自制ISCOMATRIX與CpG聯(lián)合的HCA587蛋白疫苗的制備及其免疫效應(yīng)評(píng)估

譚媛芳,陳惠媛,焦 薇,范秋穎,邵國(guó)青,熊祺琰,陳娟娟

(1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,江西省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南昌 330006;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所,農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心,南京 210014)

腫瘤-睪丸抗原(cancer/testis antigen,CTA)僅表達(dá)在癌細(xì)胞和某些生殖細(xì)胞表面,并且在腫瘤組織中高度表達(dá),這種限制性表達(dá)模式使其成為腫瘤疫苗的潛在靶點(diǎn)[1]。本課題組前期從原發(fā)性肝細(xì)胞癌患者的腫瘤組織cDNA表達(dá)文庫(kù)中鑒定出一種新的CTA,即HCA587/MAEG-C2抗原,與已被廣泛研究的NY-ESO-1和MAGE-A3相比,HCA587在腫瘤患者中的表達(dá)水平更高[2],并且在腫瘤患者血清中能檢測(cè)到自然產(chǎn)生的HCA587抗體[3],提示HCA587具有良好的腫瘤組織表達(dá)特異性和免疫原性,是腫瘤疫苗設(shè)計(jì)的優(yōu)質(zhì)候選抗原。

寡脫氧核苷酸CpG是Toll樣受體9激動(dòng)劑,可促進(jìn)Th1細(xì)胞活化與NK細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)特異性毒性T細(xì)胞產(chǎn)生[4]。免疫刺激復(fù)合物基質(zhì)(immune-stimulating complexes matrix,ISCOMATRIX,ISCOM)是一類(lèi)以皂苷為基礎(chǔ)制備的微粒,能協(xié)助抗原呈遞,刺激與增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答[5],其與CpG佐劑聯(lián)合使用可有效地激活Th1型免疫反應(yīng)[6]。本課題組研制的HCA587蛋白疫苗中含有商品化ISCOMATRIX與CpG佐劑,在小鼠模型中顯示出了顯著的腫瘤預(yù)防和治療能力[7]。然而,目前國(guó)內(nèi)已無(wú)法獲得商品化ISCOMATRIX,鑒于其在HCA587蛋白疫苗中重要的佐劑作用以及該疫苗的臨床應(yīng)用潛能,自行制備ISCOMATRIX十分必要。本研究采用透析法自制ISCOMATRIX,并比較了HCA587蛋白聯(lián)合CpG和不同劑量的自制ISCOMATRIX所產(chǎn)生的免疫效應(yīng),旨在為后續(xù)HCA587蛋白疫苗的抗腫瘤應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑

膽固醇、Tween-20購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;N-癸?；?N-甲基葡糖胺(Mega-10)購(gòu)自美國(guó)Avanti Polar Lipids公司;Quil A購(gòu)自賽德奧生物科技(北京)有限公司;磷脂酰膽堿購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;商品化免疫刺激復(fù)合物ISCOMATRIX購(gòu)自瑞典Isconova AB公司;小鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(IFN-γ ELISpot)檢測(cè)試劑盒(包含抗IFN-γ包被抗體、生物素標(biāo)記抗IFN-γ抗體、親和素標(biāo)記堿性磷酸酶)購(gòu)自澳大利亞MABTECH公司;5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽/氮藍(lán)四唑(BCIP-NBT)底物顯色液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體購(gòu)于美國(guó)Promega公司;可溶性單組分TMB底物顯色液購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;PBS粉劑購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司。CpG ODN 1826序列:5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3′,委托上海生工生物工程有限公司合成。pGEX-6P-1-HCA587重組質(zhì)粒的構(gòu)建和HCA587重組蛋白的表達(dá)純化委托北京中美冠科生物技術(shù)有限公司完成。

1.1.2 細(xì)胞系和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

穩(wěn)定表達(dá)HCA587的小鼠黑色素瘤細(xì)胞系(B16-HCA587)由本課題組自行構(gòu)建,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

6～8周齡的雌性C57BL/6J小鼠購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證號(hào):SCXK(浙)2019-0001)并飼養(yǎng)在萬(wàn)級(jí)屏障環(huán)境中。本研究方案經(jīng)南昌樂(lè)悠生物科技有限公司動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(RYE2022092501和RYE2022111801)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ISCOMATRIX的制備

ISCOMATRIX自制過(guò)程詳見(jiàn)文獻(xiàn)[8],簡(jiǎn)要步驟如下:1)用蒸餾水和Mega-10干粉制備20% Mega-10溶液,后加入磷脂酰膽堿與膽固醇,制成1%脂類(lèi)混合物貯備液;2)取200 μL 1%脂類(lèi)混合物貯備液與1300 μL無(wú)菌磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻,加入2% Quil A貯備液500 μL,充分混勻后冰浴超聲處理。轉(zhuǎn)移至透析袋對(duì)無(wú)菌PBS透析去除洗滌劑Mega-10,最后過(guò)濾除菌備用(Quil A終濃度為0.5%);3)取100 μL進(jìn)行磷鎢酸負(fù)染,電鏡觀察。

用PBS稀釋上述制備完成的ISCOMATRIX,使Quil A濃度為1 mg·mL-1(0.1%)。在100 μL的 HCA587蛋白(10 μg)結(jié)合CpG(12 μg)配以QuilA濃度為0.005%(5 μg)、0.012%(12 μg)、0.018%(18 μg)和0.036%(36 μg)自制ISCOMATRIX的疫苗溶液體系中,分別加入5、12、18、36 μLQuilA濃度為0.1%的自制ISCOMATRIX。

1.2.2 小鼠免疫模型的建立

將小鼠隨機(jī)分為7組,每組6只。實(shí)驗(yàn)組分別給予HCA587(10 μg)結(jié)合CpG(12 μg)配以不同劑量自制ISCOMATRIX(5、12、18、36 μg)或商品化ISCOM制劑(12 μg)。對(duì)照組給予PBS溶液或CpG+36 μg自制ISCOMATRIX佐劑溶液。各組均于第0、21天進(jìn)行尾根部皮下注射,注射體積為100 μL·只-1,于第35天收獲小鼠脾臟及血清。

具體免疫分組:A組,HCA587+CpG+5 μg ISCOM;B組,HCA587+CpG+12 μg ISCOM;C組,HCA587+CpG+18 μg ISCOM;D組,HCA587+CpG+36 μg ISCOM;E組,HCA587+CpG+12 μg 商品化ISCOM;F組,PBS;G組,CpG+36 μg ISCOM。其中A-D組為自制ISCOMATRIX實(shí)驗(yàn)組,E組為商品化ISCOM實(shí)驗(yàn)組,F組和G組分別為PBS緩沖液對(duì)照組和佐劑對(duì)照組。

1.2.3 小鼠脾細(xì)胞刺激和IFN-γ ELISpot實(shí)驗(yàn)

充分研磨各組小鼠脾臟并裂解紅細(xì)胞,用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基重懸脾細(xì)胞。在預(yù)包被抗小鼠IFN-γ單抗的96孔平底硝酸纖維素板中,每孔加入5×105個(gè)脾細(xì)胞,A-G組各有9個(gè)樣孔,包括3個(gè)實(shí)驗(yàn)孔,3個(gè)培養(yǎng)基對(duì)照孔和3個(gè)卵清蛋白(OVA)-1對(duì)照孔。實(shí)驗(yàn)孔每孔加入100 μL 2.5 μg·mL-1HCA587重組蛋白,培養(yǎng)基和OVA對(duì)照孔中分別加入等體積的完全培養(yǎng)基和2.5 μg·mL-1OVA溶液,在37 ℃下孵育20 h。用PBST(含0.05% Tween-20)洗板后加入生物素標(biāo)記的抗小鼠IFN-γ單抗,在37 ℃下孵育2 h。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素,室溫下避光孵育1 h。洗板后加入BCIP-NBT顯色液避光顯色,用自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)。待反應(yīng)板晾干后,統(tǒng)計(jì)每孔的斑點(diǎn)數(shù)。

1.2.4 小鼠血清HCA587抗體酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

用1 μg·mL-1HCA587重組蛋白溶液包被培養(yǎng)板,4 ℃孵育過(guò)夜,洗板后加入2%牛血清白蛋白(BSA)封閉,洗滌。加入100 μL不同稀釋倍數(shù)的各組小鼠血清,在37 ℃下孵育2 h。洗板后加入HRP標(biāo)記的抗小鼠IgG抗體,在37 ℃下孵育90 min。洗板后加入TMB顯色液室溫反應(yīng)3～5 min,每孔加入100 μL 2 mol·L-1H2SO4溶液終止反應(yīng)。測(cè)定各孔450 nm處的吸光度(OD值),OD值大于或等于PBS對(duì)照組血清孔的平均OD值的2.1倍的樣孔為陽(yáng)性。

1.2.5 小鼠腫瘤治療模型的建立

將治療模型小鼠分為HCA587蛋白疫苗治療組和PBS對(duì)照組。第0天,在2組每只小鼠右側(cè)脅腹部皮下接種1×104個(gè)(100 μL)B16-HCA587細(xì)胞;分別在第7、28天,給HCA587蛋白疫苗治療組小鼠尾根部皮下注射100 μL HCA587蛋白疫苗,含CpG和最佳劑量的自制ISCOMATRIX,并給PBS對(duì)照組小鼠尾根部皮下注射等體積的無(wú)菌PBS溶液。

每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的大小2～3次,計(jì)算腫瘤體積:腫瘤體積=長(zhǎng)徑×短徑2×0.52。第35天處死小鼠,無(wú)菌操作下獲取各組小鼠腫瘤組織。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism9軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較組間分泌IFN-γ的脾細(xì)胞頻數(shù)與血清HCA587抗體ELISA OD值;采用非配對(duì)t檢驗(yàn)比較組間腫瘤體積大小。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 自制ISCOMATRIX微觀結(jié)構(gòu)表征

自制ISCOMATRIX經(jīng)磷鎢酸負(fù)染后的電鏡照片見(jiàn)圖1(封三)。自制ISCOMATRIX具有典型的蜂窩籠狀結(jié)構(gòu),大小均一,直徑為20～30 nm。

A:比例尺200 nm;B:比例尺100 nm。圖1 電鏡下ISCOMATRIX的微觀結(jié)構(gòu)

2.2 以自制ISCOMATRIX為佐劑的HCA587蛋白疫苗的免疫效果

2.2.1 細(xì)胞免疫效果

小鼠脾細(xì)胞刺激和IFN-γ ELISpot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,E組(陽(yáng)性對(duì)照)分泌IFN-γ脾細(xì)胞頻數(shù)顯著高于F組(陰性對(duì)照)(349.70±134.10比8.33±3.06,P<0.000 1)。使用不同濃度自制ISCOMATRIX制備的HCA587蛋白疫苗都能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)HCA587抗原特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答,其中以12 μg 自制ISCOMATRIX(B組)和36 μg自制ISCOMATRIX(D組)聯(lián)合CpG制備的疫苗應(yīng)答較強(qiáng),2組分泌IFN-γ的脾細(xì)胞頻數(shù)與E組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(280.00±39.00、291.70±78.39比349.70±134.1,均P>0.05),并顯著高于F組和G組(280.00±39.00、291.70±78.39比3.67±1.16、8.33±3.06,均P<0.000 1);而5 μg(A組)、18 μg(C組)自制ISCOMATRIX聯(lián)合CpG制備的疫苗免疫的小鼠分泌IFN-γ的脾細(xì)胞頻數(shù)雖高于F、G組(211.00±2.00、105.00±5.57比3.67±1.16、8.33±3.06,P<0.0001),但低于E組(211.00±2.00、105.00±5.57比349.70±134.10,P=0.004)。見(jiàn)圖2(封三)。

A:顯示實(shí)際斑點(diǎn)數(shù)的ELISpot板圖;B:各組疫苗誘導(dǎo)的HCA587抗原特異性脾細(xì)胞分泌IFN-γ的頻數(shù)。*P<0.001,**P<0.000 1與E組比較。

2.2.2 體液免疫效果

HCA587抗體ELISA結(jié)果顯示,E組(陽(yáng)性對(duì)照)1×104倍稀釋血清中HCA587抗體陽(yáng)性,其450 nm處OD值為0.95±0.13,是F組(0.24±0.05)的4.02倍。B組、C組和D組1×104倍稀釋血清HCA587抗體亦陽(yáng)性(450 nm處OD值分別為F組的5.36、3.72和3.33倍),誘導(dǎo)產(chǎn)生的血清HCA587抗體水平均較高,450 nm處OD值與E組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.26±0.33、0.88±0.48和0.79±0.54比0.95±0.13,P>0.05);與PBS對(duì)照組相比,僅12 μg自制ISCOMATRIX組的抗體滴度在一萬(wàn)倍稀釋時(shí)顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)勢(shì)(1.26±0.33比0.24±0.05,P=0.006 2)。見(jiàn)圖3(封三)。

稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)

綜合各組疫苗的ELISpot和ELISA結(jié)果,HCA587蛋白聯(lián)合12 μg、36 μg自制ISCOMATRIX誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生HCA587的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答效果最顯著,并且未觀察到佐劑對(duì)小鼠的毒性作用。在能夠產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答的前提下,選取劑量較小的佐劑濃度(即Quil A濃度為0.012%的自制ISCOMATRIX)進(jìn)行后續(xù)腫瘤治療實(shí)驗(yàn)。

2.3 以自制ISCOMATRIX為佐劑的HCA587蛋白疫苗的腫瘤治療效果

與PBS對(duì)照組相比,HCA587蛋白疫苗治療組小鼠腫瘤生長(zhǎng)顯著減慢,第35天時(shí),HCA587蛋白疫苗治療組小鼠腫瘤尺寸顯著小于PBS對(duì)照組[(1 528.0±373.3)mm3比(2 699.0±417.4)mm3,P=0.018 1]。見(jiàn)圖4(封三)。

腫瘤生長(zhǎng)曲線。*P<0.05與PBS對(duì)照組比較。圖4 以自制ISCOMATRIX為佐劑的HCA587蛋白疫苗的腫瘤治療效果

3 討論

腫瘤的主動(dòng)免疫治療,例如腫瘤疫苗,旨在通過(guò)輸送靶向抗原來(lái)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性體液免疫和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答,以直接殺傷腫瘤細(xì)胞或破壞腫瘤生長(zhǎng)的微環(huán)境,從而抑制腫瘤的惡性進(jìn)展。然而,在實(shí)際應(yīng)用中,初次免疫時(shí),如果疫苗不含佐劑,可能導(dǎo)致免疫原性不足[9]。佐劑是一類(lèi)能夠增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類(lèi)型的物質(zhì)[10]。在疫苗中引入佐劑不僅可以改變適應(yīng)性反應(yīng)的程度和質(zhì)量,還能使先天免疫發(fā)揮作用,從而提供對(duì)特定病原體的最大保護(hù)[11]。因此,佐劑的應(yīng)用能夠激發(fā)腫瘤疫苗的預(yù)防和治療潛力。

ISCOMATRIX是一種基于皂苷的佐劑,其應(yīng)用潛力引起了學(xué)界的廣泛關(guān)注。ISCOMATRIX通過(guò)納米顆粒形式控制了皂苷的毒性,同時(shí)保留了其強(qiáng)大的免疫原性。ISCOMATRIX有兩種主要形式:經(jīng)典的ISCOMTM和ISCOMATRIXTM,前者由皂苷、膽固醇、磷脂和抗原混合而成,而后者則不包含抗原。經(jīng)典的ISCOM疫苗需要在與皂苷、膽固醇和磷脂形成的結(jié)構(gòu)中添加兩親性蛋白(如膜蛋白),這限制了可以用于制備ISCOM疫苗的蛋白類(lèi)型,并且制備過(guò)程復(fù)雜,難以控制和復(fù)制[5,12]。相比之下,ISCOMATRIXTM佐劑的制備工程更加簡(jiǎn)單,幾乎可以與任何抗原配制,其活性成分皂苷可以從多種天然植物中提取,來(lái)源豐富且安全無(wú)毒,表現(xiàn)出強(qiáng)有力的佐劑活性[13-16]。因此,ISCOMATRIXTM佐劑更廣泛地用于腫瘤疫苗的制備和開(kāi)發(fā)。

ISCOMATRIX佐劑表現(xiàn)出卓越的抗原呈遞和免疫刺激功能。在接受ISCOMATRIX疫苗后,抗原主要由樹(shù)突狀細(xì)胞接受并進(jìn)行交叉呈遞,進(jìn)入MHC Ⅰ類(lèi)分子提呈途徑,從而啟動(dòng)淋巴結(jié)和脾組織中免疫細(xì)胞的募集[17-18],這對(duì)于誘導(dǎo)激活殺傷性T細(xì)胞反應(yīng)至關(guān)重要。有研究[19]證實(shí),ISCOMATRIX佐劑能夠誘導(dǎo)均衡的Th1/Th2應(yīng)答,并且在禽偏肺病毒(aMPV)滅活疫苗中,含有ISCOMATRIX的疫苗可促進(jìn)雞脾組織中IFN-γ和IL-4的表達(dá),增強(qiáng)B細(xì)胞和T細(xì)胞的免疫活性,為感染宿主提供長(zhǎng)期針對(duì)MPV/B的保護(hù)。此外,Ⅱ期臨床試驗(yàn)[20]結(jié)果表明,黑色素瘤患者接受含有ISCOMATRIX的重組NY-ESO-1蛋白疫苗后產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng),包括NY-ESO-1特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞以及抗體水平顯著增加,這降低了黑色素瘤完全切除后的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。值得注意的是,ISCOMATRIX佐劑制備的H1299細(xì)胞裂解疫苗不僅增強(qiáng)了對(duì)CT抗原的免疫應(yīng)答,還能夠調(diào)節(jié)外周免疫亞群,減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)和單核細(xì)胞上PD-1的表達(dá),從而促進(jìn)免疫活性環(huán)境[21],表明ISCOMATRIX佐劑可抵抗腫瘤誘導(dǎo)的全身性免疫抑制。腫瘤浸潤(rùn)的CD8+T細(xì)胞隨著腫瘤的進(jìn)展而逐漸耗竭,抗腫瘤能力減弱,但I(xiàn)SCOMATRIX佐劑與Toll樣受體3激動(dòng)劑、多肌苷多胞酸(Poly I:C)以及Flt3L、FMS樣酪氨酸激酶3配體的治療性癌癥疫苗聯(lián)合應(yīng)用似乎能夠扭轉(zhuǎn)這一困境,該聯(lián)合佐劑疫苗策略能夠通過(guò)激活NK細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)抗腫瘤作用,從而實(shí)現(xiàn)了腫瘤的消退[22]。ISCOMATRIX佐劑明顯促進(jìn)了NK細(xì)胞的增殖和功能激活,這在其他佐劑的作用中并未觀察到,而在免疫原性較弱的腫瘤治療中,NK細(xì)胞具有重要作用。ISCOMATRIX佐劑也增強(qiáng)了CD4+T細(xì)胞的應(yīng)答,維持抗腫瘤免疫記憶。此外,ISCOMATRIX佐劑與其他佐劑聯(lián)合應(yīng)用時(shí),可發(fā)揮更強(qiáng)大的抗腫瘤效應(yīng),因?yàn)椴煌?lèi)型的佐劑具有不同的作用機(jī)制,能夠通過(guò)同時(shí)激活多種免疫細(xì)胞和機(jī)制來(lái)誘導(dǎo)互補(bǔ)或協(xié)同的免疫應(yīng)答,從而獲得比單一佐劑更強(qiáng)大的抗腫瘤免疫效應(yīng)[23]。

本課題組自行制備ISCOMATRIX佐劑已取得了初步成功[8],采用透析法制備的自制ISCOMATRIX納米顆粒的特性與之前的研究[24]結(jié)果一致。ISCOMATRIX的主要成分Quil A具有一定的溶血性和毒性,根據(jù)小鼠毒性實(shí)驗(yàn)[25]的結(jié)果,疫苗中Quil A的安全劑量范圍為5～25 μg·只-1,當(dāng)劑量達(dá)到30～50 μg·只-1時(shí),小鼠開(kāi)始出現(xiàn)毒性反應(yīng),包括精神萎靡、行動(dòng)遲緩和被毛逆立等癥狀,但并不致死,劑量為50 μg·只-1時(shí)小鼠出現(xiàn)溶血等嚴(yán)重不良反應(yīng)并可導(dǎo)致死亡。因此本研究使用了5、12、18和36 μg的Quil A劑量并探索其對(duì)小鼠的免疫活性,以篩選既安全又具有高免疫效力的自制ISCOMATRIX劑量。結(jié)果顯示,即使在最大劑量(36 μg Quil A)下,小鼠也沒(méi)有出現(xiàn)不良癥狀,表明本研究自制ISCOMATRIX佐劑在最大劑量以下是安全可用的。在本課題組早期已經(jīng)成功使用商業(yè)化ISCOMATRIX聯(lián)合CpG制備了HCA587蛋白疫苗,這種疫苗顯著誘導(dǎo)了小鼠高水平的HCA587特異性免疫反應(yīng)[26]。在本研究結(jié)果表明,12和36 μg的自制ISCOMATRIX與HCA587蛋白疫苗聯(lián)合可刺激小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫應(yīng)答,導(dǎo)致脾細(xì)胞中分泌IFN-γ的頻數(shù)顯著增加,與商品化ISCOMATRIX聯(lián)合的效果一致。盡管腫瘤疫苗的抗腫瘤效應(yīng)主要由細(xì)胞免疫介導(dǎo),但體液免疫應(yīng)答的協(xié)同抗瘤作用也十分重要[27]。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,12、18和36 μg 的自制ISCOMATRIX與商業(yè)化ISCOMATRIX誘導(dǎo)的抗HCA587抗體滴度相當(dāng),甚至在1×104倍稀釋時(shí)稍顯優(yōu)勢(shì),說(shuō)明自制的ISCOMATRIX佐劑能夠有效地將傳遞抗原信息給B細(xì)胞,激發(fā)體液免疫應(yīng)答。ELISpot和ELISA的結(jié)果確定了12 μg 為自制ISCOMATRIX作為HCA587蛋白疫苗聯(lián)合佐劑的最佳劑量。在黑色素瘤小鼠模型中,自制ISCOMATRIX聯(lián)合HCA587蛋白疫苗能夠顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng),表現(xiàn)出的抗腫瘤能力與商業(yè)化ISCOMATRIX聯(lián)合HCA587蛋白疫苗相當(dāng)[7]。此前研究[7,28]也表明,HCA587蛋白疫苗能夠增強(qiáng)荷瘤小鼠的IFN-γ+CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答,降低腫瘤局部Tregs水平,減少其中血管生成,自制ISCOMATRIX將使對(duì)HCA587蛋白疫苗抗腫瘤機(jī)制的進(jìn)一步的研究變得更加便利。

NY-ESO-1/ISCOMATRIX腫瘤疫苗治療晚期黑色素瘤的臨床試驗(yàn)[29]顯示,腫瘤疫苗的治療效果與腫瘤內(nèi)Treg細(xì)胞數(shù)量密切相關(guān)。一些腫瘤疫苗會(huì)誘導(dǎo)晚期黑色素瘤患者體內(nèi)特異性Treg擴(kuò)增,導(dǎo)致腫瘤免疫受到抑制,這也是單純使用ISCOMATRIX疫苗治療難以使腫瘤消退的一個(gè)重要原因[30]。而ISCOMATRIX疫苗與靶向消除Treg的免疫制劑(如TLR3/9激動(dòng)劑和環(huán)磷酰胺)的聯(lián)合治療策略在對(duì)抗Treg介導(dǎo)的免疫逃逸或耐藥性腫瘤中表現(xiàn)出了卓越的抗腫瘤能力。此類(lèi)聯(lián)合治療策略不僅能夠誘導(dǎo)抗原特異性的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答,還能夠阻止Treg在腫瘤內(nèi)發(fā)揮免疫抑制作用,最終導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈的阻遏[31-34]?；谧灾艻SCOMATRIX佐劑制備的HCA587蛋白疫苗顯著減緩了黑色素瘤的生長(zhǎng),該疫苗有望與其他免疫制劑聯(lián)合使用,為晚期黑色素瘤患者提供了新的治療手段。

然而,本研究存在一些不足之處。一方面,Quil A作為ISCOMATRIX佐劑的重要成分,其有效劑量是根據(jù)Quil A濃度梯度來(lái)確定的,但這并不能代表實(shí)際制備有效佐劑所需的最佳劑量,構(gòu)建有效的佐劑往往需要更大量的皂苷[35]。另一方面,本研究采用透析法制備ISCOMATRIX佐劑,在制備過(guò)程中透析時(shí)間較長(zhǎng),洗滌劑(Mega-10)的濃度是決定透析時(shí)間的關(guān)鍵因素。為了更短的時(shí)間內(nèi)充分去除洗滌劑,可考慮選擇更大體積的透析袋/管,或采用分袋/管透析,以增大透析液的表面積與體積比[36]。

綜上所述,本課題組自制ISCOMATRIX聯(lián)合CpG組成的HCA587蛋白疫苗能顯著誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生HCA587特異性的細(xì)胞與體液免疫應(yīng)答,且能在小鼠體內(nèi)發(fā)揮顯著的腫瘤治療作用。