羥氯喹通過(guò)Toll樣受體4/核因子-κB信號(hào)通路對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠肺損傷的影響

付永濤,王莉平,郭金明,張 娜,張紅霞,許 冰

(1.邯鄲市中心醫(yī)院,河北 邯鄲 056001;2.石家莊市第四醫(yī)院,河北 石家莊 050035;3.邯鄲市邯鋼醫(yī)院,河北 邯鄲 056001)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)臨床表現(xiàn)以紅斑皮疹為主并易累及肺、腎、心等器官組織,多發(fā)于育齡期女性。據(jù)統(tǒng)計(jì),50%～70%的SLE患者伴隨不同程度的肺損傷,可引發(fā)肺感染、間質(zhì)性肺疾病、肺栓塞、肺動(dòng)脈高壓、肺萎縮綜合征等肺部并發(fā)癥,是導(dǎo)致SLE患者死亡的主要因素[1]。SLE發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,其中炎性反應(yīng)在SLE發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,研究證實(shí),肺部炎癥是SLE肺損傷進(jìn)行性加重的重要病理通路[2]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路在炎性反應(yīng)調(diào)控機(jī)制中扮演著重要角色[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路能夠減輕SLE小鼠炎性反應(yīng)[4]。羥氯喹(Hydroxychloroquine,HCQ)是一種4-氨基喹啉衍生物,具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎等藥理學(xué)作用,目前主要用于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎以及毒性較小藥物療效不佳的自身免疫性疾病的治療。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)HCQ對(duì)SLE所致動(dòng)脈粥樣硬化、腎損傷等并發(fā)癥具有明顯的保護(hù)作用,其作用機(jī)制與抑制炎性反應(yīng)有關(guān)[5-6]。此外,HCQ可通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路減輕創(chuàng)傷性腦損傷小鼠神經(jīng)炎癥[7]。但HCQ是否對(duì)SLE肺損傷具有保護(hù)作用尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在探討HCQ對(duì)SLE模型小鼠肺損傷的影響,并基于TLR4/NF-κB信號(hào)通路探索其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 32只雌性MRL/lpr狼瘡小鼠(自發(fā)型SLE小鼠模型)和8只雌性C57BL/6小鼠購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2019-0010],7～8周齡,19～22 g。在室溫23～25 ℃、濕度45%～65%、12 h光暗交替的清潔環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器 HCQ片(上海上藥中西制藥公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H19990263,批號(hào)2022A04016);TAK242(TLR4抑制劑,美國(guó)CST公司);LPS(TLR4激動(dòng)劑,美國(guó)Sigma公司);抗核抗體(ANA)、抗雙鏈DNA(ds-DNA)ELISA法檢測(cè)試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所);干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6 ELISA法檢測(cè)試劑盒和RIPA裂解液、ECL顯色液(北京索萊寶生物科技公司);HE、Masson染色試劑盒和總RNA提取試劑盒、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)公司);RT-qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴(kuò)增試劑盒(日本Takara公司);IgG二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);TLR4、NF-κB p65、IκBα、β-actin抗體(英國(guó)Abcam公司)。PUR2型肺功能儀(法國(guó)EMKA公司);MK-3型酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃集團(tuán));RM2245型石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司);220R型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司);ETC811型PCR儀(北京東勝創(chuàng)新公司);552BR型電泳儀、Turbo System型電轉(zhuǎn)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組與給藥:8只雌性C57BL/6小鼠設(shè)為正常對(duì)照組。32只雌性MRL/lpr狼瘡小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、HCQ組、HCQ+TAK242組和HCQ+LPS組,每組8只。HCQ組灌胃(IG)給予80 mg/kg HCQ(根據(jù)人與小鼠劑量換算公式計(jì)算所得),HCQ+TAK242組IG給予80 mg/kg HCQ和腹腔注射(IP)給予0.3 mg/kg TAK242[8];HCQ+LPS組IG給予80 mg/kg HCQ和IP給予2.5 mg/kg LPS[8];正常對(duì)照組和模型組IG給予0.9%氯化鈉溶液,各組均1次/d給藥連續(xù)治療5周。

1.3.2 肺功能指標(biāo)檢測(cè):末次給藥2 h后,IP 0.3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉小鼠,連接肺功能檢測(cè)儀,待小鼠呼吸平穩(wěn)以后,測(cè)定肺功能指標(biāo),包括氣道阻力(Raw)、動(dòng)態(tài)肺順應(yīng)性(Cdyn)和第0.1秒用力呼氣容積(FEV0.1)。

1.3.3 ELISA法檢測(cè)肺泡灌洗液中炎癥因子表達(dá)水平:應(yīng)用注射器將1 ml磷酸鹽緩沖液緩慢注入小鼠肺組織,30 s后回抽并收集液體,重復(fù)灌洗3次,遵照ELISA法試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)肺泡灌洗液中炎癥因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)水平。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)血清免疫學(xué)指標(biāo)水平:摘眼球取血并分離血清,遵照ELISA法試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)血清免疫學(xué)指標(biāo)ANA、ds-DNA表達(dá)水平。

1.3.5 HE、Masson染色法觀察肺組織病理學(xué)改變和纖維化狀況:頸椎脫臼處死小鼠后,開(kāi)胸取肺臟,0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后,左肺組織置于-20 ℃保存?zhèn)錂z,將右肺組織置于10%中性甲醛溶液中固定72 h,然后依次行梯度乙醇溶液脫水、浸石蠟包埋、5 μm切片、展片和烤片處理,經(jīng)梯度乙醇溶液脫蠟水化后分別行HE染色和Masson染色。①通過(guò)觀察HE染色切片考察肺組織病理學(xué)改變,參照劉云濤等[9]報(bào)道的方法進(jìn)行肺組織病理評(píng)分:肺組織未見(jiàn)病理學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)改變,記0分;肺組織肺泡壁增厚、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡間隔增厚、毛細(xì)血管擴(kuò)張等病變的面積占視野面積的比例<25%、25%～50%、50%～75%、>75%分別記1、2、3、4分。②通過(guò)觀察Masson染色切片考察肺組織纖維化狀況,藍(lán)色為膠原纖維著色。膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)=(藍(lán)色著色面積/總面積)×100%。

1.3.6 RT-qPCR法檢測(cè)肺組織TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA表達(dá):取部分左肺組織,Trizol法提取總RNA,按試劑盒操作說(shuō)明依次進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增(95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s進(jìn)行45個(gè)循環(huán))。β-actin作為內(nèi)參,以2-ΔΔCt公式計(jì)算TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA相對(duì)表達(dá)量。PCR引物由生工生物工程(上海)公司設(shè)計(jì)與合成,引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3.7 Western blot法檢測(cè)肺組織TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá):在冰上,取適量左肺組織通過(guò)RIPA裂解后提取總蛋白,經(jīng)蛋白濃度測(cè)定和高溫變性處理后,30 μg總蛋白量上樣,依次進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉處理,4 ℃孵育一抗稀釋液TLR4(1∶1000)、NF-κB p65(1∶1000)、IκBα(1∶1000)、內(nèi)參β-actin(1∶2000)過(guò)夜,TBST溶液洗膜3×5 min后室溫孵育二抗稀釋液(1∶2000)1.5 h,TBST溶液洗膜3×5 min后加ECL顯影,與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 HCQ對(duì)SLE小鼠肺功能的影響 見(jiàn)表2。與正常對(duì)照組相比,模型組小鼠肺功能指標(biāo)Raw明顯升高,Cdyn和FEV0.1明顯降低(均P<0.05)。與模型組相比,HCQ組Raw明顯降低,Cdyn和FEV0.1明顯升高(均P<0.05)。與HCQ組相比,HCQ+TAK242組Raw明顯降低,Cdyn和FEV0.1明顯升高(均P<0.05),HCQ+LPS組Raw明顯升高、Cdyn和FEV0.1明顯降低(均P<0.05)。

表2 HCQ對(duì)SLE小鼠肺功能的影響

2.2 HCQ對(duì)SLE小鼠肺泡灌洗液中炎癥因子表達(dá)水平的影響 見(jiàn)表3。與正常對(duì)照組相比,模型組小鼠肺泡灌洗液中IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高(均P<0.05)。與模型組相比,HCQ組IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低(均P<0.05)。與HCQ組相比,HCQ+TAK242組IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯降低(均P<0.05),HCQ+LPS組IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯升高(均P<0.05)。

表3 HCQ對(duì)SLE小鼠肺泡灌洗液中炎癥因子表達(dá)水平的影響(pg/ml)

2.3 HCQ對(duì)SLE小鼠血清中免疫學(xué)指標(biāo)的影響 見(jiàn)表4。與正常對(duì)照組相比,模型組小鼠血清中ANA、ds-DNA水平明顯升高(均P<0.05)。與模型組相比,HCQ組ANA、ds-DNA水平明顯降低(均P<0.05)。與HCQ組相比,HCQ+TAK242組ANA、ds-DNA水平明顯降低(均P<0.05),HCQ+LPS組ANA、ds-DNA水平明顯升高(均P<0.05)。

表4 HCQ對(duì)SLE小鼠血清中免疫學(xué)指標(biāo)的影響(pg/ml)

2.4 HCQ對(duì)SLE小鼠肺組織病理學(xué)改變的影響 見(jiàn)圖1、2。正常對(duì)照組肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常。模型組小鼠肺組織呈現(xiàn)肺泡壁增厚、肺泡腔縮小、泡腔可見(jiàn)滲出物、肺泡間隔和肺間質(zhì)增厚、彌漫性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理學(xué)改變。與模型組比較,HCQ組肺組織病理學(xué)改變均明顯改善。與HCQ組比較,HCQ+TAK242組肺組織病理學(xué)改變明顯改善,HCQ+LPS組病理學(xué)改變明顯加重。與正常對(duì)照組相比,模型組肺組織病理評(píng)分明顯升高(P<0.05);與模型組相比,HCQ組肺組織病理評(píng)分明顯降低(P<0.05);與HCQ組比較,HCQ+TAK242組肺組織病理評(píng)分明顯降低(P<0.05),HCQ+LPS組肺組織病理評(píng)分明顯升高(P<0.05)。

圖1 HCQ對(duì)SLE小鼠肺組織病理學(xué)改變的影響(HE染色,×200)

注:與正常對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與HCQ組比較,△P<0.05圖2 HCQ對(duì)SLE小鼠肺組織病理評(píng)分的影響(n=8)

2.5 HCQ對(duì)SLE小鼠肺組織纖維化的影響 見(jiàn)圖3、4。正常對(duì)照組肺組織僅肺泡間隔區(qū)域呈現(xiàn)少量膠原纖維。與正常對(duì)照組相比,模型組肺泡間隔和肺間質(zhì)區(qū)膠原纖維明顯增多。與模型組比較,HCQ組肺泡間隔和肺間質(zhì)區(qū)膠原纖維明顯減少。與模型組相比,HCQ組肺泡間隔和肺間質(zhì)區(qū)膠原纖維明顯減少。與HCQ組相比,HCQ+TAK242組肺泡間隔和肺間質(zhì)區(qū)膠原纖維明顯減少,HCQ+LPS組肺泡間隔和肺間質(zhì)區(qū)膠原纖維明顯增多。模型組小鼠肺組織CVF較正常對(duì)照組明顯升高(P<0.05)。與模型組相比,HCQ組CVF明顯降低(P<0.05)。與HCQ組相比,HCQ+TAK242組CVF明顯降低(P<0.05),HCQ+LPS組CVF明顯升高(P<0.05)。

圖3 HCQ對(duì)SLE小鼠肺組織纖維化的影響(Masson染色,×200)

注:與正常對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與HCQ組比較,△P<0.05圖4 HCQ對(duì)SLE小鼠肺組織CVF的影響(n=8)

2.6 HCQ對(duì)SLE小鼠肺組織TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA表達(dá)的影響 見(jiàn)圖5。與正常對(duì)照組相比,模型組TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(均P<0.05)。與模型組相比,HCQ組TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(均P<0.05)。與HCQ組相比,HCQ+TAK242組TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA表達(dá)明顯下調(diào)(均P<0.05),HCQ+LPS組TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(均P<0.05)。

注:與正常對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與HCQ組比較,△P<0.05圖5 HCQ對(duì)SLE小鼠肺組織TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA表達(dá)的影響(n=8)

2.7 HCQ對(duì)SLE小鼠肺組織TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)圖6。與正常對(duì)照組相比,模型組TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(均P<0.05)。與模型組相比,HCQ組TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(均P<0.05)。與HCQ組相比,HCQ+TAK242組TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(均P<0.05),HCQ+LPS組TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(均P<0.05)。

注:與正常對(duì)照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與HCQ組比較,△P<0.05圖6 HCQ對(duì)SLE小鼠肺組織TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

目前,SLE動(dòng)物模型主要有自發(fā)型和人工誘導(dǎo)型兩大類(lèi)。自發(fā)型SLE動(dòng)物模型(如:MRL/lps小鼠、BXSB小鼠和NZB×NZW F1小鼠)具有遺傳穩(wěn)定性好、發(fā)病機(jī)制及病情進(jìn)展與人類(lèi)相似等優(yōu)點(diǎn),是目前探索SLE病理機(jī)制及新藥研究最常用的動(dòng)物模型,其中雌性MRL/lps小鼠模型最為經(jīng)典[10]。本研究選擇雌性MRL/lps小鼠作為受試SLE動(dòng)物模型,結(jié)果顯示,經(jīng)HCQ治療5周能夠明顯改善SLE小鼠肺功能(降低Raw并提高Cdyn、FEV0.1),減輕肺組織病理學(xué)改變和纖維化狀況,降低病理評(píng)分和CVF,該結(jié)果與謝長(zhǎng)好等[11]和談欣怡等[12]研究結(jié)果相似。表明HCQ對(duì)SLE小鼠肺損傷具有保護(hù)作用,對(duì)SLE小鼠肺功能具有改善作用。

SLE病理機(jī)制復(fù)雜,與環(huán)境、遺傳、免疫、激素等多因素相關(guān),有文獻(xiàn)[13]報(bào)道T細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞異?；罨瘜?dǎo)致免疫功能紊亂及免疫復(fù)合物沉淀,進(jìn)而引發(fā)IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥細(xì)胞因子大量分泌是SLE及其并發(fā)癥進(jìn)行性加重的重要機(jī)制。免疫學(xué)指標(biāo)血清ANA、ds-DNA水平與SLE活動(dòng)度密切相關(guān),是公認(rèn)的SLE臨床診斷指標(biāo)[14]。IFN-γ在SLE發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著中樞介質(zhì)的作用,抑制IFN-γ可作為自身免疫性疾病治療靶點(diǎn)[15]。炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6能夠刺激巨噬細(xì)胞等進(jìn)一步釋放炎癥因子并促進(jìn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),從而加重炎癥損傷[16]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)HCQ治療能夠明顯降低SLE小鼠血清ANA、ds-DNA水平和肺泡灌洗液中IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6水平,提示HCQ可改善SLE小鼠免疫功能并降低肺組織炎性反應(yīng),這可能是HCQ減輕SLE小鼠肺損傷并改善其肺功能的重要機(jī)制。

Toll樣受體(TLRs)是一類(lèi)跨膜識(shí)別受體,Jiang等[17]報(bào)道TLRs 中的TLR4亞型介導(dǎo)單核細(xì)胞活化后釋放大量TNF-α、IL-1β等炎癥因子釋放,在SLE發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。TLR4下游靶蛋白NF-κB是一種由p65和p50兩種亞基組成的異源二聚體,生理狀態(tài)下NF-κB定位于細(xì)胞質(zhì)以無(wú)活性的“NF-κB-IκBα”聚合體形式存在,TLR4可誘導(dǎo)“NF-κB-IκBα”聚合體解離和游離態(tài)NF-κB核轉(zhuǎn)位,入核后NF-κB p65亞基可促進(jìn)IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子轉(zhuǎn)錄與表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)炎性反應(yīng)[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)HCQ治療能夠明顯降低SLE小鼠肺組織TLR4、NF-κB p65、IκBα mRNA和蛋白表達(dá)量,提示HCQ降低SLE小鼠肺組織炎性反應(yīng)可能與抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。該結(jié)果與Tumurkhuu等[20]研究結(jié)果相似。為了驗(yàn)證上述推論,本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了HCQ+TAK242(TLR4抑制劑)組和HCQ+LPS(TLR4激動(dòng)劑)組,結(jié)果顯示,TAK242可明顯增強(qiáng)HCQ對(duì)SLE小鼠肺組織病變、肺功能、免疫功能、炎性反應(yīng)指標(biāo)以及TLR4/NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用,而LPS則能夠明顯逆轉(zhuǎn)HCQ對(duì)SLE小鼠各指標(biāo)的調(diào)控作用,從而進(jìn)一步證實(shí)了HCQ減輕SLE小鼠肺損傷的作用與抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述,HCQ可減輕SLE小鼠肺損傷,改善其肺功能,其機(jī)制可能與抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路,減輕炎性反應(yīng)有關(guān)。本研究結(jié)果為HCQ作為SLE肺損傷治療藥物提供了理論依據(jù),但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。