有效誘導(dǎo)EMT。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過(guò)程中必然發(fā)生大量分子和表型變化，同時(shí)在初始階段經(jīng)歷了EMT的過(guò)程，以此增強(qiáng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移部位的細(xì)胞表達(dá)上皮標(biāo)志物（如E-Cadherin）表明這些細(xì)胞正在經(jīng)歷最后一步間充質(zhì)-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化。同時(shí)據(jù)報(bào)道，Snail表達(dá)減少的果蠅雌性卵泡干細(xì)胞（FSCs）增殖被抑制，高表達(dá)Snail則促進(jìn)其增殖[22]。Veena等的研究證明, E-Cadherin蛋白的存在是浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌在體循環(huán)和初始轉(zhuǎn)移播種期間細(xì)胞存活所必需的[23]，Yair等發(fā)現(xiàn)敲除高轉(zhuǎn)移性乳腺癌動(dòng)物模型中的 E-cadherin可以阻止細(xì)胞中系鏈形成，抑制4T1細(xì)胞浸潤(rùn)到基質(zhì)中，減少4T1細(xì)胞向肺部的轉(zhuǎn)移傳播[24]。但有研究發(fā)現(xiàn)，Snail高表達(dá)以及E-cadherin低表達(dá)時(shí)腫瘤轉(zhuǎn)移和血管浸潤(rùn)明顯增加，這表明檢測(cè)Snail和E-cadherin的不同表達(dá)情況可能有助于預(yù)測(cè)胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的血管和淋巴浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移[25]。同時(shí)，一項(xiàng)細(xì)胞遷移的體外模型顯示，表達(dá)N-cadherin蛋白的人鱗狀癌細(xì)胞可以黏附于E-cadherin蛋白陽(yáng)性的癌細(xì)胞上以形成腫瘤侵襲，并在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中充當(dāng)領(lǐng)導(dǎo)者[26]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CPT可顯著殺傷MCF7細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)與Western blot檢測(cè)CPT處理后的MCF7細(xì)胞凋亡率與凋亡分子標(biāo)志物表達(dá)的變化。 CPT干預(yù)MCF7后，發(fā)現(xiàn)CPT可抑制N-Cadherin與Twist1蛋白的表達(dá)，抑制MCF7細(xì)胞EMT過(guò)程。中、高濃度CPT還可以體外抑制MCF7細(xì)胞的遷移與侵襲，通過(guò)上調(diào)Snail表達(dá)，下調(diào)Twist1轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，抑制E-cadherin與N-cadherin，從而抑制MCF7細(xì)胞的EMT過(guò)程。而在本研究中，低濃度CPT則可抑制snail的表達(dá)，同時(shí)Twist1轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)下調(diào)，E-cadherin與N-cadherin的表達(dá)抑制，最終也起到抑制MCF7細(xì)胞EMT的作用。因此，對(duì)于CPT抑制MCF7細(xì)胞EMT的量效關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

此外，有研究表明乳腺癌干細(xì)胞與乳腺腫瘤的起始、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和進(jìn)展有關(guān), CD24-/lowCD44+是典型的腫瘤起始特征的癌細(xì)胞群，CD44與維持乳腺癌干細(xì)胞中的干細(xì)胞特異性及EMT有關(guān)，能促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[27]。Oct4是參與多功能性的基因表達(dá)的激活劑，例如Sox與Nanog，并與Sox2協(xié)同發(fā)揮激活基因轉(zhuǎn)錄作用[28]。Sox2本身作為SOXB1轉(zhuǎn)錄因子家族成員，可激活或抑制靶基因，而Sox2表達(dá)的減少可能導(dǎo)致乳腺癌干細(xì)胞的丟失[29]。Nanog的表達(dá)驅(qū)動(dòng)著多種人類(lèi)癌癥中腫瘤干細(xì)胞功能和腫瘤發(fā)生，調(diào)節(jié)實(shí)體瘤中的干性與重編程，其中包括乳腺癌[30]。在本研究中，我們采用微球體培養(yǎng)技術(shù)懸浮培養(yǎng)MCF7細(xì)胞誘導(dǎo)CD24-/lowCD44+細(xì)胞群并以藥物刺激，結(jié)果顯示經(jīng)微球體培養(yǎng)后MCF7細(xì)胞中CD24-/lowCD44+細(xì)胞群比例顯著降低，同時(shí)檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)CPT可以降低Oct4、Sox2與Nanog的表達(dá)，說(shuō)明CPT有效降低了細(xì)胞干性。

ER陽(yáng)性乳腺癌依賴(lài)類(lèi)固醇雌激素激活，PI3K/Akt分子是ER信號(hào)通路關(guān)鍵分子，在雌激素的存在下，Akt已被證明可以改變ER基因組結(jié)合模式，有效地改變ER轉(zhuǎn)錄程序[31]，促進(jìn)Bcl2合成，實(shí)現(xiàn)ER信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡[32]。抑制PI3K/Akt通路可下調(diào)ABCG2表達(dá)，同時(shí)ABCG2也可調(diào)控PI3K/Akt的表達(dá)。ABCG2作為一個(gè)外排泵，也被認(rèn)為是一種癌癥干細(xì)胞標(biāo)記物[33]，對(duì)保護(hù)細(xì)胞免受有毒化合物和異源物質(zhì)的侵害至關(guān)重要[34]。本研究表明CPT可以抑制ER-α表達(dá)與磷酸化，并下調(diào)PI3K/Akt和ABCG2蛋白表達(dá)，從而抑制藥物外排并降低細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特異性, 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上，CPT通過(guò)抑制細(xì)胞遷移與侵襲、降低CD24-/lowCD44+細(xì)胞群數(shù)量及ABCG2的表達(dá)，影響腫瘤干細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)，降低MCF7細(xì)胞干性，從而抑制細(xì)胞增殖，為乳腺癌細(xì)胞的治療提供了潛在候選藥物。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。