液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標法測定豬肉中沙丁胺醇的不確定度分析

楊 翠

（甘孜州食品藥品檢驗所，四川甘孜 626000）

沙丁胺醇（Salbutamol）屬于一種具有選擇性的β受體激動劑，能進行性激動支氣管平滑肌的β 受體的選擇，擴張支氣管[1-3]。臨床上常用于預防治療支氣管哮喘[4]。飼喂畜禽沙丁胺醇能夠加快畜禽的骨骼肌發(fā)育速度，減少脂肪沉積[5]。我國對萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅的用途予以合法約束之后，部分不法商戶會將沙丁胺醇作為替代品用于畜禽飼喂[6]。如果促生長飼料內(nèi)的沙丁胺醇含量超出正常治療量，那么動物體內(nèi)會殘留一定的沙丁胺醇，而人們食用有沙丁胺醇殘留的動物食品后，會出現(xiàn)中毒反應[7]。目前，應用相對較為廣泛的沙丁胺醇殘留檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[8-10]。

質(zhì)譜分析法是通過測定被測樣品離子質(zhì)荷比進行分析[11]，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀由接口裝置、高效液相色譜、質(zhì)譜儀組成，其作用是先分離混合物樣品，再進入質(zhì)譜儀[12]。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜是檢測沙丁胺醇的較為高效的檢測方法[13]，這種檢測方法不涉及衍生化環(huán)節(jié)，利用液相色譜可以有效分離出部分熱不穩(wěn)定小分子極性物質(zhì)，質(zhì)譜能精準檢測其中的化合物[14]。部分檢測中運用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對動物肝臟中沙丁胺醇含量進行綜合檢測分析，通過檢測得出其平均回收率為76%，不同樣品之間的相對標準偏差為6%[15]。孫雷等[16]綜合闡述了檢測分析動物源食品中沙丁胺醇的多種方法，發(fā)現(xiàn)食品中沙丁胺醇含量極值為0.1 μg·kg-1。蔡欣欣等[17]結(jié)合內(nèi)標法對動物源食品進行檢測分析，主要測定了沙丁胺醇含量，得出其最低定量限為0.2 μg·kg-1。朱英才等[18]通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法綜合檢測分析豬尿內(nèi)的沙丁胺醇殘留量，沙丁胺醇回收率為93.8%，最低定量限為0.27 μg·L-1。谷旭等[19]運用超高壓液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法檢測分析了豬尿液和相關(guān)代謝物內(nèi)的沙丁胺醇含量，運用乙腈對豬尿樣品進行處理，在樣本中沙丁胺醇的保留時長可達1.8 min，沙丁胺醇特征離子對應的質(zhì)荷比達240，沙丁胺醇進入豬體內(nèi)之后6 h 內(nèi)的尿液中檢測分析出的代謝產(chǎn)物相對較多，結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)了5 種不同的代謝產(chǎn)物，其中2 種代謝產(chǎn)物在以往的報道中未發(fā)現(xiàn)[20]。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具備樣品用量少[21]、靈敏度高[22]、選擇性強[23]等多種優(yōu)勢，成為現(xiàn)階段開展沙丁胺醇測定的主要方法之一?；诖耍舜沃饕凑铡稖y量不確定度評定與表示》（JJG 1059.1—2012）以及《化學分析中不確定度的評估指南》（CNAS—GL06：2019）的規(guī)定，分析了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標法測定豬肉中沙丁胺醇的不確定度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（LC-MS 級），購自山東夸克化工有限公司；β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶，購自美國Sigma-Aldrich 公司；乙酸鈉（優(yōu)級純），購自湖北萬得化工有限公司；高氯酸（優(yōu)級純），購自金川縣金星氯酸鹽廠；甲酸，購自美國Fisher 科學世界公司；氨水（優(yōu)級純），購自河北正坤精細化工有限公司；氫氧化鈉（優(yōu)級純），購自上海巨鵬化工科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜儀（安捷倫1290-6470），ESI+ Agilent Jet 源；安捷倫ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）；梅特勒電子天平XS205DU；Oasis MCX 陽離子交換柱，60 mg/3 mL；TurboVap 氮吹儀，瑞典Biotage 儀器設(shè)備公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

稱取2 g（精確到0.01 g）完全搗碎的樣品并放置到規(guī)格為50 mL 的塑料管內(nèi)，在塑料管中倒入8 mL的乙酸鈉緩沖液，使其均勻混合，放入β-葡萄糖醛甙酶/芳基硫酸酯酶，劑量為50 μL，混勻，放置于37 ℃的水浴中水解，時間設(shè)定為12 h。把100 μL劑量規(guī)格為10 ng·mL-1的內(nèi)標工作液倒至待檢測樣品中。塑料管加蓋后放入水平振蕩器內(nèi)，時間設(shè)定為15 min。放入轉(zhuǎn)速為5 000 r·min-1的離心機內(nèi)，時間設(shè)定為10 min。取4 mL 離心后的上清液，放入5 mL 濃度為0.1 mol·L-1的高氯酸溶液，混勻，在液體內(nèi)放入一定量的高氯酸，將液體pH 值調(diào)整到1±0.3。設(shè)定離心機轉(zhuǎn)速為5 000 r·min-1，時間設(shè)定為10 min，取出離心后的所有上清液，放置于規(guī)格為50 mL 的離心管內(nèi)，放入一定量的10 mol·L-1的氫氧化鈉溶液，把試管內(nèi)液體pH 值調(diào)整到11。在溶液中加入飽和氯化鈉溶液、異丙醇-乙酸乙酯混合溶液各10 mL，待其完全提取后，放入轉(zhuǎn)速為5 000 r·min-1的離心機內(nèi)，時間設(shè)定為10 min。40 ℃水浴，并通過氮氣，使其干燥。放入5 mL 乙酸鈉緩沖液，樣品溶液超聲混勻，全部溶解殘渣部分并留作備用。

把陽離子交換小柱以及真空過柱裝置連接到一起，把殘渣溶液加入真空柱中，分別用2 mL 水、2%甲酸水溶液、甲醇3 種不同液體對柱子進行洗滌，洗滌后及時抽干洗滌液體，利用5%氨水甲醇溶液完全清除柱子內(nèi)留存的部分待測成分。在洗脫過程中，應將流速控制在0.5 mL·min-1。將洗脫液放置于40 ℃水浴中并且利用氮氣使其干燥。在樣品溶劑中加入200 μL規(guī)格為0.1%的甲酸/水-甲醇溶液（95+5）并對其進行超聲混勻，把溶液移至1.5 mL 離心管內(nèi)，放入轉(zhuǎn)速為5 000 r·min-1離心機內(nèi)，時間設(shè)定為10 min，對離心后的上清液進行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3.2 標準溶液配制

配制規(guī)格為1 000 mg·L-1的沙丁胺醇標準儲備溶液，精準稱取0.009 21 g 的沙丁胺醇，溶解，溶液容積設(shè)定為50 mL，于4 ℃貯存，保存期為6 個月。配制沙丁胺醇-D3混合標準中間溶液（100 mg·L-1），精準量取1 mL 丁胺醇標準儲備溶液，放入規(guī)格為100 mL 的容量瓶內(nèi)，用甲醇定容。配制5 ng·L-1的沙丁胺醇溶液，試劑配制濃度測定值為4.832 1 ng·L-1、4.867 1 ng·L-1、4.864 4 ng·L-1，基質(zhì)配制測定值為5.438 2 ng·L-1、5.504 5 ng·L-1、5.441 6 ng·L-1。

1.3.3 數(shù)學模型

待檢測樣本內(nèi)的沙丁胺醇殘留量的計算公式為

式中：X為待檢測樣本內(nèi)的沙丁胺醇殘留量，μg·kg-1；c為配制的標準工作溶液中的沙丁胺醇濃度，ng·mL-1；csi為標準工作溶液中含有的內(nèi)標物濃度，ng·mL-1；ci為樣品中的內(nèi)標物濃度，ng·mL-1；A為樣品內(nèi)的沙丁胺醇能夠形成的峰面積；Asi為標準工作溶液內(nèi)的內(nèi)標物能夠形成的峰面積；Ai為樣品內(nèi)的內(nèi)標物能夠形成的峰面積；As為標準工作溶液內(nèi)所含沙丁胺醇能夠形成的峰面積；V為樣品的定容體積，mL；m為樣品的稱樣量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準物質(zhì)定容及稀釋過程中引入的不確定度

2.1.1 標準品定容引入的不確定度

在標準儲備液（182.911 mg·L-1)配制中，容量瓶定容誤差會引入不確定度。容量瓶規(guī)格50 mL，容量瓶允差為±0.05 mL，結(jié)合三角分布，其標準不確定度為

將溫度引入不確定度中，校準容量瓶所需溫度設(shè)定為20 ℃，而實驗室內(nèi)溫度通常控制在（20±2）℃，受到水膨脹系數(shù)（2.08×10-3℃-1）影響，假定溫度變化為均勻分布，則對應的標準不確定度為

定容引入的不確定度為

標準品定容引入的相對標準不確定度為

2.1.2 標準溶液稀釋引入的不確定度

標準溶液稀釋引入的不確定度包括移液器移取體積、移取溫度的不確定度和容量瓶定容體積、定容溫度的不確定度，計算結(jié)果見表1。

表1 標準溶液稀釋引入的不確定度

標準物質(zhì)稀釋過程引入的相對標準不確定度為

標準物質(zhì)配制及稀釋過程引入的標準不確定度為

2.2 內(nèi)標引入的不確定度

2.2.1 內(nèi)標物質(zhì)純度引入的相對標準不確定度

本次使用的沙丁胺醇-D3液體標準品濃度為100.1 μg·mL-1，查看標準物質(zhì)證書，得出其相對擴展不確定度是3.0%，k=2，標準物質(zhì)引入的不確定度為

2.2.2 內(nèi)標溶液稀釋引入的相對標準不確定度

所用移液器為1 mL，查看檢定證書，得出擴展不確定度U=2.1 μL，k=2。相對標準不確定度為

所用容量瓶為100 mL，容量瓶允差為±0.10 mL，按均勻分布考慮，其標準不確定度為

校準容量瓶時溫度應是20 ℃，而實驗室內(nèi)溫度通?？刂圃冢?0±2）℃，在甲醇膨脹系數(shù)的作用下，如果溫度處于均勻分布發(fā)展狀態(tài)，則其標準不確定度為

內(nèi)標引入的相對標準不確定度為

2.3 標準曲線配制引入的不確定度

標準曲線配制共有8 組不同濃度的溶液，計算獲得不確定度，結(jié)果見表2。標準曲線配制形成的相對標準不確定度為

表2 標準曲線配制不確定度

2.4 沙丁胺醇標準曲線擬合引入的不確定度

沙丁胺醇標準曲線擬合引入的不確定度的計算公式為

式中：b為標準曲線斜率；沙丁胺醇標準溶液濃度平均值，mg·L-1；為樣品中沙丁胺醇濃度的平均值，mg·L-1；x—樣為樣品中沙丁胺醇含量的平均值，mg·kg-1；p為測試樣品的次數(shù)，p=18；n為檢測中標準品的檢測次數(shù)，n=24；x為標準溶液對應的濃度平均值，mg·L-1。

進行樣品中沙丁胺醇濃度的6 次平行試驗，對樣品中沙丁胺醇含量進行測試，并計算其平均值，樣品測定結(jié)果見表3，計算標準差（Standard Deviation，SD）和變異系數(shù)（Coefficient of Variation，CV）。

表3 樣品含量計算結(jié)果

以工作液濃度為橫坐標、內(nèi)標峰面積為縱坐標，擬合得到沙丁胺醇濃度不確定度工作曲線數(shù)據(jù)，見表4。

表4 沙丁胺醇濃度不確定度工作曲線數(shù)據(jù)

標準偏差s=0.212 2；標準曲線工作液濃度的平均值=25.505 0 ng·mL-1

沙丁胺醇校準曲線產(chǎn)生的不確定度為

2.5 樣品引入的不確定度

2.5.1 樣品稱量引入的不確定度

準確性引入的不確定度在檢定證書內(nèi)設(shè)定最大公允差為0.000 5 g，假設(shè)為均勻分布，則重復性引入的不確定度檢定證書內(nèi)設(shè)定的重復性誤差是0.000 2 g，假設(shè)為均勻分布，則

偏載引入的不確定度由檢定證書給出的誤差為0.000 1 g，假設(shè)為均勻分布，則

天平稱量引入的合成不確定度為

樣品稱量引入的相對標準不確定度為

2.5.2 樣品定容引入的不確定度

樣品定容所用可調(diào)移液器規(guī)格為1 000 μL，允 差 為±1.0%， 測 量 重 復 性 為0.5%， 按均勻分布考慮， 定容體積標準不確定度為定容重復性標準不確定度為

校準容量瓶時溫度為20 ℃，實驗室溫度變化為（20±2）℃，由水的膨脹系數(shù)（2.08×10-4℃-1）決定，假定溫度變化為均勻分布，其標準不確定度為

定容引起的合成不確定度為

樣品定容引入的相對標準不確定度為

樣品引入的相對標準不確定度為

2.6 高效液相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜儀引入的不確定度

由儀器檢定證書知，儀器的擴展不確定度為U=0.15，k=2，其相對標準不確定度為

2.7 測量重復性引入的不確定度

由表2 可知，樣品測定結(jié)果為S(x)=0.16，x—=28.3 μg·kg-1，所以相對標準不確定度為

2.8 沙丁胺醇相對合成標準不確定度

通過計算樣品稱量、定容、標準品、內(nèi)標、標準曲線配制、標準曲線擬合、儀器設(shè)備、樣品重復性測定的相對不確定度，計算得出豬肉中沙丁胺醇相對合成標準不確定度為

2.9 合成標準不確定度

豬肉中沙丁胺醇的合成標準不確定度為

2.10 測量不確定度報告

取置信區(qū)間為95%，k=2，則擴展不確定度為U=ucrel(x)×k=2.238 5×2=4.477 μg·kg-1，樣品中沙丁胺醇含量為（28.3±4.477）μg·kg-1。

3 結(jié)論

本文研究了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標法測定豬肉沙丁胺醇的不確定度，主要分析樣品前處理、標準品及內(nèi)標配制過程、標準曲線擬合、儀器設(shè)備、溫度等多種相關(guān)因素對不確定度的影響，各影響因素均對不確定度有一定的貢獻。結(jié)果顯示，此次試驗中的不確定度主要來自高效液相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜儀、標準曲線配制、內(nèi)標物質(zhì)純度。在實際檢測時，玻璃量器的校準、天平定期檢定以及加大實驗室內(nèi)的溫度控制等在提升檢測可靠性以及準確性等方面具有重要意義。根據(jù)對不確定度的分析可知，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀的性能狀態(tài)對檢測結(jié)果影響最大。因此，維護保養(yǎng)設(shè)備至關(guān)重要，維持設(shè)備的精密度和靈敏度，可保證檢驗結(jié)果準確可靠。