中藥結(jié)腸透析治療慢性腎臟病3～4期濕濁證患者的臨床效果及作用機(jī)制研究

鄭 鑫 鄧躍毅 嚴(yán)夢(mèng)婷 歸楚瀅 林 釤

(1 上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海,200082; 2 上海中醫(yī)藥大學(xué),上海,200032)

NICHOLSON等[1]最早于1999年首次提出了代謝組學(xué)概念。代謝組學(xué)技術(shù)主要是通過(guò)利用生物組織和體液的磁共振成像波譜提供生物體內(nèi)全部小分子代謝物信息,而后對(duì)生物組織和體液進(jìn)行系統(tǒng)分析及檢測(cè),將代謝信息與生理病理過(guò)程中的某些生物學(xué)事件相互聯(lián)系,以確定發(fā)生變化的靶器官及作用位點(diǎn),最后確定具有特異型的生物標(biāo)志物。代謝組學(xué)近年來(lái)在國(guó)內(nèi)外受到廣泛而密切的關(guān)注,并已成為疾病研究的熱點(diǎn),對(duì)于疾病的生理病理變化、診斷的精確度、疾病療效的判定、藥理作用機(jī)制及中醫(yī)中藥研究等多領(lǐng)域的探索具有重要的意義[2]。目前有關(guān)中醫(yī)藥干預(yù)慢性腎臟病的代謝組學(xué)研究已經(jīng)進(jìn)展了一部分,本研究運(yùn)用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(Gas Chromatography-time-of-flight/Mass Spectrometry,GC-TOF/MS)技術(shù)分析中藥結(jié)腸透析治療前后的慢性腎臟病3～4期濕濁證患者血清樣本代謝物的變化,通過(guò)對(duì)代謝組的定性定量結(jié)果進(jìn)行單變量統(tǒng)計(jì)分析和多元變量統(tǒng)計(jì)分析,篩選出顯著差異的代謝物;在基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上,對(duì)顯著差異的代謝物進(jìn)行一系列生物信息學(xué)的分析。評(píng)估中藥結(jié)腸透析對(duì)體內(nèi)代謝異常調(diào)節(jié)作用,更好地為臨床療效機(jī)制判定提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年8月1日至2021年1月31日上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腎病科門診或住院就診的慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease,CKD)3～4期濕濁證患者60例;健康組10例來(lái)源于本院健康體檢者。本研究獲得上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施(倫理審批號(hào):2018LCSY026)。采用Excel軟件生成隨機(jī)數(shù)字表,由隨機(jī)數(shù)字表按時(shí)間順序給入組病患編號(hào),0號(hào)患者編入對(duì)照組,奇數(shù)號(hào)患者編入觀察組。對(duì)照組30例,觀察組30例。另外,收集10例健康空白組體檢人員進(jìn)行血清代謝組學(xué)分析。2組一般資料比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。見表1。

表1 60例CKD3～4期濕濁證患者一般資料

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) CKD診斷標(biāo)準(zhǔn)參照K/DIGO(Kidney Disease:Improving Global Outcomes)指南[3]。指任何原因所致的腎臟病理學(xué)異常或血、尿、影像學(xué)檢查異?；蚰I小球?yàn)V過(guò)率[流行病學(xué)協(xié)作(Epidemiology Collaboration,EPI)公式]:估算腎小球?yàn)V過(guò)率(Estimated Glomerular Filtration Rate,eGFR)<60 mL/(min·1.73 m2),并持續(xù)3個(gè)月,包括各類腎小球、腎小管間質(zhì)或腎血管疾病。

分期標(biāo)準(zhǔn):CKD1期:eGFR≥90 mL/(min·1.73 m2);CKD2期:eGFR 60～89 mL/(min·1.73 m2);CKD3期:eGFR 30～59 mL/(min·1.73 m2);CKD4期:eGFR 15～29 mL/(min·1.73 m2);CKD5期:eGFR<15 mL/(min·1.73 m2)或透析。

1.2.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中慢性腎衰的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。濕濁證:主癥為惡心嘔吐,肢體困重,食少納呆;次癥為脘腹脹滿,口中黏膩,舌苔厚膩。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 1)符合CKD的診斷標(biāo)準(zhǔn)者;2)年齡18～65歲者;3)CKD3～4期,eGFR 15～59 mL/(min·1.73 m2);4)符合中醫(yī)辨證,屬慢性腎衰濕濁證者;5)患者對(duì)該研究知情,簽署知情同意書者。健康空白組納入標(biāo)準(zhǔn):1)年齡18～60歲,無(wú)心、腦、肝和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病者;2)無(wú)乙肝、結(jié)核等傳染病史,無(wú)高血壓、糖尿病、冠心病、慢性支氣管炎等慢性疾病史者;3)無(wú)輸血史者。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 1)慢性腎臟病已經(jīng)開始腎臟替代治療者;2)診斷為急性腎損傷者;3)合并心、腦、肝和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病者;4)腸道內(nèi)及肛區(qū)腫瘤、炎癥、出血、腹瀉或肛裂者;5)有嚴(yán)重的心力衰竭及合并感染者;6)無(wú)法合作,依從性差者,如精神病者;7)妊娠或哺乳期婦女。

1.5 脫落與剔除標(biāo)準(zhǔn) 1)病例不符合納入標(biāo)準(zhǔn)。2)未曾進(jìn)行試驗(yàn)干預(yù)。3)在入組后無(wú)任何試驗(yàn)數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析前,由課題負(fù)責(zé)人及主要研究者判定病例是否予以剔除。

1.6 治療方法

1.6.1 對(duì)照組 1)基礎(chǔ)治療。飲食與營(yíng)養(yǎng):參照中國(guó)《慢性腎臟病蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)療法專家共識(shí)》,蛋白質(zhì)攝入量為0.6～0.8 g/(kg·d),其中高生物價(jià)蛋白質(zhì)>50%。使用低蛋白飲食時(shí),熱量攝入應(yīng)保持在30～35 kcal/(kg·d)。控制血壓:對(duì)血壓增高者,參照J(rèn)NCⅤⅡ和腎臟疾病質(zhì)量倡議(Kidney Disease Outcomes Quality Initiative,KDOQI)K/DOQI推薦標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)尿蛋白情況,盡量將血壓降至130/80 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)或125/75 mm Hg以下。降壓藥物首先應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(Angiotensin Converting Enzyme Inhibitor,ACEI)或血管緊張素受體拮抗劑(Angiotensin Receptor Blocker,ARB)類,在應(yīng)用該類藥物仍不能將血壓控制到靶目標(biāo)者,則加用鈣離子拮抗劑類或其他降壓藥物。另外:若初診時(shí)血肌酐高于250 μmol/L時(shí),腎臟灌注不足者,慎用ACEI或ARB類降壓藥物,謹(jǐn)防高血鉀癥及急性腎損傷的發(fā)生,密切關(guān)注患者容量及肌酐升高幅度;控制血脂:對(duì)血脂增高者,參照1997年我國(guó)血脂防治建議和美國(guó)2001年5月公布的美國(guó)膽固醇教育計(jì)劃成人觀察組第三次報(bào)告(National Cholesterol Education Program Third Report of the Adult Treatment Group,NCEP ATPⅢ)標(biāo)準(zhǔn),使總膽固醇(Total Cholesterol,TC)<5.72 mmol/L,低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein,LDL)<3.64 mmol/L,三酰甘油<2.26 mmol/L。調(diào)脂藥物首選他汀類降脂藥?？刂蒲?對(duì)糖尿病的患者,參照2013年中國(guó)2型糖尿病防治指南的標(biāo)準(zhǔn),空腹血糖(Fasting Plasma Glucose,FPG)控制在7.0 mmol/L以下,隨機(jī)血糖控制在10.0 mmol/L以下,糖化血紅蛋白(Glycosylated Hemoglobin,HbA1c)控制在7.0%以下。老年患者可適當(dāng)放寬控制標(biāo)準(zhǔn),謹(jǐn)防出現(xiàn)低血糖所導(dǎo)致的腎功能急劇惡化。

2)中醫(yī)辨證論治療:根據(jù)本虛證采用中醫(yī)辨證治療,口服中藥辨證湯劑,每日1劑,分早晚2次服。脾腎氣虛證:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腎內(nèi)科協(xié)定方尿C方(黃芪、黃精、杜仲、寄生、葛根)等。有陽(yáng)虛癥狀加附子、桂枝等;有陰虛癥狀加熟地黃、生地黃、山茱萸等;有氣虛癥狀加黨參、白術(shù)、茯苓、山藥等。有濕熱癥狀加黃芩、黃連等。有瘀血癥狀加當(dāng)歸、川芎、紅花等。

1.6.2 觀察組 在對(duì)照組慢腎衰一體化基礎(chǔ)治療上加用中藥結(jié)腸透析治療。慢腎衰灌腸方:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腎病科經(jīng)驗(yàn)方,由生大黃30 g、生龍骨30 g、生牡蠣30 g、蒲公英30 g、六月雪30 g、當(dāng)歸15 g組成,煎成200 mL的灌腸液進(jìn)行中藥常規(guī)保留灌腸。

具體操作步驟:采用結(jié)腸透析機(jī)進(jìn)行序貫式高位結(jié)腸透析,分為3個(gè)步驟:腸道清洗-結(jié)腸透析-中藥高位保留灌腸。首先使用干凈的溫水重復(fù)整個(gè)腸道的灌洗,直到洗脫液澄清且沒有糞便,然后將結(jié)腸透析液添加到結(jié)腸中透析,充分透析后停止,約1 h后拔管。指導(dǎo)患者排便,排盡腸中剩余水分,然后將制備好的中藥湯劑通過(guò)結(jié)腸透析治療機(jī)注入高位結(jié)腸,然后拔出肛管。指導(dǎo)患者盡可能長(zhǎng)時(shí)間腸內(nèi)保留慢腎衰灌腸方中藥湯劑。觀察組患者進(jìn)行中藥結(jié)腸透析頻率:隔日1次,共25次,治療8周。女性月經(jīng)期暫停中藥結(jié)腸透析。

1.7 觀察指標(biāo) 1)生物學(xué)指標(biāo)、診斷性指標(biāo)于治療前后檢測(cè)觀察并記錄。2)主要療效指標(biāo)及中醫(yī)證候積分共檢查3次。采集時(shí)間點(diǎn):治療前,36 d,60 d。次要療效指標(biāo)(代謝組學(xué))于治療前后各檢查1次,采集時(shí)間點(diǎn):治療前,60 d。3)安全性指標(biāo):糞隱血于每次訪視時(shí)間點(diǎn)均檢查1次,采集時(shí)間點(diǎn):治療前,36 d,60 d。4)終點(diǎn)事件:進(jìn)入腎臟替代治療,具體包括血液透析、腹膜透析、腎移植。

1.8 血清代謝組學(xué)研究方案

1.8.1 取材 空白健康組于2020年12月30日清晨,空腹采集全血樣品。收集的血樣品于室溫,3 000 r/min,離心15 min,離心半徑15 cm,離心后提取3 mL血清,分別裝于1.5 mL Ep管中于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存。檢測(cè)前,樣品于冰水中解凍,在室溫下3 000 r/min,離心15 min,離心半徑15 cm,取上層血清供檢測(cè)。

1.8.2 試劑與儀器 樣本檢測(cè)于上海百趣生物醫(yī)學(xué)科技有限公司,氣相色譜儀器(Agilent公司,美國(guó),型號(hào):7890A),質(zhì)譜儀(LECO公司,美國(guó),型號(hào):PEGASUS HT),色譜柱[Agilent公司,美國(guó),型號(hào):DB-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)],離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific公司,德國(guó),型號(hào):Heraeus Fresco17),超低溫冰箱(Thermo Fisher Scientific公司,德國(guó),型號(hào):Forma 900 series),烘箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司,型號(hào):DHG-9023A),干燥儀(太倉(cāng)市華美生化儀器廠,型號(hào):LNG-T98)。本實(shí)驗(yàn)中所用試劑:甲氧銨鹽(Adamas公司,貨號(hào):M0343),核糖醇(Adamas公司,貨號(hào):C10046500),吡啶(Adamas公司,貨號(hào):P111511),甲醇(Adamas公司,貨號(hào):4.000306.4000),氯仿(Adamas公司,貨號(hào):10071631)。實(shí)驗(yàn)由上海百趣生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

1.8.3 代謝物提取 取樣本50 μL于1.5 mL EP管中,后加入200 μL預(yù)冷甲醇及5 μL核糖醇,離心30 s(血清),有效離心半徑16 cm;超聲10 min;再將樣本4 ℃,12 000 r/min,離心15 min,離心半徑15 cm;移取180 μL上清液于1.5 mL EP管中,每個(gè)樣本各取50 μL混合成質(zhì)控樣本;后干燥提取物;再向代謝物中加入50 μL甲氧胺鹽試劑,混勻后,80 ℃孵育30 min;將每個(gè)樣品中加入70 μL BSTFA,將混合物70 ℃孵育1.5 h;冷卻至室溫后,向混合的樣本中添加5 μL FAMEs;最后進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.8.4 上機(jī)檢測(cè) 檢測(cè)條件:進(jìn)流量1 μL,Splitless Mode分流,3 mL/min隔墊吹掃流速。色譜柱:DB-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm),1 mL/min柱流速,柱箱升溫50 ℃ 1 min,升至310 ℃(升高10 ℃/min)保持8 min,前進(jìn)樣口溫度、傳輸線溫度均為280 ℃,電壓-70 eV,掃描速率:12.5 spectra/s。溶劑延遲：4.8 min(血清)。離子源溫度：250 ℃。質(zhì)量范圍：m/z：50～500。為確保本次實(shí)驗(yàn)研究的精確性，此次研究進(jìn)行全程數(shù)據(jù)質(zhì)控、過(guò)程質(zhì)控、系統(tǒng)質(zhì)控，從3個(gè)方面對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，系統(tǒng)穩(wěn)定性：良好。實(shí)驗(yàn)方法：良好。樣本質(zhì)量：良好。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 基于氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(Gas Chromatography-time-of-flight Mass Spectrometry,GC-TOFMS)的代謝組學(xué)項(xiàng)目數(shù)據(jù)分析部分進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析,是對(duì)代謝組的定性定量結(jié)果進(jìn)行單變量統(tǒng)計(jì)分析和多元變量統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)分析內(nèi)容主要包括:單變量統(tǒng)計(jì)分析:t檢驗(yàn)。多元變量統(tǒng)計(jì)分析:主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)、正交偏最小二乘法-判別分析(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis,OPLS-DA)、差異代謝物篩選和鑒定、差異代謝物的層次聚類分析、差異代謝物的代謝通路分析。

2 結(jié)果

2.1 2組患者治療前后中醫(yī)證候積分比較 2組患者治療后改善中醫(yī)證候均優(yōu)于治療前,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);2組患者治療后組間中醫(yī)證候積分,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者CKD3～4期濕濁證患者治療前后中醫(yī)證候積分比較分)

2.2 2組患者臨床療效比較 治療后,2組患者總有效率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組患者CKD3～4期濕濁證患者治療前后有效率比較

2.3 2組患者治療前后血肌酐、尿素氮、尿酸比較 觀察組治療后血清肌酐及尿素氮均較治療前降低,eGFR較治療前升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組患者治療后肌酐、尿素氮、eGRF比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表4。

表4 2組患者CKD3～4期濕濁證患者治療前后腎功能比較

2.4 2組患者治療后糞隱血比較 2組患者治療后糞隱血比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 2組患者CKD3～4期濕濁證患者治療后糞隱血比較

2.5 代謝組學(xué)結(jié)果

2.5.1 樣本信息 人血清樣本共5組,分別為空白組,觀察組治療前組,觀察組治療后組,對(duì)照組治療前組和對(duì)照組治療后組,各組對(duì)應(yīng)的生物學(xué)重復(fù)分別為10例、30例、30例、30例和30例,進(jìn)行基于GC-TOFMS的代謝組學(xué)分析,共計(jì)130例樣本。

2.5.2 數(shù)據(jù)分析信息

2.5.2.1 統(tǒng)計(jì)分析的對(duì)比信息 共進(jìn)行6組對(duì)比,分別為觀察組治療前組對(duì)觀察組治療后組,對(duì)照組治療前組對(duì)對(duì)照組治療后組,觀察組治療前組對(duì)對(duì)照組治療前組,觀察組治療后組對(duì)對(duì)照組治療后組,觀察組治療前組對(duì)空白組和對(duì)照組治療前組對(duì)空白組。

2.5.2.2 PCA 全部樣本均分布于95%置信區(qū)間內(nèi)。見圖1～2。

圖1 全部樣本(包括QC樣本)的PCA得分散點(diǎn)圖注:k為空白組;jbb為觀察組治療前;jba為觀察組治療后;dbb為對(duì)照組治療前;dba為對(duì)照組治療后;QC為全部樣本組

圖2 空白組、觀察組治療前、觀察組治療后的PCA得分散點(diǎn)圖注:k為空白組;jbb為觀察組治療前,jba為觀察組治療后

2.5.2.3 OPLS-DA得分散點(diǎn)圖 空白組、觀察組治療前后組的OPLS-DA模型得分散點(diǎn)圖。從OPLS-DA得分圖的結(jié)果可以看出,3組樣本區(qū)分非常顯著,樣本處于95%置信區(qū)間內(nèi)。見圖3。

圖3 觀察組治療前后、空白組的OPLS-DA模型得分散點(diǎn)圖注:k為空白組;jbb為觀察組治療前;jba為觀察組治療后

2.5.2.4 差異代謝物的篩選 試驗(yàn)中對(duì)差異性代謝物的篩選標(biāo)準(zhǔn):PCA中的P值小于0.05,同時(shí)滿足OPLS-DA中VIP值大于1。CKD3～4期濕濁證差異性代謝物為:丙酮酸、琥珀酸半醛、富馬酸、檸檬酸、蘋果酸及α-酮戊二酸。見表6。

表6 差異性代謝物的篩選

2.5.2.5 差異代謝物層次聚類分析 上述得到的差異性代謝物,在經(jīng)過(guò)中藥結(jié)腸透析后在生物學(xué)上存在組間的變化差異。此處以觀察組治療前后對(duì)比健康空白組,共70例樣本進(jìn)行分析。結(jié)果提示:琥珀酸半醛、蘋果酸、富馬酸、檸檬酸、α-酮戊二酸及丙酮酸相對(duì)表達(dá)量均較治療前下降。見圖4。

圖4 觀察組治療前后差異性代謝物與空白組層次聚類分析注:jba為觀察組治療后;jbb為觀察組治療前;k空白組;橫坐標(biāo)代表試驗(yàn)分組,縱坐標(biāo)代差異性代謝物,不同位置的色塊顏色代表對(duì)應(yīng)代謝物在本組樣本中的相對(duì)表達(dá)量

2.5.2.6 差異代謝物的代謝通路分析 差異性代謝物具體參與的代謝通路主要包括:三羧酸循環(huán)及丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代謝。見圖5。代謝通路見圖6～7。

圖5 觀察組治療前組對(duì)觀察組治療后組的通路分析注:氣泡圖可以說(shuō)明通過(guò)此次中藥結(jié)腸透析后,代謝物主要參與的代謝通路分析,圖中橫坐標(biāo)表明代謝通路的拓?fù)浞治?距離原點(diǎn)距離越遠(yuǎn),影響因子越大;縱坐標(biāo)表明富集分析的P值,氣泡離坐標(biāo)原點(diǎn)的距離越遠(yuǎn),表明差異性代謝物通路在中藥結(jié)腸透析中越關(guān)鍵

圖6 三羧酸循環(huán)代謝注:圖中亮藍(lán)色表示下調(diào)

圖7 丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代謝注:圖中亮藍(lán)色表示下調(diào)

3 討論

3.1 CKD與腸道微生態(tài)的關(guān)系 近些年來(lái),隨著對(duì)腸道微生態(tài)的深入研究,許多專家意識(shí)到腸道微生態(tài)與慢性腎臟病之間存在一定的相關(guān)性[5]。數(shù)以百萬(wàn)億計(jì)的腸道微生物成了影響慢性腎臟病發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及轉(zhuǎn)歸的重要原因。CKD患者大多存在腸道內(nèi)環(huán)境及上皮屏障的變化,最終導(dǎo)致腸道菌群明顯異于常人[6]。而腸道菌群失調(diào)及其所導(dǎo)致的腸源性尿毒癥毒素的積蓄,又進(jìn)一步加快了CKD的疾病進(jìn)展,由此調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境平衡用于CKD的治療,成為控制疾病進(jìn)展的新方法[7]。

3.2 中藥保留灌腸的組方和藥理分析 此次中藥保留灌腸的方藥由生大黃、生龍骨、生牡蠣、蒲公英、六月雪、當(dāng)歸組成,本方具有通腹泄?jié)?解毒化瘀的功效。生大黃的主要功效包括:瀉下攻積,清熱瀉火,解毒,活血祛瘀等。動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí):從大黃中提取物半乳糖原花青素可以降低膽固醇在體內(nèi)的合成[8]。大黃的衍生物可以抑制腎小球系膜細(xì)胞的增殖,預(yù)防健全的腎小球硬化[9]。試驗(yàn)證實(shí),大黃可以增加腸道毒素的排泄(包括血肌酐、尿素氮等)[10]。生龍骨、生牡蠣的主要功效包括:軟堅(jiān)散結(jié),平肝潛陽(yáng),收斂固澀等?，F(xiàn)代藥理發(fā)現(xiàn),生牡蠣與生大黃聯(lián)合使用可以有效降低生大黃由于過(guò)度泄下而導(dǎo)致體內(nèi)腎臟灌注不足的不良反應(yīng)[11]。生龍骨、生牡蠣聯(lián)合使用還具有類似碳酸鈣、磷酸鈣及硫酸鈣的作用[12],可以增加灌腸液的滲透壓,進(jìn)而增加宿主中的毒素向腸道的分泌,從而有利于宿主中毒素的排泄[13]。蒲公英的主要功效包括:清熱解毒,利濕通淋,涼血消腫。早在元代就有醫(yī)家提出蒲公英可化熱毒、散滯氣、解食毒。研究證實(shí),蒲公英具有抑菌扶正,提高人體免疫力等作用[14],并且可以抗感染、抗氧化[15]。六月雪具有清熱利濕,疏風(fēng)解表,活血通絡(luò)等功效。在臨床對(duì)于降低血肌酐、尿素氮等指標(biāo)上有很好的效果[16]?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí),六月雪中含有鞣質(zhì)、苷類、生物堿、植物甾醇、糖肪酸等有效成分[17],可以增加體液免疫及細(xì)胞免疫功能[18]。朱秋萍等[19]研究證實(shí),六月雪提取物可以明顯增加小鼠食欲,促進(jìn)小鼠生長(zhǎng)發(fā)育,提升胸腺重量及體質(zhì)量。此外,六月雪還可以提升腎血流量,促進(jìn)纖維物質(zhì)的吸收,使荒廢的腎小球得以修復(fù),進(jìn)而達(dá)到降低尿蛋白的作用。當(dāng)歸具有補(bǔ)血活血,潤(rùn)腸通便,調(diào)經(jīng)止痛等功效。研究證實(shí):腎小球硬化及間質(zhì)纖維化是CKD共同的特征[20]。隨著健全腎小球數(shù)目的減少及腎臟纖維化的增加,加劇了腎功能的降低。其機(jī)制為早期腎小球“三高”狀態(tài)的出現(xiàn),血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生變化,脂代謝失衡,細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度的沉積,從而在腎臟形成“癥瘕”[21]。動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí),當(dāng)歸可以減輕腎小管上皮細(xì)胞凋亡,降低腎臟缺血再灌注,延緩腎間質(zhì)纖維化的過(guò)程[22]。研究證實(shí),當(dāng)歸還可以改善血流變學(xué)的指標(biāo),進(jìn)一步改善血液微循環(huán),提升腎小球?yàn)V過(guò)率,進(jìn)而保護(hù)腎功能,延緩疾病進(jìn)展[23]。

綜上所述,中藥保留灌腸是為了加強(qiáng)毒素從腸道的排泄,清除體內(nèi)毒素的積蓄,為排泄人體內(nèi)所殘留的毒素尋找他路。

3.3 結(jié)腸透析在慢性腎臟病CKD3～4期中應(yīng)用的機(jī)制 結(jié)腸具有分泌與吸收功能,尤其在后半結(jié)腸,對(duì)部分無(wú)機(jī)鹽、水分以及各種維生素都具有非常強(qiáng)大的吸收功能,這與結(jié)腸的解剖結(jié)構(gòu)及生理特性是有關(guān)的[24]。從解剖結(jié)構(gòu)上說(shuō),結(jié)腸屬于大腸的一部分,由升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸及乙狀結(jié)腸4部分組成,全長(zhǎng)大約125 cm[25]。從結(jié)腸的生理結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō),結(jié)腸壁上有很多囊狀突起,構(gòu)成了結(jié)腸所獨(dú)特?fù)碛薪Y(jié)構(gòu)——“結(jié)腸袋”,一定程度上增大了腸黏膜的接觸面積。從結(jié)腸的運(yùn)動(dòng)形式上說(shuō),結(jié)腸袋在大腸蠕動(dòng)中有著至關(guān)重要的作用,通過(guò)袋狀往返運(yùn)動(dòng)及分節(jié)推進(jìn)這2種特殊的運(yùn)動(dòng)方式,使腸內(nèi)容物在腸道內(nèi)停留,并得到充分結(jié)合,增加了結(jié)腸的吸收作用[26]。從血管分布來(lái)說(shuō),腸黏膜的下層內(nèi)含有非常豐富的淋巴管網(wǎng)及毛細(xì)血管網(wǎng),直腸周圍分布著極為豐富的靜脈血管叢直接匯入直腸靜脈叢,最后注入髂內(nèi)靜脈及腸系膜下靜脈,然后繞過(guò)了肝臟,最終進(jìn)入人體血液循環(huán)系統(tǒng)[27]。

綜上所述,結(jié)腸豐富的血管條件、廣泛的腸黏膜接觸面積、特殊的運(yùn)動(dòng)形式及結(jié)構(gòu)特點(diǎn),為無(wú)機(jī)鹽、水分及各類維生素的吸收創(chuàng)造了優(yōu)越的條件。

結(jié)腸透析法通過(guò)模仿腹膜透析原理,采用滲透、彌散及吸收等跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制。其本質(zhì)上就是利用細(xì)胞內(nèi)外不同濃度差進(jìn)行跨膜物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)[28]。結(jié)腸透析液與人體血液均包含某些相同物質(zhì)的小分子,但二者由于濃度不同,因此結(jié)腸內(nèi)外形成不同的濃度差[29],進(jìn)而促使透析液中某些有用的離子及必要的小分子進(jìn)入血液循環(huán)中,同時(shí)血液中的毒素通過(guò)腸壁的滲透壓進(jìn)入腸腔,最終由透析液排出體外。另外,結(jié)腸上分布的結(jié)腸袋增加了腸黏膜的接觸面積,更利于透析液的貯存及與黏膜充分的接觸,延長(zhǎng)有效的吸收時(shí)間,從而提高體內(nèi)毒素的排泄。從中藥湯劑的吸收角度上看,其與靜脈給藥類似,湯劑以腸黏膜為屏障,大約3/4以上的部分經(jīng)肛管靜脈及直腸內(nèi)膜下靜脈直接進(jìn)入人體血液循環(huán),繞過(guò)肝臟,更好地避免了首過(guò)效應(yīng),提高了藥物在體內(nèi)的吸收濃度[30]。

3.4 中藥結(jié)腸透析治療CKD3～4期濕濁證患者潛在生物標(biāo)志物及其代謝途徑

本研究提示,中藥結(jié)腸透析治療CKD3～4期濕濁證患者的代謝途徑主要包括:三羧酸循環(huán)及丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代謝。潛在生物標(biāo)志物代謝途徑分析如下。

3.4.1 三羧酸循環(huán)代謝 三羧酸循環(huán)是能量代謝的中心環(huán)節(jié),同時(shí)也是脂類、糖類、氨基酸的最終代謝通路,又是3類物質(zhì)代謝聯(lián)系的樞紐[31]。各種物質(zhì)代謝異常最終都會(huì)影響能量代謝[32]。因此,患者血液中的三羧酸循環(huán)中代謝物水平發(fā)生改變,在慢性腎臟病中這種表現(xiàn)尤為突出。

本研究在三羧酸循環(huán)代謝途徑中檢測(cè)出包括蘋果酸、富馬酸、檸檬酸、丙酮酸及α-酮戊二酸5種物質(zhì)的變化較治療前降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

蘋果酸是三羧酸循環(huán)的中間體,對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷起到抵抗作用,同時(shí)蘋果酸還可以為機(jī)體提供能量,消除人體疲勞感,提高患者免疫力,由于慢性腎臟病患者后期同時(shí)伴隨免疫功能的低下,感染風(fēng)險(xiǎn)提升,感染又同時(shí)會(huì)加速疾病的進(jìn)展,由此惡性循環(huán),故蘋果酸鹽在維持患者免疫功能中起到重要的作用[33-36]。

通過(guò)對(duì)CKD合并糖尿病患者與健康對(duì)照者的血液行靶向GC-MS分析,結(jié)果顯示CKD合并糖尿病患者中與線粒體代謝相關(guān)的代謝物明顯增加,提示該類患者存在線粒體功能的破壞,這些血液代謝物可作為評(píng)價(jià)腎功能的新型生物標(biāo)志物[37]。此外,利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行研究證實(shí)[38],CKD引起血液中三羧酸循環(huán)代謝物濃度升高,其中包括:檸檬酸鹽、富馬酸、琥珀酸、蘋果酸鹽。以上研究結(jié)果提示,三羧酸循環(huán)可能與CKD的發(fā)病關(guān)系密切,其代謝產(chǎn)物可作為CKD診斷的早期生物標(biāo)志物。繼而對(duì)富馬酸作用機(jī)制的進(jìn)一步分析結(jié)果提示,還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4通過(guò)特異性下調(diào)腎皮質(zhì)中富馬酸酶的表達(dá),進(jìn)而導(dǎo)致體內(nèi)富馬酸水平升高。富馬酸通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α脯氨酸羥基化,從而抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1蛋白的降解;同時(shí)富馬酸還可以共價(jià)修飾半胱氨酸的殘基,形成富馬酸-谷胱甘肽加合物,從而影響細(xì)胞抗氧化反應(yīng)。研究證實(shí),富馬酸鹽在體內(nèi)的積蓄是導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的原因之一[39]。

檸檬酸是在三羧酸循環(huán)中由草酰乙酸羧和乙酰輔酶A合成,參與機(jī)體蛋白質(zhì)代謝、糖代謝和脂肪代謝[40]。檸檬酸進(jìn)入細(xì)胞壁,使細(xì)菌內(nèi)部及外部出現(xiàn)pH梯度差,抑制細(xì)菌繁殖[41]。檸檬酸使胃腸道內(nèi)pH下降,腸道內(nèi)的益生菌得到良好的生長(zhǎng)環(huán)境,從而維持機(jī)體腸道菌群的平衡[42]。此外,檸檬酸同樣可以提升免疫機(jī)制,使機(jī)體處于相對(duì)良好的免疫狀態(tài),預(yù)防感染風(fēng)險(xiǎn);將檸檬酸鹽與抗氧化劑同時(shí)配合使用,可提高機(jī)體抗氧化效果,阻止CKD后期氧化應(yīng)激反應(yīng)[43]。

丙酮酸是非常重要的A-氧代羧酸之一,其不僅在機(jī)體能量代謝中起到至關(guān)重要的作用,而且還是許多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的前體,丙酮酸在醫(yī)藥領(lǐng)域中具有廣泛的用途[44]。丙酮酸是對(duì)機(jī)體能量代謝具有很大影響的物質(zhì),是糖酵解的終產(chǎn)物,也是檸檬酸循環(huán)的起始物質(zhì),通過(guò)檸檬酸循環(huán)氧化,同時(shí)伴隨著異化和同化作用,是物質(zhì)代謝中關(guān)鍵的支點(diǎn)[45]。通過(guò)切斷或減弱丙酮酸進(jìn)一步代謝的支路,可以增加其在體內(nèi)的大量積蓄,加速丙酮酸的合成,去除代謝產(chǎn)物的反饋抑制及反饋?zhàn)瓒?。研究證實(shí),飲食中適當(dāng)添加含有丙酮酸鹽的氧化劑,可以加快脂肪代謝速度,還可以降低因低脂飲食造成的蛋白質(zhì)的無(wú)故流失[46],此外,丙酮酸對(duì)于人體的不良反應(yīng)很少,許多發(fā)達(dá)國(guó)家利用丙酮酸的這一特性,研制出新型的丙酮酸鈣鹽,作為降脂和補(bǔ)鈣的醫(yī)療藥品[47]。研究證實(shí),丙酮酸鈣鹽具有降低膽固醇及血脂的作用[48]。STANKO等[49]通過(guò)在高脂血癥患者的飲食中添加適當(dāng)丙酮酸鈣鹽,服用后發(fā)現(xiàn):LDL下降5%,TC下降4%。丙酮酸鈣同樣是非常好的鈣劑,補(bǔ)充體內(nèi)所需鈣的同時(shí),不會(huì)加重肝臟、腎臟的壓力,且無(wú)不良反應(yīng)[50]。此外,丙酮酸作為一種抗氧化劑,可以有效預(yù)防缺血再灌注,刺激黏膜組織的修復(fù),并且促進(jìn)自由基清除[51]。

α-酮戊二酸:α-酮戊二酸是戊二酸的2種帶酮基的衍生物中的其中一種,其可參與人體內(nèi)三羧酸循環(huán),并生成人體必需氨基酸,故可作為膳食補(bǔ)充品[52-53]。研究證實(shí),α-酮戊二酸可以結(jié)合體內(nèi)多余的氨,從而減少血液透析患者氨中毒的風(fēng)險(xiǎn)[54]。研究證實(shí),α-酮戊二酸含機(jī)體所需的必要氨基酸和酮基類似物,可以及時(shí)補(bǔ)充患者體內(nèi)缺乏的氨基酸,改善患者由于疾病控制飲食后的蛋白質(zhì)代謝紊亂[55]。此外,α-酮戊二酸還可以提高酯酶活性,降低胰島素抵抗,進(jìn)而改善患者糖脂代謝紊亂[56-57]。既往研究證實(shí):α-酮戊二酸是腎小管損傷的重要標(biāo)志物,腎功能不全患者后期腎小管萎縮,間質(zhì)纖維化,腎小管重吸收能力下降,導(dǎo)致電解質(zhì)紊亂及代謝性酸中毒不可避免[58-59]。所以,及時(shí)補(bǔ)充體內(nèi)α-酮戊二酸可以緩解由于腎小管損傷所導(dǎo)致的一系列臨床癥狀。

3.4.2 丙氨酸、天冬氨酸,谷氨酸代謝 丙氨酸、谷氨酸與天冬氨酸從氨基酸合成關(guān)系分析:由于這3種氨基酸相比其他氨基酸更早地合成,因此,這3種酮酸在糖類、脂類、能量物質(zhì)代謝等過(guò)程中具有重要的地位。

氨基酸代謝是人體重要的代謝途徑。通過(guò)蛋白質(zhì)水解生成的氨基酸在機(jī)體內(nèi)部代謝途徑包括:一是合成人體本身所特有的多肽、蛋白質(zhì)及其他含氮物質(zhì);二是可以通過(guò)脫氨與轉(zhuǎn)氨作用,聯(lián)合脫羧或脫氨作用,分解為胺類、α-酮酸及CO2。氨基酸分解生成α-酮酸可以轉(zhuǎn)變?yōu)橹悺⑻腔蚱渌梭w內(nèi)非必需氨基酸,也可以通過(guò)三羧酸循環(huán)生成水和CO2,并釋放能量[60]。既往研究證實(shí):CKD由于腎功能下降,營(yíng)養(yǎng)攝入不足,飲食控制,尿毒癥毒素在體內(nèi)積蓄,機(jī)體代謝酶的數(shù)量及活力的下降,內(nèi)分泌功能失調(diào),腸道菌群紊亂等因素引起患者氨基酸代謝的紊亂[61]。此外,氨基酸代謝也會(huì)影響T細(xì)胞的活化、增殖和存活。氨基酸代謝對(duì)免疫細(xì)胞的分化與成熟也具有重要的作用。大多數(shù)氨基酸可以通過(guò)三羧酸循環(huán)代謝,而通過(guò)利用氨基酸或脂肪酸,幼稚的B細(xì)胞可以產(chǎn)生ATP,通過(guò)糖酵解而產(chǎn)生IgA的漿細(xì)胞可以進(jìn)行三羧酸循環(huán)[62]。氨基酸還對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮和細(xì)胞因子尤為重要;氨基酸的分解代謝還可以抑制病原體和T細(xì)胞的增殖。進(jìn)而起到保護(hù)機(jī)體及提高免疫力的功效[63]。

本研究結(jié)果提示,通過(guò)中藥結(jié)腸透析治療后,患者血清中琥珀酸半醛、富馬酸、α-酮戊二酸、檸檬酸及丙酮酸水平較治療前降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

之前在三羧酸循環(huán)中,已詳細(xì)闡述了丙酮酸,富馬酸、檸檬酸及α-酮戊二酸在治療CKD3～4期濕濁證的作用。而丙氨酸、天冬氨酸,谷氨酸代謝中除了檢測(cè)出上述的4類代謝物較治療前后的變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義之外,還發(fā)現(xiàn)治療后在患者體內(nèi)琥珀酸半醛的水平也較治療前下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

琥珀酸半醛的增多會(huì)導(dǎo)致4-羥基丁酸升高,從而影響多巴胺、γ-氨基丁酸、血清素、乙酰膽堿等多個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的破壞[64]。琥珀酸半醛是由α-酮戊二酸脫羧酶催化α-酮戊二酸所生成的,然后經(jīng)過(guò)琥珀酸半醛脫氫酶催化使琥珀酸半醛轉(zhuǎn)化為琥珀酸,完成三羧酸循環(huán)[65]。本研究發(fā)現(xiàn):通過(guò)降低琥珀酸半醛在體內(nèi)的積蓄,進(jìn)一步優(yōu)化了三羧酸循環(huán)的平衡,使患者的能量代謝紊亂得到改善。

綜上所述,中藥結(jié)腸透析可以提升CKD3～4期濕濁證患者的腎小球?yàn)V過(guò)率,延緩疾病進(jìn)展,改善臨床癥狀;其作用機(jī)制主要表現(xiàn)為:緩解機(jī)體氧化應(yīng)激,增加能量代謝,平衡丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝紊亂,提高機(jī)體免疫功能及維護(hù)腸道菌群平衡等。

利益沖突聲明:無(wú)。