諾氟沙星磁分子印跡納米粒子的制備及其富集分離

黃昭，李跑，曹亞男，李佳銀，劉霞

（湖南農業(yè)大學食品科技學院，食品科學與生物技術湖南省重點實驗室，湖南長沙410128）

氟喹諾酮類抗生素（fluoroquinolones，FQs）是一類人工合成的廣譜抗生素，其抗菌活性強、價格低，被廣泛用于動物養(yǎng)殖中，若被長期使用，即使是低劑量，也易造成動物源食品中該抗生素的殘留。殘留的抗生素可通過食物鏈進入人體，引起一些不良反應，主要對肌肉、肌腱、骨骼和神經系統(tǒng)產生危害[1]，甚至有致癌、致畸、致突變的風險。

食品分析檢測技術是保障食品安全的重要手段。因為食品基質復雜，氟喹諾酮類抗生素殘留濃度低，大部分檢測技術，如液相色譜（liquid chromatography，LC）、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、及高效液相色譜-質譜（high performance liquid chromatography-mass spectrum，HPLCMS）等[2-4]，在檢測實際樣品前需要對目標物進行富集分離，排除基質干擾，以提高檢測的靈敏度和準確性。常用的富集分離方法如液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）、固相萃?。╯olidphase extraction，SPE）和固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）等技術，這些方法通常存在操作復雜、耗時長、有機溶劑用量大等缺點[5-10]。

分子印跡技術（molecular imprinting technology，MIT）是使模板分子與功能單體以共價鍵或非共價鍵結合，再通過聚合作用形成包覆配合物的立體結構，經過洗脫解離模板分子后，形成與模板分子空間構型相匹配的印跡孔穴，可對模板分子進行特異性識別和吸附[11-12]。而磁分子印跡納米粒子（magnetic molecularly imprinted polymers nanoparticles，MMIPs NPs）兼具特異性和磁性，在選擇性吸附目標物的同時可通過外加磁場快速與基質分離，具有制備簡單、成本低廉、特異性強、可重復利用等優(yōu)點[13-15]。

本研究以諾氟沙星（norfloxacin，NOR）為模板分子，利用多巴胺（dopamine，DA）在室溫（25℃）弱堿性溶液中可進行氧化自聚合的性質，在氨基修飾的四氧化三鐵納米粒子（Fe3O4@NH2NPs）表面合成了MMIPs NPs，其制備條件溫和、耗時短、試劑用量少，制備的MMIPsNPs能被磁鐵迅速吸附，為富集分離樣品中的NOR及其后續(xù)檢測提供了一種更簡單、環(huán)保的新技術。

1 材料與方法

1.1 試劑

NOR、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、四環(huán)素（tetracycline，TC）標準品：上海源葉生物有限公司；磺胺嘧啶（sulfadiazine，SD）標準品：上海瑞永生物科技有限公司；六水合氯化鐵（FeCl3·6H2O）、四水合氯化亞鐵（FeCl2·4H2O）、乙酸：上海國藥集團化學試劑有限公司；DA、四甲基氫氧化銨（tetramethylammonium hydroxide，TMAOH）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（aminopropyltriethoxysiane，APTES）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Tris-base：美國VWR International有限公司。

1.2 儀器與設備

Multiskan GO 1510全波長酶標儀：芬蘭Thermo Fisher Scientific Oy公司；DZF-6030A真空干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；KQ-100超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；HNY-20017恒溫搖床：天津歐諾儀器儀表有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 Fe3O4@NH2NPs的制備

將 10 mmol FeCl2·4H2O、18.5 mmol FeCl3·6H2O溶于100mL超純水中，通氮除氧，水浴加熱至85℃，滴加40 mL 2 mol/L NaOH溶液，在550 r/min轉速下反應1 h，冷卻至25℃后用磁鐵吸附，再用超純水反復沖洗至中性后真空干燥，黑色固體即為Fe3O4NPs。干燥后的Fe3O4NPs，經7% TMAOH活化后，用乙醇清洗5次。將0.8 g活化的Fe3O4NPs加入120 mL體積比為1∶1的乙醇-水溶液中混合均勻，水浴加熱至40℃再加入3 mL APTES，通氮除氧，在350 r/min條件下反應10 h，冷卻至25℃后用磁鐵吸附，乙醇沖洗5次，60℃真空干燥，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 MMIPs NPs的制備

1.3.2.1 NOR檢測波長的確定

分別對Fe3O4@NH2NPs、NOR、DA，用酶標儀掃描紫外全波段光譜，確定NOR的最佳檢測波長。

1.3.2.2 MMIPs NPs的制備

將500 mg的Fe3O4@NH2NPs加入100 mL體積比為1∶1的乙醇-水溶液（用Tris-HCl調節(jié)pH值至8.5）中攪拌均勻，轉移至250 mL的燒瓶，25℃水浴，依次加入15 mg NOR、134 mg DA攪拌均勻，在300 r/min轉速下反應2 h，用磁鐵吸附固體，純水清洗固體3次后用真空干燥。

1.3.2.3 NOR洗脫液的選擇

分別用1 mmol/L NaOH、1 mol/L NaOH、體積比為97∶3的乙醇-乙酸溶液、體積比為97：3的乙醇-乙酸溶液與1 mol/L NaOH交替洗脫4種方法洗脫模板分子，各洗脫5次，再用純水清洗3次。取20 mg MMIPs NPs吸附1 mL 0.1 mg/mL的NOR標準溶液2 h，檢測上清液中NOR的殘留量，考察洗脫液洗脫模板分子的能力，及MMIPs NPs再次吸附NOR的效果。

1.3.2.4 模板分子與功能單體物質的量比的確定

按照 1.3.2.2 的條件，固定Fe3O4@NH2NPs（500 mg）和NOR（15 mg）的添加量，改變NOR與DA物質的量比（NOR ∶DA=1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20） 制備 MMIPs NPs。取15 mg MMIPs NPs吸附1 mL 0.1 mg/mL的NOR標準溶液2 h，檢測上清液中NOR的殘留量，計算其吸附效率，確定最佳的NOR與DA物質的量比例。

1.3.2.5 Fe3O4@NH2NPs添加量的確定

按照1.3.2.4得到的最佳條件，固定NOR和DA的添加量，改變Fe3O4@NH2NPs的添加量（250、500、750 mg），制備MMIPs NPs。取一定量的MMIPs NPs吸附1 mL 0.1 mg/mL的NOR標準溶液2 h，檢測上清液中NOR的殘留量，計算其吸附效率，確定Fe3O4@NH2NPs的最佳添加量。

1.4 吸附時間對吸附效率的影響

準確稱取9份4 mg MMIPs NPs于4 mL離心管中，分別加入1 mL 0.02 mg/mL的NOR標準溶液，于恒溫培養(yǎng)振蕩器中吸附，在吸附 10、20、30、40、50、60、80、100、120 min時取出，磁鐵吸附后取上清液，檢測其NOR的殘留量，計算其吸附效率，考察吸附時間對吸附效率的影響。

1.5 MMIPs NPs用量對吸附效率的影響

分別準確稱取 4、10、15、20 mg 的 MMIPs NPs于4 mL離心管，分別加入1 mL 0.1 mg/mL的NOR標準溶液，于恒溫培養(yǎng)振蕩器中吸附120 min，磁鐵吸附后取上清液，檢測其NOR的殘留量，計算其吸附效率。考察MMIPs NPs用量對吸附效率的影響。

2 結果與分析

2.1 Fe3O4@NH2NPs的制備

2.1.1 Fe3O4@NH2NPs的制備及穩(wěn)定性

制備的Fe3O4NPs和Fe3O4@NH2NPs呈黑色，在外加磁場作用下可快速聚集，具有良好的磁性。120℃熱風干燥時，Fe3O4NPs的顏色由黑色變?yōu)榧t褐色，說明其完全被氧化；而Fe3O4@NH2NPs仍為黑色，未發(fā)生氧化。故氨基修飾能有效保護Fe3O4NPs不被氧化。

2.1.2 Fe3O4NPs活化時間的確定

制備的Fe3O4NPs表面只有極少量的-OH，經TMAOH活化后可在其表面形成更多的-OH，而-OH的含量影響后續(xù)的氨基修飾過程[16]。根據文獻[17]的方法測定了Fe3O4@NH2NPs表面氨基含量，即取20 mg Fe3O4@NH2NPs，加入10 mL 0.1 mol/L的HCl標準溶液，超聲振蕩均勻，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定，記錄滴定終點時消耗NaOH的體積，計算Fe3O4@NH2NPs表面氨基的含量?；罨瘯r間對Fe3O4@NH2NPs表面氨基含量的影響如圖1所示。

圖1 活化不同時間制備的Fe3O4@NH2NPs表面氨基含量Fig.1 Amino content of Fe3O4@NH2NPs synthesized after different times of activation

結果表明，Fe3O4NPs活化2 h后制備的Fe3O4@NH2NPs，其表面氨基含量為0.122 5 mmol/g，已達平衡，相對于未經活化制備的Fe3O4@NH2NPs的表面氨基含量（0.068 3 mmol/g）增加了約79%，故Fe3O4NPs的活化時間為2 h。

2.2 MMIPs NPs的制備

2.2.1 檢測波長的確定

圖2為Fe3O4@NH2NPs、NOR、DA和NaOH的紫外光譜圖。Fe3O4@NH2NPs和NaOH無明顯紫外吸收。DA在285 nm處有吸收峰，而NOR在285、323、335 nm處均出現了明顯的吸收峰，且323 nm處的吸收峰比335 nm更強。故NOR的檢測波長選擇323 nm。

圖2 NOR、DA、Fe3O4@NH2NPs及NaOH的紫外光譜Fig.2 UV spectra of NOR，DA，Fe3O4@NH2NPs and NaOH

2.2.2 MMIPs NPs對NOR吸附效率的計算

配置0.004 mg/mL～0.1 mg/mL的NOR標準溶液，在323nm處檢測其吸光度值，建立NOR標準曲線，見圖3。

圖3 不同濃度NOR的紫外光譜Fig.3 UV spectra of different concentrations of NOR

取MMIPsNPs富集分離NOR后的上清液，在323nm處測其吸光度值，根據標準曲線計算上清液殘留的NOR濃度，即可計算MMIPs NPs對NOR的吸附效率，公式如下：

式中：C0為吸附前NOR的初始濃度，mg/mL；C為吸附后上清液中殘留的NOR濃度，mg/mL。

2.2.3 NOR洗脫液的確定

4種洗脫方式洗脫的20 mg MMIPs NPs，吸附1 mL 0.1 mg/mL NOR標準溶液2 h的吸附效率見圖4。

圖44 種洗脫方式下的MMIPs NPs對NOR的吸附效率Fig.4 Adsorption efficiency of MMIPs NPs to NOR after 4 different elution methods

由圖4可知，采用體積比為97∶3的乙醇-乙酸溶液作為洗脫液，其吸附效率最高，為88.79%，用體積比為97∶3的乙醇-乙酸溶液與1 mmol/L NaOH交替洗脫，其吸附效率為85.37%，1 mol/L NaOH的洗脫效果最差，為39.38%。故優(yōu)選體積比為97∶3的乙醇-乙酸溶液作為模板分子的洗脫液。

2.2.4 模板分子與功能單體物質的量比的確定

模板分子與功能單體不同物質的量比制備的MMIPs NPs，對NOR的吸附效率見圖5。

圖5 不同模板分子與功能單體物質的量比制備的MMIPs NPs對NOR的吸附效率Fig.5 Adsorption efficiency of MMIPs NPs synthesized by different amount of substance ratios of NOR and DA on NOR

由圖5可知，隨著DA的量逐漸增大，吸附效率逐漸增加，這可能是由于DA的增加，形成的分子印跡孔穴的數量增加。當NOR和DA的物質的量比為1∶15時，吸附效率最大，為99.17%，相對標準偏差為1.03%。當NOR和DA的物質的量比為1∶20時，吸附效率減小至96.91%，這可能是因為DA的用量過多導致分子印跡層變厚，掩蓋了部分分子印跡孔穴[18-19]。故模板分子與功能單體的最佳物質的量比為1∶15。

2.2.5 Fe3O4@NH2NPs添加量的確定

不同Fe3O4@NH2NPs添加量制備的MMIPs NPs，對NOR的吸附效率見圖6。

圖6 不同Fe3O4@NH2NPs添加量制備的MMIPs NPs對NOR的吸附效率Fig.6 Adsorption efficiency of MMIPs NPs synthesized on NOR based on different addition amount of Fe3O4@NH2NPs

由圖6可知，分別取4、10、15 mg的MMIPs NPs進行吸附時，Fe3O4@NH2的添加量為500 mg制備的MMIPs NPs的吸附效率分別為55.24%、94.23%、99.17%，而Fe3O4@NH2NPs的添加量為250 mg和750 mg制備的MMIPs NPs均沒有Fe3O4@NH2的添加量為500 mg制備的MMIPs NPs的吸附效率高，可能原因是250 mg的Fe3O4@NH2NPs的添加量過少，導致形成的分子印跡層較厚，從而掩蓋了部分分子印跡孔穴，最終使得吸附效率下降。而750 mg的Fe3O4@NH2NPs的添加量過多，部分Fe3O4@NH2NPs表面沒有完全形成分子印跡層，使得吸附效率下降。故Fe3O4@NH2NPs的最佳添加量為500 mg。

2.2.6 MMIPs NPs的最佳制備方法

稱取500 mg Fe3O4@NH2NPs加入100 mL體積比為 1∶1的乙醇-水溶液（含 10 mmol/L Tris-HCl，pH8.5）超聲溶解10 min后加入15 mg NOR攪拌10 min，再加入134 mg DA（稍過量）混合。25℃水浴，300 r/min機械攪拌反應2 h。反應停止后，靜置2 h。用磁鐵對其進行富集分離后，用水和體積比為97∶3的乙醇-乙酸溶液洗滌后真空干燥，得到MMIPs NPs。磁性非分子印跡納米粒子（MNIPs NPs）的制備除不添加模板分子外，其他條件與MMIPs NPs制備方法一致。

2.3 吸附時間對吸附效率的影響

4 mg的MMIPs NPs和MNIPs NPs分別對1 mL 0.02 mg/mL NOR吸附效率隨時間的變化如圖7所示。

圖7 吸附時間對吸附效率的影響Fig.7 Influence of adsorption time on adsorption efficiency

由圖7可知，相同條件下，隨著吸附時間的增加，吸附效率不斷上升，在60 min時基本達到平衡，此時的吸附效率為94.61%，是MNIPs NPs（43.39%）的2.18倍，說明制備的MMIPs NPs具有能結合NOR的分子印跡孔穴。

2.4 MMIPs NPs用量對吸附效率的影響

不同MMIPs NPs用量對0.1 mg NOR的吸附效率如圖8所示。

圖8 MMIPs NPs用量對吸附效率的影響Fig.8 Effect of MMIPs NPs dosage on adsorption efficiency

由圖8可知，在吸附相同時間的情況下，吸附效率隨著MMIPs NPs用量的增加而上升，在用量為15 mg時基本達到平衡，此時吸附效率為99.17%，相對標準偏差為1.03%，基本已完全吸附。說明吸附相同質量的NOR，MMIPs NPs的用量越大，吸附效率越高。

3 結論

MMIPs NPs因其能夠特異性識別和吸附樣品中的目標物，并在外加磁場作用下可快速與基質分離，在分析檢測領域得到了廣泛地應用[12，20-21]。本研究首先采用化學共沉淀法制備了Fe3O4NPs，并發(fā)現用7%TMAOH對其活化2 h，再進行氨基修飾能夠使Fe3O4NPs表面氨基含量大大增加。然后以Fe3O4@NH2NPs為磁性載體、NOR為模板分子、DA為功能單體和交聯(lián)劑，成功制備了NOR的MMIPs NPs。所制備的4 mg MMIPs NPs吸附 1 mL 0.02 mg/mL的 NOR 60 min，其吸附效率可達94.61%，是相同條件下MNIPs NPs的2.18倍。15 mg MMIPs NPs吸附1 mL 0.1 mg/mL的NOR 60 min，其吸附效率可達99.17%，相對標準偏差為1.03%，說明可通過調整MMIPs NPs用量實現對NOR的完全吸附。該制備方法簡單、成本低廉，可快速有效富集分離NOR，且能重復利用，對簡化樣品前處理步驟、提升前處理效率、提高分析結果的準確性和重現性具有重要的實際意義。