牛病毒性腹瀉病毒流行特點與診斷預防措施研究

■ 劉建慧 馬思雯 張永明，* 王 茜 趙雪城 張凱凱 胡 偉

（1.內(nèi)蒙古師范大學，內(nèi)蒙古呼和浩特 010000；2.內(nèi)蒙古大溪生物科技有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010000）

牛肉是人們特別喜愛的肉類食物之一，由于牛肉具有獨特鮮美的口感，含有充足的蛋白質(zhì)，分解出的氨基酸與人體的需求比較接近，對人體有很好的促進康復和保健的功效，在日常生活中深受大家的青睞。若病牛的肉和血清被當作食物和生物輔料，會嚴重威脅到人類健康。

牛病毒性腹瀉（bovine viral diarrhea, BVD）是通過一種牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染的傳染性疾病，也是妨礙母牛正常繁殖，感染各年齡階段牛的呼吸消化系統(tǒng)并造成損傷的一種免疫抑制疾病[1]。該病最早發(fā)生于美國，典型癥狀是腹瀉，其他癥狀有高熱、萎靡不振、厭食、流鼻涕和唾液增多等。作為牛或其他動物的常見疾病，BVDV的傳染方式種類繁多，可通過接觸病牛而被感染，也可通過環(huán)境污染，使牛或者其他動物的呼吸道和消化道被感染[2]。BVDV 不是只存在牛群中，它還可以感染豬[3]、駱駝及其他反芻動物[4]。牛病毒性腹瀉病呈世界流行性分布，一旦發(fā)病會給牛場帶來極大的經(jīng)濟損失。

牛病毒性腹瀉的病原也可稱為牛病毒性腹瀉-黏膜 病 病 毒（bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD）[5]。該病毒為直徑40～65 nm 的粒狀球形，且只有一個病毒髓核，髓核的直徑為24～30 nm。BVDV屬于基因組長12.3～12.5 kb的單股正鏈RNA病毒，由一個開放閱讀框（ORF），5’-UTR 和3’-UTR 構成。不同BVDV毒株的5’-UTR 基因序列有高度的保守性，根據(jù)其基因序列的不同BVDV 可分為1 型和2型，到現(xiàn)在為止，1 型BVDV 已有22 個基因亞型（1a～1v），2 型BVDV 有4 個基因亞型（2a～2d）[6]。BVDV 對外部環(huán)境抵抗力很弱，但在低溫的條件下仍具有一定的穩(wěn)定性，在真空且凍干后放于-60～-70 ℃可以保留數(shù)年，在26～37 ℃能夠保存24 h，但是大部分病毒都喪失了活性，在56 ℃下幾分鐘內(nèi)就能完全喪失活性[7]。

BVDV 有兩種生物型，分別是致細胞病變型（CP）和非致細胞病變型（NCP）。BVD-MD 的持續(xù)性感染主要是由非致細胞病變性毒株引起的，且致細胞病變毒株一般不會引起持續(xù)感染，目前的BVD-MD 疫苗株大部分都是致細胞病變株。

1 牛病毒性腹瀉的流行病學特點

1.1 傳染源和傳播途徑

牛病毒性腹瀉病的傳染源是病畜和帶毒的動物，其排出的糞、尿等排泄物及精液等均可致病，其他致病因素還有血液、流產(chǎn)胎兒等[8]，如果不及時發(fā)現(xiàn)并采取措施，可能會造成畜牧場病毒大面積暴發(fā)。該病還可以經(jīng)過牛的口、呼吸道和消化道感染，病畜通過咳嗽使空氣中帶病毒，使其他動物被傳染。病毒還可以通過牛的胎盤發(fā)生垂直式感染[9]，此時胎兒沒有任何免疫能力，導致病毒在體內(nèi)繁殖，攜帶病毒直至死亡，且死亡后需要立即進行無害化處理以切斷傳播途徑。也可由帶毒者的排泄物等引起水平式傳播感染。本病的傳播方法有直接和間接兩種，一般自然潛伏2～14 d，分為急性感染和慢性感染兩種。病毒也存在于雄性牛的精液中，以自然或人工受精兩種方式向母牛傳播。

1.2 容易感染的群體

該病易感染不同品種、不同年齡的牛，而且肉牛相對于奶牛更易被感染；除在牛群里傳播外，也會感染綿羊、山羊、羊駝和豬等家畜及駱駝等反芻動物、鹿和袋鼠等其他野生動物。

1.3 流行特點

BVDV 現(xiàn)已在世界各地存在并傳播，呈現(xiàn)一種全球化的趨勢，一般流行方式有地方性和季節(jié)性。地方性表現(xiàn)在：在畜牧業(yè)發(fā)達的國家較易發(fā)生，也會在封閉式的養(yǎng)殖場突然暴發(fā)，一般多呈現(xiàn)隱性感染的狀況。季節(jié)性表現(xiàn)在：一年四季都實際存在，以春秋兩季多見。BVDV 自然感染的情況每年都會發(fā)生[10]，各個年齡階段牛的易感率和患病率不同，6 個月以下的小?；疾÷实?，是因為母源抗體的存在；8～24 月齡患病最常見；3～18 個月齡的牛犢具有很高的易感性，臨床表現(xiàn)也較好；其他年齡階段的牛感染一般為隱性感染。此病的發(fā)病率約為5%，死亡率超過90%。

1.4 流行狀況

BVD 第一次出現(xiàn)于1946 年的北美洲地區(qū)，且于1971年被正式命名。我國出現(xiàn)BVD 是由于1980年自國外引進牛并將病毒帶入，由于管控不當對家畜和其他野生動物造成了不同程度的感染[11]。我國學者隨后開始對該病毒的研究，李佑民等[12]在1983首次分離并且鑒定到毒株。緊接著大量研究人員開始調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，感染BVDV 的省市有20多個[13]。到現(xiàn)在為止BVDV感染情況日益擴大。

2 臨床癥狀

該病的臨床表現(xiàn)有腹瀉、發(fā)熱、黏膜糜爛、萎靡不振、厭食、免疫力低、白細胞數(shù)量下降和母牛繁殖受阻等，其嚴重程度與病程、發(fā)病時長和是否繼發(fā)感染密切相關，一般1～14 d為牛群自然感染潛伏期，14～21 d是牛群人工感染潛伏期[14]?？蓪VDV 感染后分為亞臨床感染、急性感染、持續(xù)性感染和黏膜病等類型[15]。

2.1 亞臨床感染

亞臨床感染為自然情況下的一般類型。通過研究發(fā)現(xiàn)，人工感染牛身后出現(xiàn)發(fā)熱現(xiàn)象，但持續(xù)時間不超過2 d，在感染后的第13 天，淋巴組織未檢測到抗原[16]。該感染類型也從側面解釋了畜牧場的牛群雖然未接種疫苗，但仍能從體內(nèi)檢測到BVDV 抗體?？傊?，該類型感染后臨床癥狀并不明顯，但奶牛有特殊的癥狀，其產(chǎn)奶量會有下降趨勢。

2.2 急性感染

大多數(shù)BVDV 感染后的類型為急性感染。BVDV的兩種生物類型即NCP 型和CP 型均會引起急性感染，其NCP 型在感染中占主導地位[17]。急性感染牛表現(xiàn)為高熱、腹瀉、黏膜潰爛、免疫系統(tǒng)受到抑制、血小板和白細胞減少和繁殖障礙等癥狀[18]。感染牛癥狀的輕重由病毒毒力決定，與病牛自身的免疫系統(tǒng)狀態(tài)相關，也會受到環(huán)境因素的影響。急性型大部分是被同一種BVDV 反復感染所致，犢牛和免疫系統(tǒng)健全的育成牛急性感染率較高[19]。

2.3 持續(xù)性感染

持續(xù)感染（PI）是最特別的一類，在妊娠期（第45～130 天）母牛接觸并感染NCP 型BVDV，病毒越過母體胎盤的保護屏障使腹中的胎兒致病[20]，期間可能有流產(chǎn)等征兆。這類胎兒出生后就成了終生帶毒和散播病毒的牛[21]，簡稱為持續(xù)感染牛（PI牛）。引起PI牛感染的原因是小牛胎兒免疫系統(tǒng)沒有發(fā)育完全，病毒在胎兒體內(nèi)不斷傳播感染，形成持續(xù)感染的BVDV[22]，導致體內(nèi)不能有效識別和清除病毒。CP 型和NCP 型BVDV 均可透過胎盤渠道感染新生胎兒，但是前者可由胎兒免疫系統(tǒng)清除，后者則在體內(nèi)持續(xù)感染[23]，且兩者之間可互相轉換。由于體質(zhì)獨特，PI牛在飼養(yǎng)場中里成為了很大的致病源。因此，對于PI牛的發(fā)現(xiàn)和及時清除可降低BVDV感染率。

2.4 黏膜病

黏膜病是臨床上最可怕的一種類型，發(fā)病率約為5%，一旦發(fā)病死亡機率趨近于100%[24]。病牛癥狀表現(xiàn)為體溫較高、呼吸急促、糞便帶血、呼出的氣味極臭、胃黏膜和腸黏膜大面積潰瘍糜爛等[25]。另外，黏膜病還會造成血液中白細胞數(shù)量和血小板均會減少，引起免疫抑制，從而極易被其他病原感染。

3 科學的診斷

初步診斷可以根據(jù)臨床表現(xiàn)和流行病學來判斷，如果想要進一步確診，可以采用血清學試驗、病毒分離和PCR 技術等手段。這些檢測方法各有各的優(yōu)缺點，可根據(jù)試驗條件和成本考慮，從中選擇最優(yōu)的檢測方法。

3.1 血清學試驗檢測

研究牛BVD，血清學試驗是一項十分重要的檢測方法與手段。常用的方法有中和試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫瓊脂擴散、免疫過氧化物酶技術（IPT）和蛋白A 膠體免疫電鏡技術。其中中和試驗是實驗室常規(guī)使用的方法之一，但是有部分局限性，即疑似牛不能確診，達不到完全清除病牛的目的。

ELISA 是經(jīng)典的測試方法，也是一種主要的診斷方法。此方法簡單快速，特異性良好，但是在制備抗原中存在較大的困難和挑戰(zhàn)，并且在檢測抗體時對于PI牛等各種因素都很難被檢測到，有時還會出現(xiàn)假陽性等問題，這些方面需進一步改進[26]。免疫瓊脂擴散法一般常用于獸醫(yī)部門檢測，有簡單方便、具有群特異性等優(yōu)點，但是準確性不高，敏感性低于中和試驗。IPT 現(xiàn)在被應用于抗原的總體分布檢測和抗體檢測，實驗期間可以用顯微鏡觀察細胞的顏色進行判斷，是診斷BVDV 比較準確的方法之一。蛋白A 膠體免疫電鏡技術是采用電鏡觀察法，觀察病毒的形態(tài)，這種方法的缺點是尋找病毒顆粒時會受到相似形態(tài)顆粒的干擾，不適合大量樣本的篩選。

3.2 病毒分離

病毒分離法可以應用于胎牛腎（MDBK）細胞、肺原代細胞的檢驗，小犢牛的睪丸細胞也很容易被病毒感染[27]，最常用細胞MDBK 細胞分離病毒[28]。根據(jù)病毒分離選擇的結構組織，把動物的組織病料進行研磨和無菌處理后，再接種到對BVDV敏感的細胞上，70 h后觀察是否有BVDV 的特征性病變，從而判斷此牛是否患有該病[29]。但是這種方法既耗時又耗費精力，有些病毒的分離率也比較低，對于大規(guī)模的檢測并不適用。

3.3 PCR技術檢測

聚合酶鏈式反應（PCR）是生物體外進行的DNA擴增反應，具有快速、特異性強、敏感度高、模板取材、可擴增mRNA 等特點，可使需要的基因片段大量擴增。PCR 技術檢驗是核酸對病毒病原體進行檢測和鑒定的一種方法，操作簡單方便，反應快速靈敏，但實驗過程中存在樣品污染導致假陽性的出現(xiàn)，也有突變率較高的病毒易出現(xiàn)假陰性的情況[30]。近年來不斷發(fā)展的熒光定量PCR技術是一種新檢驗技術，其將傳統(tǒng)的PCR與熒光檢測方法進行結合檢測，這種方法是對需檢測的樣品中的特定DNA 序列處理，然后對其進行熒光定量分析。陳其兵等[32]根據(jù)BVDV的5'UTR保守序列設計特異性引物和探針，從而去優(yōu)化建立了熒光定量PCR 檢測方法。與RT-PCR 檢測方法相比，它具有操作簡單方便、自動化程度高、高靈敏度、特異性更強、結果可觀、重復性好等優(yōu)點，而且還能有效降低污染風險，對BVDV 也能進行早期的診斷與判斷[31]，及時發(fā)現(xiàn)病原，并能快速準確地實施檢測，現(xiàn)已成為檢測病原的重要手段。但這種方法對機器要求高。還有一種LAMP 檢測方法，是應用核酸新型檢測技術，主要觀察反應過程中生成的白色沉淀焦磷酸鎂。此方法簡單方便、反應快速、靈敏度高、特異性強、實驗結果顯著，但是對引物要求比較高和嚴格[33]。

4 預防措施和防控建議

牛病毒性腹瀉病與牛群的環(huán)境衛(wèi)生以及養(yǎng)殖戶的飼養(yǎng)管理密切相關，因此，為了預防這種疾病的蔓延，必須采用綜合性預防與治療措施，包括消毒與衛(wèi)生管理、疫苗接種、嚴格的檢疫，以及提高飼養(yǎng)管理水平及淘汰持續(xù)性感染牛等。

4.1 消毒與衛(wèi)生管理

在日常飼養(yǎng)中應定期清掃牛棚，并選擇合適的消毒藥劑與消毒藥品進行消毒處理，從而切斷感染和傳播途徑[34]。同時也要及時消滅、驅(qū)除養(yǎng)殖場的蚊、鼠及其他有害動物，以預防中間宿主的感染。

4.2 疫苗接種

臨床試驗表明，根據(jù)本地區(qū)養(yǎng)殖場牛病毒性腹瀉流行病學的實際情況，針對性接種牛病毒性弱毒疫苗和豬瘟兔化弱毒疫苗等，可以高效地預防BVDV 感染。其中6～8 個月犢牛期是牛病毒性腹瀉極易感染的時期，這時犢牛的抵抗力比較差，并且牛乳中所含母源抗體含量下降，應當根據(jù)要求及時進行安全、高效的減毒或弱毒性疫苗的接種[35]。

4.3 檢疫預防

牛場必須建立健全衛(wèi)生檢疫體系，定期監(jiān)測牛群的病毒性腹瀉病毒，規(guī)范養(yǎng)殖戶的引種行為，避免不同來源的動物在同一個圈舍中飼養(yǎng)[36]，一旦發(fā)現(xiàn)BVDV 感染牛，立刻進行隔離處理，要進行無害化處理，避免疾病在牛群中的傳播與感染。嚴禁從疫區(qū)進口牛，且牛只買賣、運輸時要加強隔離，防止該病毒的擴散與傳播。對于進口肉類、乳制品、生物制品也要嚴格隔離，進一步阻斷傳染[37]。

4.4 提高飼養(yǎng)管理水平

養(yǎng)殖戶在飼養(yǎng)中要增強對飼料的管控，各年齡段的奶牛都要供應平衡的營養(yǎng)飼料，禁止喂食霉變的飼料，也要注意維生素的補充，提高牛群的身體免疫力，同時要強化養(yǎng)殖場的衛(wèi)生和水源管理，定期清除水體中的細菌，減少BVDV感染的可能性。

4.5 淘汰持續(xù)性感染牛

PI牛是BVDV 最大的傳染源，在診治過程中要早期篩查發(fā)現(xiàn)并淘汰，這一措施對本病的防控具有重要的意義。這是對BVDV 進行有效地控制與凈化的最佳辦法，是保障牛群長期安全的重要手段。

4.6 研發(fā)疫苗

疫苗也是很重要的一環(huán)，要積極鼓勵，研究院所和科研單位、牛場進行BVDV 疫苗的研制工作?，F(xiàn)疫苗有兩類，分別為BVDV 弱毒疫苗和BVDV 滅活疫苗。前者能夠產(chǎn)生較強的免疫力，但個別疫苗株對后代有不良影響及疾病缺陷；后者的安全性高，但效力不如前者。近年來，生物信息技術迅猛發(fā)展，出現(xiàn)了一種新的疫苗研發(fā)手段，即多表位基因疫苗，與其他疫苗相比，此疫苗具有穩(wěn)定性高、生物安全性高、過敏率低和方便合成等特點[38]。滅活疫苗的制備一般是通過懸浮培養(yǎng)工藝完成，同時發(fā)現(xiàn)反應器規(guī)?；苽淇梢宰鳛槲磥硪呙绨l(fā)展的主要方向[39]。

5 小結

總之，BVD是一種常見的傳染性疾病。在防控牛BVD 時要遵守防大于治的原則，從源頭上遏制其蔓延，一旦發(fā)現(xiàn)可疑病例，應馬上進行隔離。另外，在對該疾病進行診斷的過程中，要根據(jù)臨床表現(xiàn)和流行病學特點制訂相應的對策，以提高治療效果。養(yǎng)殖戶必須高度重視對該病的診斷和治療，做好后續(xù)的預防工作，制訂科學的免疫計劃，并采取相應的預防和治療措施以降低患病率。