白藜蘆醇對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠p38絲裂原活化蛋白激酶/核因子-κB信號(hào)通路的影響

吳文婷,李 敏,蒲文娟

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,陜西 西安 710038)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種由于氣道或肺泡異常所引起的氣流受限的慢性呼吸道疾病,被認(rèn)為是“沉默的殺手”,已成為全球第四大致死疾病[1-3]。在我國(guó)COPD約有1億人,40歲以上人群患病率達(dá)13.7%,每年死亡病例超100萬例,是我國(guó)第三大疾病死因,對(duì)患者、國(guó)家、社會(huì)造成沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和衛(wèi)生資源消耗,因此已成為重要的公共衛(wèi)生問題[4]。目前COPD的治療手段尚不能令人滿意,深入探討COPD發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療藥物意義重大。白藜蘆醇是一種廣泛存在于藜蘆、葡萄、虎杖等植物中的多酚類化合物,具有抗腫瘤、抗氧化、抗凋亡、抗炎等作用,在COPD的抗炎治療中發(fā)揮重要作用[5-6]。因此本研究將采用煙霧聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)法使SD大鼠被動(dòng)吸煙建立COPD模型,探討白藜蘆醇對(duì)COPD大鼠肺組織病理、炎癥因子、氧化水平的影響及相關(guān)機(jī)制,為COPD的臨床治療及科研工作探索新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供的50只(200±20)g的SD雄性大鼠,合格證書為SCXK(滬)2021-0002,并飼養(yǎng)于環(huán)境溫度為(20±2)℃條件下,自由飲食和攝水。本實(shí)驗(yàn)通過本院的倫理審查。

1.2 主要試劑及儀器 白藜蘆醇購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;兔抗p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子κB抑制因子α(IκB α)、核因子-κB p65(NF-κB p65)及GAPDH多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA)含量檢測(cè)試劑盒及DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司;腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒均自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。ELX800酶標(biāo)分析儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司;Chemi DocTMXRS凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)伯樂公司。

1.3 建模及分組[7-9]50只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字法分為正常組,模型組,白藜蘆醇低劑量組、白藜蘆醇中劑量組、白藜蘆醇高劑量組,每組10只。模型組、白藜蘆醇組均采用煙熏聯(lián)合氣管內(nèi)滴加脂多糖建立COPD大鼠模型:在造模的第1、14天將大鼠麻醉,固定于操作臺(tái),向大鼠氣管緩慢注入200 μg/ml(200 μl)脂多糖,結(jié)束后大鼠直立旋轉(zhuǎn)15 s,以使脂多糖均勻分布于大鼠肺部。在造模的第2～13天,第15～28天每天將大鼠置于制作好的透明的煙熏箱(120 cm×80 cm×80 cm,有1個(gè)進(jìn)煙孔、2個(gè)排煙孔)中進(jìn)行煙霧暴露,持續(xù)吸入香煙煙霧1 h/d,至第28天結(jié)束。使用肺功能測(cè)定儀檢測(cè)大鼠肺功能,并觀察大鼠肺組織病理變化來判斷造模是否成功。正常組大鼠于第1、14天氣管內(nèi)注入于200 μl 0.9%氯化鈉溶液外,其余時(shí)間常規(guī)飼養(yǎng)。第29天開始進(jìn)行干預(yù),白藜蘆醇低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給予5、15、45 mg/(kg·d)白藜蘆醇,正常組及模型組給予等體積0.9%氯化鈉溶液,連續(xù)28 d。

1.4 HE染色觀察肺組織病理變化 石蠟包埋肺組織并切片,厚度約為4 μm,60 ℃烘烤40 min。二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水。蒸餾水浸泡后,蘇木素浸泡1 min,流水洗滌5 min。鹽酸乙醇分化5 s,伊紅溶液染色20 s,流水洗滌5 min。梯度酒精、二甲苯透明,采用中性樹脂封片,并自然干燥后顯微鏡下觀察。

1.5 分光光度法檢測(cè)血清中TNF-α、IL-8表達(dá)水平 取上清液嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 ELISA法檢測(cè)肺組織SOD活性及MDA、MMP-2、TIMP-1含量 應(yīng)用勻漿機(jī)對(duì)肺組織進(jìn)行勻漿后,加入組織裂解液裂解,取上清液嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 Western blot檢測(cè)肺組織中蛋白表達(dá) 在冰上加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取肺組織蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品與上樣緩沖液混勻后煮沸,根據(jù)目的蛋白分子量制作濃縮膠和分離膠。加入樣品后電泳,濃縮膠電壓80 V,分離膠電壓120 V,約2～3 h。取凝膠、濾紙、PVDF膜制作“三明治”進(jìn)行轉(zhuǎn)膜1 h。5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h,稀釋好的一抗溶液中4 ℃過夜;二抗溶液中37 ℃ 2 h。PVDF膜上滴加ECL曝光液,最后在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)變化 正常組肺泡清晰、形態(tài)大小均較為完整;模型組肺泡增大、肺泡壁變薄、肺泡腔擴(kuò)大,大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);白藜蘆醇組減少了炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),并使肺泡結(jié)構(gòu)變?yōu)檎Ｍ暾?。見圖1。

A:正常組;B:模型組;C:白藜蘆醇低劑量組;D:白藜蘆醇中劑量組;E:白藜蘆醇高劑量組圖1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)變化(HE染色,×200)

2.2 各組大鼠血清中TNF-α、IL-8表達(dá)水平及肺組織MDA含量、SOD活性比較 模型組中TNF-α、IL-8、MDA含量較正常組升高,SOD活性較正常組降低(均P<0.01)。白藜蘆醇低、中、高劑量組中TNF-α、IL-8、MDA含量較模型組降低,SOD活性較模型組升高(均P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血清中TNF-α、IL-8表達(dá)水平及肺組織MDA含量、SOD活性比較

2.3 各組大鼠肺組織MMP-9及TIMP-1表達(dá)量比較 模型組中MMP-9表達(dá)量較正常組升高、TIMP-1表達(dá)量較正常組降低(均P<0.01);白藜蘆醇低、中、高劑量組中MMP-9表達(dá)量較模型組降低,TIMP-1表達(dá)量較模型組升高(均P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1表達(dá)量比較(ng/mg)

2.4 各組鼠肺組織p38 MAPK、IκB α及NF-κB p65表達(dá)量比較 模型組中p38 MAPK、IκB α及NF-κB p65表達(dá)量較正常組上調(diào)(均P<0.01);白藜蘆醇低、中、高劑量組中p38 MAPK、IκB α及NF-κB p65表達(dá)較正常組下調(diào)(均P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠肺組織p38 MAPK、IκB α及NF-κB p65表達(dá)量比較

3 討 論

吸煙是COPD發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,因此在煙熏誘導(dǎo)下能夠構(gòu)建穩(wěn)定且與人類疾病相似的COPD模型[10-11]。本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-9],通過煙熏聯(lián)合脂多糖注射誘導(dǎo)法構(gòu)建COPD大鼠模型,模型組大鼠肺部組織有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡變大,肺泡腔擴(kuò)大,肺泡壁變薄,說明COPD大鼠構(gòu)建成功。白藜蘆醇是一種廣泛存在植物中的多酚類化合物,具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗凋亡、降低血脂及保護(hù)心血管等作用,且對(duì)COPD的治療具有一定的效果[5-6]。因此本研究將進(jìn)一步探討白藜蘆醇對(duì)COPD大鼠肺部組織損傷的影響及相關(guān)機(jī)制。

研究[12]認(rèn)為COPD的發(fā)病機(jī)制涉及到炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激及蛋白酶系統(tǒng)的失衡。慢性炎癥是COPD的主要特征,炎癥因子TNF-α與IL-8共同參與了COPD的炎性反應(yīng),TNF-α是多種炎癥因子的誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞活化,加重炎性反應(yīng)使氣道結(jié)構(gòu)重塑被破壞[12-13]。IL-8可進(jìn)一步地促進(jìn)淋巴細(xì)胞聚集及活化。本研究結(jié)果表明白藜蘆醇能顯著的降低COPD大鼠肺部組織中TNF-α與IL-8水平,進(jìn)而減輕炎性反應(yīng)。氧化應(yīng)激是COPD的發(fā)病機(jī)制之一,長(zhǎng)期暴露于有害顆粒環(huán)境下,COPD患者的抗氧化能力被減弱[14]。因此本研究接著探討白藜蘆醇對(duì)COPD大鼠肺部組織中MDA含量及SOD活性的影響,結(jié)果表明白藜蘆醇能提高SOD活性,降低MDA含量,進(jìn)而提高COPD大鼠的抗氧化能力。細(xì)胞外基質(zhì)合成酶與降解酶的失衡是導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡的重要原因,進(jìn)而導(dǎo)致氣道損傷及肺氣腫[12]。TIMP-1作為MMP-9內(nèi)源性抑制劑,通過抑制MMP-9活性而減少細(xì)胞外基質(zhì)的破壞程度。所以本研究進(jìn)一步探討白藜蘆醇對(duì)COPD大鼠肺部組織中MMP-9及TIMP-1含量的影響,結(jié)果表明白藜蘆醇能顯著的降低MMP-9表達(dá),提高TIMP-1表達(dá),進(jìn)而減輕COPD大鼠肺氣腫損傷。

p38 MAPK是MAPK家族的一員,能夠通過將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的信號(hào)傳遞給細(xì)胞核,引起細(xì)胞核結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生變化?；钚匝?、細(xì)胞因子、紫外線照射、高滲等因素均能激活p38 MAPK信號(hào)通路,并調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)而參與多種病理生理過程[15]。NF-κB是p38 MAPK的下游信號(hào)分子,p38 MAPK是氣道炎性反應(yīng)的始動(dòng)信號(hào)分子[16]。當(dāng)NF-κB的核定位信號(hào)被暴露后,會(huì)使NF-κB磷酸化,加快核轉(zhuǎn)入速度,介導(dǎo)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生及免疫細(xì)胞的增殖分化。有研究證實(shí)脂多糖能夠激活中性粒細(xì)胞,進(jìn)而使p38 MAPK磷酸化,進(jìn)一步激活NF-κB,增加TNF-α表達(dá),加重炎性反應(yīng)[17-18]。而且p38 MAPK已成為COPD治療新的分子靶點(diǎn),其抑制劑在COPD臨床治療中效果顯著[15,17],白藜蘆醇對(duì)p38 MAPK具有顯著調(diào)控作用[19-20]。因此本研究進(jìn)一步探討白藜蘆醇對(duì)COPD大鼠肺部組織中p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路的影響,Western blot結(jié)果表明白藜蘆醇能降低p38 MAPK、IκB α及NF-κB p65磷酸化水平,進(jìn)而抑制炎癥因子釋放,減少COPD大鼠肺部損傷。

綜上所述,白藜蘆醇能減少COPD大鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),減少TNF-α、IL-8分泌,提高SOD活性、TIMP-1表達(dá)量,降低MDA、MMP-9含量,其機(jī)制可能與阻斷p38 MAPK/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。但本研究?jī)H是實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果,結(jié)果的進(jìn)一步確認(rèn)需要結(jié)合信號(hào)通路抑制劑的使用或者基因敲除技術(shù)的結(jié)合。