巖黃連總堿下調(diào)miR-223表達調(diào)控人牙齦成纖維細胞增殖與凋亡的分子機制研究

謝陸莉,李 鯤,鄧 琳

(成都市龍泉驛區(qū)第一人民醫(yī)院口腔科,四川 成都 610100)

牙周炎是一種高發(fā)的感染性疾病,以牙齦炎癥、牙槽骨吸收和牙齒松動甚至脫落為特征[1-2];細菌感染牙齦介導(dǎo)的炎癥細胞因子的釋放是牙周炎牙齒脫落的主要原因之一[3-5]。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)是牙周炎的主要致病菌,脂多糖(Lipopolysacharide,LPS)是主要作用因子,其可破壞牙周組織細胞進而促進牙周炎發(fā)展進程[6-7]。因而抑制牙齦卟啉單胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,Pg-LPS)的毒性作用是緩解牙周炎的重要途徑。巖黃連總堿是巖黃連的主要有效成分,具有抗炎、抗菌和抗氧化等作用[8]。研究[9]顯示,巖黃連總堿在體外可抑制Pg的生長,但巖黃連總堿對牙周炎的影響尚未闡明。miR-223是牙周炎組織中表達較高的微小RNA(microRNA,miRNA)之一,與牙周炎患者的血清和齦溝液中炎癥介質(zhì)水平升高有關(guān)[10-11]。據(jù)報道,miR-223高表達可促進炎性反應(yīng),加重人牙齦成纖維細胞損傷[12]。磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)信號通路是miR-223發(fā)揮炎癥調(diào)節(jié)劑作用的通路之一[13]。研究[14]顯示,miR-223可通過激活PI3K/AKT通路引發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠細胞凋亡和炎性反應(yīng)。抑制PI3K/AKT通路的激活可減輕LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞的炎性反應(yīng)[15],并可抑制牙周炎大鼠牙槽骨的丟失[16]。因此,本研究采用Pg-LPS誘導(dǎo)人牙齦成纖維細胞建立細胞炎癥模型,探討巖黃連總堿對Pg-LPS誘導(dǎo)人牙齦成纖維細胞增殖、凋亡和炎性反應(yīng)的影響及其對miR-223/PI3K/AKT信號通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 巖黃連總堿(純度≥98%,上海西格生物科技有限公司);Pg-LPS(上海研卉生物);Lipofectamine2000(美國Thermo Fisher);人牙齦成纖維細胞(武漢普諾賽生命科技有限公司);miR-223 mimics、miR-NC、anti-miR-223、anti-miR-NC(廣州銳博生物);MTT試劑與凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶);白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(上海酶聯(lián));兔抗人pro-caspase-3、Cleaved-caspase-3(美國Santa Cruz);兔抗人PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT抗體(美國CST)。

1.2 實驗方法

1.2.1 巖黃連總堿對人牙齦成纖維細胞的細胞毒性作用:人牙齦成纖維細胞以每孔2×104個細胞接種于96孔板中,使用終濃度為5、10、20、40、80、160 μg/ml的巖黃連總堿處理24 h,每孔加入20 μl的MTT溶液(PBS緩沖液制成5 mg/ml溶液),37 ℃避光孵育4 h,再加入150 μl DMSO溶液,檢測酶標儀490 nm處吸光度值(A490 nm),計算細胞增殖活力(%)。

1.2.2 實驗分組:人牙齦成纖維細胞按照每孔1×104個接種于6孔板后分為對照組(NC組,未經(jīng)處理的人牙齦成纖維細胞)、Pg-LPS組(加入100 μg/ml的Pg-LPS處理24 h)、5 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS組、10 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS組和20 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS組(分別添加含有5、10、20 μg/ml巖黃連總堿與100 μg/ml Pg-LPS共同處理人牙齦成纖維細胞24 h),miR-NC+Pg-LPS組、miR-223+Pg-LPS組、anti-miR-NC+Pg-LPS組和anti-miR-223+Pg-LPS組(miR-NC、miR-223 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-223分別轉(zhuǎn)染至人牙齦成纖維細胞后加入100 μg/ml的Pg-LPS處理24 h),20 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS+miR-NC組和20 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS+miR-223組(miR-NC、miR-223 mimics分別轉(zhuǎn)染至人牙齦成纖維細胞后加入20 μg/ml巖黃連總堿與100 μg/ml Pg-LPS共同處理人牙齦成纖維細胞24 h)。

1.2.3 EDU檢測細胞增殖:將各組人牙齦成纖維細胞(1×106個/ml)接種于12孔板(200 μl/孔),加入EDU工作液(20 μmol/L)孵育2 h,用4%固定液固定15 min后,加入1 ml 0.3% Triton X-100,加入DAPI染色液孵育30 min,熒光顯微鏡下觀察,藍色為細胞核,綠色為EDU陽性細胞(增殖細胞),計算EDU染色陽性率(EDU陽性細胞數(shù)/DAPI染色總細胞數(shù)×100%)。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率:收集各組人牙齦成纖維細胞并用500 μl Binding buffer重懸,分別加入Annexin V-FITC(5 μl)與PI(5 μl),室溫避光孵育10 min,用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 RT-qPCR檢測miR-223的表達水平:采用Trizol法提取細胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進行RT-qPCR擴增。應(yīng)用ABI Step One Plus熒光定量PCR儀檢測miR-223相對表達量。引物序列:miR-223正向5’-CGGACGTGTATTTGACAAGC-3’和反向5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3’;U6正向5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’和反向5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。

1.2.6 ELISA法測定炎癥因子IL-1β、TNF-α表達水平:將各組細胞培養(yǎng)上清液離心(1000 g、10 min),取上清液,ELISA試劑盒檢測IL-1β、TNF-α表達水平。

1.2.7 Western blot檢測Cleaved-caspase-3、pro-caspase-3和PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達水平:RIPA裂解液提取細胞總蛋白,蛋白變性后進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)膜、封閉2 h,孵育pro-caspase-3(1∶1000)、Cleaved-caspase-3(1∶800)、PI3K(1∶1000)、p-PI3K(1∶1000)、AKT(1∶1000)、p-AKT(1∶1000)一抗與β-actin抗體稀釋液(1∶1000),4 ℃孵育過夜,加入二抗稀釋液(1∶2000),室溫孵育1 h后加入電化學(xué)發(fā)光試劑顯影,用Image J軟件分析各條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 巖黃連總堿對人牙齦成纖維細胞的毒性作用 與0 μg/ml組比較,使用5、10、20、40 μg/ml的巖黃連總堿處理人牙齦成纖維細胞24 h后,細胞增殖活力無顯著變化(均P>0.05),而80、160 μg/ml巖黃連總堿可顯著降低人牙齦成纖維細胞的增殖活力(均P<0.05),見圖1。因此,選擇5、10、20 μg/ml的巖黃連總堿進行后續(xù)實驗。

注:與0 μg/ml組比較,*P<0.05圖1 巖黃連總堿對人牙齦成纖維細胞增殖的影響

2.2 巖黃連總堿對Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞增殖、凋亡和炎性因子水平的影響 與NC組比較,Pg-LPS組細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平以及IL-1β、TNF-α水平升高,EDU陽性細胞數(shù)減少(均P<0.05);與Pg-LPS組比較,5 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS組、10 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS組、20 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS組細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平以及IL-1β、TNF-α水平降低,EDU陽性細胞數(shù)增多(均P<0.05),不同劑量巖黃連總堿組間各指標比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

表1 巖黃連總堿對Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞增殖、凋亡與炎性因子水平的影響

2.3 巖黃連總堿對Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞中miR-223表達和PI3K/AKT通路的影響 與NC組比較,Pg-LPS組miR-223的表達量、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值升高(均P<0.05);與Pg-LPS組比較,5 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS組、10 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS組、20 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS組miR-223的表達量、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值降低(均P<0.05),不同劑量巖黃連總堿組間各指標比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 巖黃連總堿對Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞中miR-223表達和PI3K/AKT通路的影響

2.4 miR-223對Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞增殖、凋亡和炎性因子水平的影響 與miR-NC+Pg-LPS組比較,miR-223+Pg-LPS組細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平以及IL-1β、TNF-α水平升高,EDU陽性細胞數(shù)減少(均P<0.05);與anti-miR-NC+Pg-LPS組比較,anti-miR-223+Pg-LPS組細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平以及IL-1β、TNF-α水平降低,EDU陽性細胞數(shù)增多(均P<0.05)。見表3。

表3 miR-223對Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞增殖、凋亡和炎性因子水平的影響

2.5 miR-223對Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞中PI3K/AKT通路的影響 與miR-NC+Pg-LPS組比較,miR-223+Pg-LPS組p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值升高(均P<0.05);與anti-miR-NC+Pg-LPS組比較,anti-miR-223+Pg-LPS組p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值降低(均P<0.05)。見表4。

表4 miR-223對Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞中PI3K/AKT通路的影響

2.6 miR-223可以逆轉(zhuǎn)巖黃連總堿對Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞增殖、凋亡和炎性因子水平 與20 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS+miR-NC組比較,20 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS+miR-223組細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平以及IL-1β、TNF-α水平升高,EDU陽性細胞數(shù)減少(均P<0.05)。見表5。

表5 miR-223可以逆轉(zhuǎn)巖黃連總堿對Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞增殖、凋亡和炎性因子水平

2.7 miR-223可以逆轉(zhuǎn)巖黃連總堿對Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞中PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達 與20 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS+miR-NC組比較,20 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS+miR-223組p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值升高(均P<0.05),見表6。

表6 miR-223可以逆轉(zhuǎn)巖黃連總堿對Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞中PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達

3 討 論

牙齦成纖維細胞是牙周組織的主要細胞成分,參與牙周炎的發(fā)生發(fā)展過程。研究顯示,與健康人相比,慢性牙周炎患者牙齦成纖維細胞活性降低,細胞凋亡增加[17]。LPS是Pg外膜的重要毒力因子,可誘導(dǎo)人牙齦成纖維細胞產(chǎn)生IL-1β、TNF-α等炎性因子,促進炎性反應(yīng),加重牙周炎[7]。本研究發(fā)現(xiàn),Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞活力降低,細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高,而巖黃連總堿作用后Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞活力升高,細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平降低,提示巖黃連總堿可促進Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞增殖,抑制細胞凋亡。此外,巖黃連總堿可降低Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞中IL-1β、TNF-α水平,提示巖黃連總堿可抑制Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞炎性反應(yīng)。

miR-223參與感染、免疫反應(yīng)和多種炎癥性疾病的調(diào)節(jié)。已有研究證明,與健康牙齦相比,牙周炎患者牙齦組織中miR-223上調(diào)[18]。在牙周炎大鼠模型的血清中也發(fā)現(xiàn)了miR-223的上調(diào)表達[19]。此外,據(jù)報道,miR-223是牙周炎患者血清和齦溝液中過表達的miRNA之一[11]。miR-223通過靶向NLRP3促進LPS誘導(dǎo)人類牙髓成纖維細胞的炎性反應(yīng)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞中miR-223的表達量升高,抑制miR-223表達后Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞活力升高,凋亡能力和IL-1β、TNF-α水平降低,而過表達miR-223表現(xiàn)出相反作用,提示miR-223過表達可能促進牙周炎的發(fā)生。在本研究中,巖黃連總堿可降低Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞中miR-223的表達,且過表達miR-223可拮抗巖黃連總堿對Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞增殖及凋亡的作用,提示巖黃連總堿可能通過調(diào)控miR-223的表達而對Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞發(fā)揮保護作用。

此外,本研究發(fā)現(xiàn),巖黃連總堿可抑制Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞中PI3K/AKT通路的激活。PI3K/AKT信號通路在牙周炎中被激活,可導(dǎo)致核因子-κB(Nuclear factor κB,NF-κB)活化,促進牙周炎的發(fā)生及發(fā)展[21-22]。Jiang等[14]發(fā)現(xiàn),miR-223可通過激活PI3K/AKT信號通路促進潰瘍性結(jié)腸炎大鼠細胞凋亡和炎性反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞中p-PI3K、p-AKT蛋白水平升高,巖黃連總堿處理或抑制miR-223表達后p-PI3K、p-AKT蛋白水平降低,而過表達miR-223可降低巖黃連總堿對p-PI3K、p-AKT蛋白表達的抑制作用,提示巖黃連總堿可能通過下調(diào)miR-223表達,抑制PI3K/AKT通路的活化,進而抑制牙周炎的發(fā)生。

綜上所述,巖黃連總堿可促進Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細胞增殖,抑制細胞凋亡和炎性反應(yīng),可能是通過下調(diào)miR-223抑制PI3K/AKT信號通路實現(xiàn)的。由于miR-223基因序列上包含多個調(diào)控位點,巖黃連總堿通過何種途徑調(diào)控miR-223表達以及miR-223下游靶基因仍需進一步探究。