槲皮素對(duì)小鼠單側(cè)輸尿管結(jié)扎致腎間質(zhì)纖維化的改善作用及機(jī)制研究

黎 艷,劉 莉,王琪文,楊 越,張 靜,劉 丹

(1.荊門市人民醫(yī)院 荊楚理工學(xué)院附屬中心醫(yī)院,湖北 荊門 448000;2.西安市第五醫(yī)院,陜西 西安 710082;3.上海市浦東醫(yī)院 復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,上海 201399)

慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD) 的發(fā)病率逐年增加,已經(jīng)是一個(gè)重要的全球性的公共衛(wèi)生問題,是現(xiàn)今危害人類健康的主要疾病之一。CKD如果早期不及時(shí)地干預(yù)可進(jìn)展為終末期腎病,而腎間質(zhì)纖維化幾乎是所有CKD進(jìn)展到終末期腎病(End stage renal disease,ESRD) 的共同病理途徑[1]。防止和延緩腎間質(zhì)纖維化是防治CKD進(jìn)展的關(guān)鍵。槲皮素(Quercetin)是多羥基黃酮類化合物,廣泛分布在植物和多種中草藥中具有生物活性的黃酮類物質(zhì),多數(shù)情況以苷形式存在,經(jīng)水解后可以得到槲皮素,具有多種生物學(xué)活性及藥用價(jià)值[2]。已有研究[3-5]證明,槲皮素藥理作用十分廣泛,具有清除自由基和抗氧化作用,通過抗氧化應(yīng)激、抗炎等作用對(duì)腎臟起保護(hù)作用。因此,為了探討該化合物對(duì)腎臟纖維化的作用,我們觀察槲皮素對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎(Unilateral ureteral obstruction,UUO)小鼠腎間質(zhì)纖維化的影響并進(jìn)一步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試 劑 槲皮素(上海源葉,中國(guó));Trizol(Invitrogen,美國(guó)); 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo,美國(guó));通用型SYBR?Green預(yù)混液(Applied Biosystems,美國(guó));Anti-CD45抗體、Anti-α-SMA抗體、抗β肌動(dòng)蛋白抗體(Anti-βactin antibody)(Abcam,美國(guó)); Anti-TGF-β1抗體(Santa Cruz,美國(guó));血肌酐檢測(cè)試劑盒(肌氨酸氧化酶法)、尿素氮檢測(cè)試劑盒(BioAssay,美國(guó));PVDF膜(Merck,美國(guó));羊抗兔IgG-HRP、羊抗小鼠IgG-HRP、RIPA 裂解液、脫脂奶粉、TBST緩沖液、DAB顯色試劑盒、天狼星紅染色試劑盒、糖原PAS染色試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(索萊寶,中國(guó))。

1.2 儀 器 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀 (Thermo,美國(guó));Light Cycler?96實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀 (Roche,美國(guó));CKX53倒置熒光顯微鏡(Olympus,日本)。

1.3 UUO造模及分組 將48只C57/B6健康雄性小鼠隨機(jī)分為四組,對(duì)照組、低劑量給藥組、中劑量給藥組、高劑量給藥組。對(duì)照組戊巴比妥鈉腹腔麻醉后僅行腹膜切開縫合,不行輸尿管結(jié)扎;給藥組戊巴比妥鈉腹腔麻醉后均行右側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù),分別在術(shù)后第14天處死小鼠[6]。對(duì)照組在術(shù)后當(dāng)天開始給予皮下注射0.9%氯化鈉溶液,低劑量給藥組在術(shù)后當(dāng)天開始給予皮下注射槲皮素3 mg/(kg·d),中劑量給藥組在術(shù)后當(dāng)天開始給予皮下注射槲皮素9 mg/(kg·d),高劑量給藥組在術(shù)后當(dāng)天開始給予皮下注射槲皮素 18 mg/(kg·d),至術(shù)后第14天。各組小鼠于當(dāng)日收尿,經(jīng)40 mg/kg 戊巴比妥鈉腹腔麻醉后收血,開腹切取右側(cè)腎組織分成3部分,其中2部分迅速存于液氮中;第3部分固定于4%多聚甲醛,石蠟包埋。

1.4 血肌酐、尿素氮檢測(cè) 血肌酐采用肌氨酸氧化酶法檢測(cè),尿素氮采用脲酶法檢測(cè),均嚴(yán)格按照試劑盒說明書完成。

1.5 PAS染色、天狼星紅染色 石蠟組織切片行PAS染色、天狼星紅染色。雙盲法應(yīng)用Image J圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.6 免疫組化染色 石蠟切片水化后置枸櫞酸緩沖液 (pH 6.0)中微波修復(fù)抗原,用0.3%過氧化氫甲醇溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶,加抗體Anti-CD45,于4 ℃孵育過夜,用正常山羊血清作為陰性對(duì)照, DAB顯色陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕色,甘油明膠封片。雙盲法采用Image J圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析,比較腎臟組織白細(xì)胞浸潤(rùn)程度。

1.7 RT-qPCR法檢測(cè)基因表達(dá) 腎組織液氮速凍研磨后,加入1 ml Trizol裂解細(xì)胞,再加入200 μl氯仿,4 ℃,12000 g離心15 min,加入等體積異丙醇,4 ℃,12000 g離心10 min,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng),引物由上海生工合成。腫瘤壞死因子α(TNF-α)基因上游引物:5’-TGAGCACAGAAAGCATGATCC -3’,下游引物:5’-GCCATTTGGGAACTTCTCATC-3’;白細(xì)胞介素6(IL-6)基因上游引物:5’- GTTCTCTGGGAAATCGTGGA-3’,下游引物:5’-GGAAATTGGGGTAGGAAGGA-3’;α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)基因上游引物:5’-GCTGGTGATGATGCTCCCA-3’,下游引物:5’- GCCCATTCCAACCATTACTCC-3’;膠原蛋白1 (COL-1)基因上游引物:5’- TGACTGGAAGAGCGGAGAGT-3’,下游引物:5’-GTTCGGGCTGATGTACCAGT-3’;纖連蛋白(FN)基因上游引物:5’-GAAGTCGCAAGGAAACAAGC-3’,下游引物:5’- GCATCGTAGTTCTGGGTGGT-3’;GAPDH內(nèi)參基因上游引物:5’- CGTCCCGTAGACAAAATGG -3’,下游引物:5’- TTGATGGCAACAATCTCCAC -3’。TNF-α、IL-6、α-SMA擴(kuò)增反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性60 s,56 ℃退火60 s,72 ℃延伸60 s,共30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min;Collagen 1、Fibronectin 擴(kuò)增反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性60 s,53 ℃退火60 s,72 ℃延伸60 s,共30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。定量 PCR結(jié)果通過2-ΔΔCt計(jì)算。

1.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 用RIPA 裂解液裂解組織提取總蛋白,提取的總蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,采用電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,加5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別加入α-SMA抗體(1∶200),TGF-β1抗體(1∶300),4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶300),室溫孵育1 h,洗膜后顯影成像,并計(jì)算光密度強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

2.1 槲皮素對(duì) UUO 小鼠血生化指標(biāo)的影響 血生化指標(biāo)結(jié)果表明,術(shù)后14 d,對(duì)照組與低劑量和中劑量給藥組相比小鼠血肌酐、尿素氮水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),高劑量給藥組明顯較對(duì)照組、低劑量和中劑量給藥組低(均P<0.05),見表1。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)將選擇高劑量給藥組進(jìn)行研究。

表1 槲皮素對(duì) UUO 小鼠血生化指標(biāo)的影響

2.2 槲皮素對(duì) UUO 小鼠腎臟組織學(xué)的影響 PAS染色結(jié)果提示,UUO術(shù)后14 d,對(duì)照組腎臟組織腎間質(zhì)單核細(xì)胞浸潤(rùn)增多,出現(xiàn)明顯纖維化,腎臟組織間質(zhì)區(qū)域大量細(xì)胞外基質(zhì)成分沉積,而槲皮素高劑量給藥組腎臟病變均不明顯(圖1)。槲皮素治療后UUO小鼠腎臟損傷程度減輕。天狼星紅染色結(jié)果顯示,UUO術(shù)后14 d,高劑量給藥組腎小管萎縮程度和腎間質(zhì)纖維化較對(duì)照組明顯減輕(圖2)。因此,槲皮素治療后可顯著減輕腎間質(zhì)纖維化程度。

注:**P<0.01圖1 PAS染色觀察槲皮素處理后腎臟病理?yè)p傷程度(×200)

注:***P<0.001圖2 天狼星紅染色觀察槲皮素處理后腎臟纖維化程度(×200)

2.3 槲皮素對(duì) UUO 小鼠腎組織炎癥因子及纖維化因子mRNA表達(dá)水平的影響 RT-qPCR結(jié)果顯示,同對(duì)照組相比,高劑量給藥組腎組織中各炎癥因子(TNF-α、IL-6)和纖維化因子(COL-1、FN和α-SMA)的mRNA表達(dá)明顯降低(均P<0.05)(圖3)。結(jié)果提示,高劑量槲皮素治療能夠顯著抑制細(xì)胞炎癥浸潤(rùn)和纖維化程度。

注:*P<0.05,**P<0.01圖3 槲皮素對(duì)UUO小鼠腎組織炎癥因子及纖維化因子mRNA表達(dá)水平的影響

2.4 槲皮素對(duì) UUO 小鼠腎組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度的影響 取腎臟組織進(jìn)行炎癥細(xì)胞免疫組化染色,免疫組化結(jié)果顯示,陽(yáng)性染色主要表達(dá)在腎臟小管間質(zhì)區(qū)域,與對(duì)照組相比,高劑量給藥組腎組織中CD45表達(dá)明顯降低(P<0.01)(圖4)。結(jié)果表明,高劑量槲皮素治療能夠顯著減少腎臟組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),降低炎性反應(yīng)程度。

注:**P<0.01圖4 CD45染色觀察槲皮素處理后白細(xì)胞浸潤(rùn)程度(×200)

2.5 槲皮素對(duì)UUO小鼠腎組織 TGF-β1和α-SMA蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,高劑量槲皮素給藥組可下調(diào)UUO小鼠 TGF-β1和α-SMA蛋白表達(dá)水平(均P<0.05)(圖5)。結(jié)果表明,槲皮素能夠降低UUO小鼠腎組織纖維化水平和炎性反應(yīng)程度。

3 討 論

慢性腎臟病的發(fā)病率在我國(guó)呈逐年增高的趨勢(shì),已然成為我國(guó)公共衛(wèi)生重大問題。既往研究[7]表明,慢性腎臟病引起的腎間質(zhì)纖維化病變是決定腎臟存活率的最主要因素,然而目前臨床上應(yīng)用的藥物對(duì)抗纖維化治療而帶來的不良反應(yīng)往往限制了它們的使用,因此對(duì)腎間質(zhì)纖維化的治療方案十分有限。腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程涉及多條信號(hào)通路、多種細(xì)胞因子,是一個(gè)多步驟多因素的病理過程。而中醫(yī)藥在復(fù)雜疾病的治療中占有優(yōu)勢(shì),大量的研究也證實(shí)了中藥復(fù)方及單味中藥干預(yù)氧化應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展[8]。既往研究[9]表明,槲皮素可通過抗氧化應(yīng)激、抗炎作用等對(duì)腎臟起保護(hù)作用。因此,探究槲皮素對(duì)腎臟纖維化和炎癥發(fā)病的信號(hào)通路機(jī)制尤為重要。

腎間質(zhì)纖維化以腎小管間質(zhì)內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)的大量積聚、成纖維細(xì)胞大量增生、腎小管萎縮以及間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特征,是各種原發(fā)或繼發(fā)性腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同途徑[10]。UUO 小鼠是以進(jìn)行性腎小管間質(zhì)纖維化為特征的實(shí)驗(yàn)性腎臟病模型,是目前公認(rèn)的腎小管間質(zhì)纖維化模型,相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)UUO 小鼠在術(shù)后第14天已出現(xiàn)較為明顯的腎小管間質(zhì)纖維化[11]。因此,本文通過槲皮素對(duì)輸尿管結(jié)扎后14 d小鼠腎臟纖維化程度的治療作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)探究。

通過組織形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),高劑量槲皮素可明顯改善UUO小鼠腎臟組織腎小管上皮細(xì)胞形態(tài),減輕腎臟損傷程度,并且通過天狼星紅染色表明纖維化程度也明顯減輕。同時(shí),我們檢測(cè)了藥物治療后腎臟組織中炎癥因子和纖維化因子的表達(dá),發(fā)現(xiàn)高劑量槲皮素能夠明顯減輕腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和腎臟組織纖維化程度。發(fā)生腎間質(zhì)纖維化的腎小管及間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)α-SMA[12]。腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化是腎臟纖維化的重要進(jìn)展環(huán)節(jié),正常條件下,成熟的腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)角蛋白,腎間質(zhì)細(xì)胞主要表達(dá)波形蛋白,其都沒有α-SMA 蛋白的表達(dá)[13-14]。TGF-β1是最重要的促纖維化細(xì)胞因子之一,TGF-β1信號(hào)途徑在上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)中的重要作用已得到公認(rèn)[15-16]。既往研究也證實(shí)抑制梗阻側(cè)腎組織中TGF-β1的表達(dá),可以對(duì)抗腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生進(jìn)展[17]。因此,槲皮素通過下調(diào)UUO小鼠腎組織TGF-β1表達(dá)水平和α-SMA蛋白表達(dá),降低纖維化水平。

槲皮素對(duì)腎損傷的治療作用和抗纖維化作用可能是通過抑制TGF-β1/Smad通路[18-19],進(jìn)而調(diào)控腎間質(zhì)成纖細(xì)胞(renal intestinal fibroblast,RIF)活化來完成的[20]。現(xiàn)有的體外研究結(jié)果表明,槲皮素在TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠正常腎成纖維細(xì)胞(NRK-49F細(xì)胞)活化中發(fā)揮抑制作用,并且隨著α-SMA下調(diào)的同時(shí),糖酵解途徑中的關(guān)鍵酶丙酮酸激酶同工酶2(Pyruvate kinase isozyme type M2,PKM2)的基因表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平均下調(diào),且與槲皮素劑量呈正相關(guān)[21]。綜上所述,槲皮素可能是通過抑制糖酵解,下調(diào)TGF-β1表達(dá),減少腎間質(zhì)成纖細(xì)胞活化抑制腎纖維化的進(jìn)程。

槲皮素可以改善UUO小鼠腎間質(zhì)纖維化指標(biāo)以及血肌酐和尿素氮含量,其機(jī)制可能是通過降低炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),并通過下調(diào)α-SMA和TGF-β1蛋白表達(dá),改善腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,從而減輕纖維化程度。