發(fā)酵軟顆粒飼料對凡納濱對蝦生長性能、血清指標(biāo)、肝胰腺和腸道形態(tài)以及腸道菌群的影響

韓瑞玲 王珊珊 宋俊英 王丹玉 汪 攀* 易敢峰* 周志剛

(1.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司,福建省水產(chǎn)功能性飼料及養(yǎng)殖環(huán)境調(diào)控重點實驗室,漳州 363500;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所,中國-挪威魚類消化道微生物聯(lián)合實驗室,北京 100081)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)又名南美白對蝦,是我國重要的經(jīng)濟(jì)蝦類之一。因其殼薄體肥,肉質(zhì)鮮美,營養(yǎng)豐富,市場需求日益增加,養(yǎng)殖業(yè)得以蓬勃發(fā)展,2021年我國凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量超過127萬t[1]。然而,隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和集約化程度的提高,養(yǎng)殖水體環(huán)境失調(diào),養(yǎng)殖動物疾病頻發(fā),這嚴(yán)重阻礙了對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[2-3]。養(yǎng)殖過程使用抗生素是防控疾病較為常見的手段,但隨著病原菌抗藥性的增強(qiáng)和藥物殘留等問題的日趨嚴(yán)重,尋找藥物防控的替代手段已成為當(dāng)務(wù)之急[4]。益生菌可改善腸道菌群平衡、生長性能、飼料轉(zhuǎn)化、免疫狀態(tài)、疾病防御和抗應(yīng)激能力,進(jìn)而促進(jìn)宿主健康,是抗生素的有效替代品[5]。但是對蝦飼料加工過程中的高溫熟化過程會使益生菌失活,因此益生菌在對蝦飼料中的應(yīng)用受到一定的限制。

發(fā)酵軟顆粒飼料是指利用一些特種功能性微生物對全價顆粒飼料進(jìn)行發(fā)酵,最終制成的含有特定量活性益生菌及其代謝產(chǎn)物的濕顆粒飼料。發(fā)酵軟顆粒飼料采用先造粒后發(fā)酵的生產(chǎn)工藝,具有全價配合飼料和益生菌的雙重優(yōu)勢。首先,其具有常規(guī)顆粒飼料的營養(yǎng)組成與形狀,在滿足動物生長需求的同時還便于投喂與采食;其次,發(fā)酵過程中微生物對常規(guī)飼料進(jìn)行了預(yù)消化,營養(yǎng)成分更有利于吸收,抗?fàn)I養(yǎng)因子被降解;最后,發(fā)酵軟顆粒飼料中含有活性益生菌及其全部代謝產(chǎn)物,它們可增加常規(guī)顆粒飼料的益生功能。劉志云等[6]用發(fā)酵全價飼料階段性飼喂生長豬30 d,結(jié)果表明發(fā)酵全價飼料可提高平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和飼料轉(zhuǎn)化率,降低死淘率及糞便臭味物質(zhì)含量,具有很好的抗生素替代效果;陳志敏等[7]研究發(fā)現(xiàn),10%的發(fā)酵全價飼料替代肉雞飼糧可降低料重比,提高平均日增重,10%和20%發(fā)酵全價飼料替代組肉雞十二指腸絨毛高度以及十二指腸和空腸絨毛高度/隱窩深度值顯著高于對照組;何如芳[8]在斷奶仔豬飼糧中添加30%的發(fā)酵全價飼料,飼喂28 d,結(jié)果表明發(fā)酵全價飼料可提高斷奶仔豬的生長性能,改善腸道健康,提高斷奶仔豬的抗病力;胡新旭等[9]用含20%固態(tài)發(fā)酵全價飼料的飼糧飼喂生長育肥豬154 d,可提高生長育肥豬的生長性能,增強(qiáng)免疫力,改善肉品質(zhì),實現(xiàn)無抗飼養(yǎng);Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn),混合菌株發(fā)酵全價飼料可通過改善凡納濱對蝦的生長、抗氧化能力、消化以及腸道菌群,進(jìn)而維持其健康狀態(tài),促進(jìn)其生長,其混合菌株組成為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和沙福芽孢桿菌(Bacillussafensis),添加水平為1×108CFU/g。目前,發(fā)酵全價飼料的研究主要集中在豬、雞等動物上,在水產(chǎn)動物凡納濱對蝦上的研究較少。因此,本試驗以凡納濱對蝦配合顆粒飼料為發(fā)酵底物,利用由鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、釀酒酵母和索氏鯨桿菌(Cetobacteriumsomerae)復(fù)配的發(fā)酵菌劑進(jìn)行發(fā)酵,制備凡納濱對蝦發(fā)酵軟顆粒飼料,并按一定比例替代常規(guī)配合飼料投喂凡納濱對蝦,從生長性能、血清指標(biāo)、肝胰腺和腸道形態(tài)以及腸道菌群等多方面入手,探討發(fā)酵軟顆粒飼料對凡納濱對蝦的影響,以期為發(fā)酵軟顆粒飼料在凡納濱對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵軟顆粒飼料的制備

以魚粉和豆粕為蛋白質(zhì)源,大豆油、魚油和卵磷脂為脂肪源配制成粗蛋白質(zhì)約為42.0%、粗脂肪約為7.0%的基礎(chǔ)飼料(粒徑1.0 mm),其組成及營養(yǎng)水平見表1。將5 kg復(fù)合菌發(fā)酵劑(購自北京某水產(chǎn)科技有限公司,主要成分為鼠李糖乳桿菌、枯草芽孢桿菌及釀酒酵母等益生菌,活菌數(shù)量為1010CFU/g)溶于200 kg、37 ℃溫水中,再與800 kg基礎(chǔ)飼料混合,隨后將混合均勻的物料裝入帶有出氣閥的發(fā)酵袋中(5 kg/袋),加熱密封,28 ℃靜置發(fā)酵7 d,發(fā)酵結(jié)束后將其保存于4 ℃冰箱中備用。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 發(fā)酵軟顆粒飼料成分測定

發(fā)酵軟顆粒飼料粗蛋白質(zhì)含量參照GB/T 6432—2018測定,粗脂肪含量參照GB/T 6433—2006測定,粗纖維含量參照GB/T 6434—2006測定,酸溶蛋白質(zhì)含量參照NY/T 3801—2020測定。發(fā)酵軟顆粒飼料益生菌數(shù)量采用平板菌落計數(shù)法測定;其中,乳酸菌計數(shù)采用MRS瓊脂培養(yǎng)基,芽孢桿菌計數(shù)采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,酵母菌計數(shù)采用孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基,均在37 ℃下培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計數(shù)。上述培養(yǎng)基購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

續(xù)表1項目 Items含量 Content玉米蛋白粉 Corn gluten meal3.00米糠 Rice bran2.00維生素C酯 Vitamin C ester0.15氯化膽堿 Choline chloride0.25維生素預(yù)混料 Vitamin premix1)0.10礦物質(zhì)預(yù)混料 Mineral premix2)0.50磷酸二氫鈣 Ca(H2PO4)21.50膨潤土 Bentonite2.00合計 Total100.00營養(yǎng)水平 Nutrient levels3)水分 Moisture9.90粗蛋白質(zhì) CP42.00粗脂肪 EE7.00

1.3 試驗動物及飼養(yǎng)管理

預(yù)試驗在福建省詔安縣梅嶺鎮(zhèn)南門村大北農(nóng)水產(chǎn)養(yǎng)殖試驗基地進(jìn)行。對蝦在循環(huán)水桶馴化2周后,選用450只健康、規(guī)格一致[(3.24±0.10) g]的個體,將其隨機(jī)分到9個500 L的循環(huán)水養(yǎng)殖桶中,每桶50只。將9個養(yǎng)殖桶隨機(jī)分為3組,每組3個重復(fù),每天飽食投喂3次(08:00、14:00和19:00),3組對蝦分別用發(fā)酵軟顆粒飼料按2.5%、5.0%和10.0%的比例替代基礎(chǔ)飼料,進(jìn)行為期2周的預(yù)試驗。期間觀察對蝦的采食速度、采食量、腸道健康狀況和對蝦糞便形態(tài)。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果,選擇按5.0%比例替代基礎(chǔ)飼料進(jìn)行養(yǎng)殖試驗。

養(yǎng)殖試驗在福建省詔安縣梅嶺鎮(zhèn)南門村大北農(nóng)水產(chǎn)養(yǎng)殖試驗基地進(jìn)行。對蝦在循環(huán)水桶用基礎(chǔ)飼料暫養(yǎng)2周后,選用300只健康、規(guī)格一致[(3.35±0.08) g]的個體,將其隨機(jī)分到6個500 L的循環(huán)水養(yǎng)殖桶中,每桶50只。將6個養(yǎng)殖桶隨機(jī)分為2組,每組3個重復(fù)。對照組和試驗組對蝦分別投喂基礎(chǔ)飼料和試驗飼料,其中試驗飼料現(xiàn)用現(xiàn)配,每次將5%的發(fā)酵軟顆粒飼料和95%的基礎(chǔ)飼料混合均勻即為試驗飼料,開袋后剩余的發(fā)酵軟顆粒飼料封口后繼續(xù)存放于4 ℃冰箱中。養(yǎng)殖試驗持續(xù)6周,每天08:00、14:00和19:00進(jìn)行投喂,根據(jù)對蝦進(jìn)食情況和天氣變化調(diào)整具體投喂量,總投喂量為對蝦體質(zhì)量的4%～5%。養(yǎng)殖期間,每天換水1次,每次換水量為養(yǎng)殖水體的1/4,并記錄每個試驗桶中對蝦的攝食和死亡情況。養(yǎng)殖用水采用經(jīng)過濾和紫外消毒的天然海水,水溫22～28 ℃,鹽度28‰～32‰,pH為8.4～8.6,通過底部曝氣保證水中溶解氧含量在5 mg/L以上。

1.4 樣品采集

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后,凡納濱對蝦禁食24 h,稱重并記錄每桶總數(shù),計算生長性能。從每個養(yǎng)殖桶中隨機(jī)抽取10尾對蝦取血,放于4 ℃冰箱中靜置12 h,3 500 r/min 離心10 min,取上清液,保存于-80 ℃冰箱,用于后續(xù)血清指標(biāo)的測定;采集3尾蝦中腸和肝胰腺用Bouin’s固定液進(jìn)行固定,于4 ℃冰箱保存用于后期組織切片的制作;另取3尾蝦腸道(不含內(nèi)容物),放置于滅菌的凍存管內(nèi),轉(zhuǎn)移至液氮罐中,之后保存于-80 ℃冰箱,用于腸道菌群的測定。

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1 生長性能

凡納濱對蝦生長性能相關(guān)指標(biāo)增重率(WGR)、特定生長率(SGR)、飼料系數(shù)(FCR)和成活率(SR)計算公式如下:

WGR(%)=100×(Wt-W0)/W0;
SGR(%/d)=100×(lnWt-lnW0)/t;
FCR=Wf/(Wm-Wn);
SR(%)=100×Nt/N0。

式中:Wt為終末均重(g);W0為初始均重(g);Wf為攝入飼料量(干重,g);Wm和Wn分別為終末總重和初始總重(g);Nt和N0分別為終末尾數(shù)和初始尾數(shù);t為養(yǎng)殖天數(shù)(d)。

1.5.2 血清指標(biāo)

血清酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)和酚氧化酶(PO)活性以及丙二醛(MDA)含量采用購買于南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測定。

1.5.3 肝胰腺和腸道形態(tài)

將采集的對蝦肝胰腺和中腸組織用Bouin’s固定液固定24 h后,制備腸道組織切片,采用蘇木素-伊紅(HE)染液進(jìn)行染色,中性樹膠封片,并在光學(xué)顯微鏡(Nikon Eclipse E100)下進(jìn)行觀察;最后用MShot數(shù)字成像系統(tǒng)軟件(廣州明美科技有限公司)評估不同組對蝦肝胰腺和腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的差異。

1.5.4 腸道菌群

腸道菌群總DNA提取、擴(kuò)增和測試:采用FastDNA?Spin Kit試劑盒提取總DNA,按照說明書進(jìn)行操作;采用通用引物338F(5′-ACTCCGGGAGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增凡納濱對蝦腸道菌群16S rRNA基因的V3～V4區(qū)域[11];利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化,NEXTflexTMRapid DNA-Seq Kit(Bio Scientific)進(jìn)行建庫,按照說明書進(jìn)行操作;最后,在Illumina MiSeq PE300平臺進(jìn)行測序,由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

生物信息分析在美吉生信云平臺(https://cloud.majorbio.com)完成。數(shù)據(jù)優(yōu)化:使用fastp(https://github.com/OpenGene/fastp,version 0.20.0)軟件對原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控,使用FLASH(http://www.cbcb.umd.edu/software/flash,version 1.2.7)軟件進(jìn)行拼接。操作分類單元(OTU)聚類:使用UPARSE軟件(http://drive5.com/uparse/,version 7.1),根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行OTU聚類。分析軟件及算法使用Qiime平臺(http://qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/,version 2.2)對每條序列進(jìn)行物種分類注釋,比對Silva 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(v138),設(shè)置比對閾值為70%。

凡納濱對蝦腸道菌群測序原始數(shù)據(jù)已上傳至NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫,登錄號為PRJNA954170。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行t檢驗(t-test),P<0.05為差異顯著,結(jié)果數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)飼料發(fā)酵前后成分變化

由表2可知,基礎(chǔ)飼料經(jīng)過復(fù)合菌發(fā)酵劑發(fā)酵后,粗蛋白質(zhì)、酸溶蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗纖維含量分別提高了8.49%、42.54%、3.71%和3.97%。發(fā)酵軟顆粒飼料中乳酸菌、芽孢桿菌數(shù)和酵母菌數(shù)量分別為7.64×109、6.32×107和3.41×107CFU/g。

表2 基礎(chǔ)飼料發(fā)酵前后成分變化(風(fēng)干基礎(chǔ))

2.2 發(fā)酵軟顆粒飼料對凡納濱對蝦生長性能的影響

由表3可知,試驗組凡納濱對蝦WGR、SGR和SR均顯著高于對照組(P<0.05),FCR顯著低于對照組(P<0.05)。

表3 發(fā)酵軟顆粒飼料對凡納濱對蝦生長性能的影響

2.3 發(fā)酵軟顆粒飼料對凡納濱對蝦血清指標(biāo)的影響

發(fā)酵軟顆粒飼料對凡納濱對蝦血清非特異性免疫指標(biāo)的影響如圖1所示,試驗組血清酸性磷酸酶和溶菌酶活性均顯著高于對照組(P<0.05);血清堿性磷酸酶和酚氧化酶活性與對照組相比有所提升,但差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵軟顆粒飼料對凡納濱對蝦血清抗氧化指標(biāo)的影響如圖2所示,試驗組血清丙二醛含量顯著低于對照組(P<0.05);血清總超氧化物歧化酶活性高于對照組,但差異不顯著(P>0.05)。

圖1 發(fā)酵軟顆粒飼料對凡納濱對蝦血清非特異性免疫指標(biāo)的影響

圖2 發(fā)酵軟顆粒飼料對凡納濱對蝦的血清抗氧化指標(biāo)影響

2.4 發(fā)酵軟顆粒飼料對凡納濱對蝦肝胰腺和腸道形態(tài)的影響

發(fā)酵軟顆粒飼料對凡納濱對蝦肝胰腺形態(tài)的影響如圖3所示,試驗組肝小體排列緊密,肝小體之間基底膜完整,B細(xì)胞和R細(xì)胞數(shù)量較為豐富;而對照組肝小體排列松散,基底膜脫落,B細(xì)胞有損傷,R細(xì)胞和E細(xì)胞數(shù)量減少。發(fā)酵軟顆粒飼料對凡納濱對蝦腸道形態(tài)的影響如圖4所示,對照組腸上皮細(xì)胞與基底膜分離(箭頭X),腸上皮細(xì)胞輕度損傷(箭頭Z);試驗組腸上皮細(xì)胞與基底膜緊密相連(箭頭Y),腸道未見明顯損傷;試驗組腸道絨毛高度高于對照組,而腸肌厚度2組之間差異不明顯。

B:B細(xì)胞 B cell;E:E細(xì)胞 E cell;R:R細(xì)胞 R cell。

MT、VH和VW箭頭分別代表腸肌厚度、絨毛高度和絨毛寬度。箭頭X顯示腸上皮細(xì)胞完全脫離基底膜,箭頭Y顯示腸上皮細(xì)胞與基底膜緊密結(jié)合,箭頭Z顯示腸上皮細(xì)胞輕度損傷。

2.5 發(fā)酵軟顆粒飼料對凡納濱對蝦腸道菌群的影響

2.5.1 凡納濱對蝦腸道菌群alpha多樣性分析

由表4可知,試驗組凡納濱對蝦腸道菌群Sobs指數(shù)、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)與對照組相比有所降低,但差異不顯著(P>0.05);腸道菌群Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)在2組之間亦無顯著差異(P>0.05)。

2.5.2 凡納濱對蝦腸道菌群beta多樣性分析

凡納濱對蝦腸道菌群主坐標(biāo)分析(PCoA)如圖5所示,試驗組腸道樣品點與對照組樣品點距離較遠(yuǎn),且各自形成明顯的團(tuán)簇,說明試驗組與對照組的微生物群落有顯著差異(P<0.05)。凡納濱對蝦腸道菌群非度量多維尺度(NMDS)分析如圖6所示,結(jié)果與PCoA結(jié)果相一致。

2.5.3 凡納濱對蝦腸道菌群組成分析

凡納濱對蝦腸道菌群組成如圖7所示。在門水平上,變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidota)和放線菌門(Actinobacteriota)是對蝦腸道中最主要的門,但各門相對豐度在2組間存在一定差異。與對照組相比,試驗組變形菌門和擬桿菌門的相對豐度均有所提高(變形菌門的相對豐度從54.83%提高到65.60%,擬桿菌門的相對豐度從13.96%提高到21.39%),而厚壁菌門(Firmicutes)和疣微菌門(Verrucomicrobiota)的相對豐度有所降低(厚壁菌門的相對豐度從8.99%降低到2.67%,疣微菌門的相對豐度從8.22%降低到1.74%)。在屬水平上,與對照組相比,試驗組未分類_f_紅桿菌科(unclassified_f_Rhodobacteraceae)、魯杰氏菌屬(Ruegeria)、噬冷菌屬(Algoriphagus)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、Nautella、Marinovum和發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)的相對豐度有所提高,Psedoruegeria、未分類_f_黃桿菌科(unclassified_f_Flavobacteriaceae)、脫甲基醌菌屬(Demequina)、運動單胞菌屬(Motilimonas)、玫瑰色小桿菌屬(Roseibacillus)、未定級_f_丙酸桿菌科(norank_f_Propionibacteriaceae)、Haloferula、狹義梭菌屬1(Clostridium_sensu_stricto_1)、未定級_f_紅桿菌科(norank_f_Rhodobacteraceae)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和節(jié)旋藻屬PCC-7345(Arthrospira_PCC-7345)相對豐度有所降低。

表4 凡納濱對蝦腸道菌群alpha多樣性

圖5 凡納濱對蝦腸道菌群主坐標(biāo)分析

圖6 凡納濱對蝦腸道菌群非度量多維尺度分析

圖7 凡納濱對蝦腸道菌群在門(左)和屬(右)水平上的組成

3 討 論

3.1 發(fā)酵軟顆粒飼料對凡納濱對蝦生長性能的影響

本試驗所用發(fā)酵軟顆粒飼料主要是以乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌為主的復(fù)合功能性菌種對全價顆粒飼料進(jìn)行發(fā)酵而得,兼具營養(yǎng)性和功能性雙重功效。乳酸菌作為應(yīng)用最為廣泛的一種益生菌添加劑,無論是對人類的消化系統(tǒng)還是對動物胃腸道消化系統(tǒng)均有著積極的作用[12]。因此,微生物發(fā)酵飼料相比于普通飼料而言,不僅營養(yǎng)價值高,并且可以有效促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖動物對飼料的消化吸收,從而起到促進(jìn)生長的作用。王軍等[13]研究發(fā)現(xiàn),在養(yǎng)殖過程中持續(xù)投喂適宜比例的發(fā)酵飼料,能顯著促進(jìn)凡納濱對蝦幼蝦的生長,提高蝦苗SR及餌料效率,且與對照組比較,試驗組蝦苗體色透明,攝食時間縮短;孟陽[14]研究發(fā)現(xiàn),地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)、植物乳桿菌發(fā)酵飼料能顯著提高凡納濱對蝦的SR和SGR,且SR相較于對照飼料組提高了8.34%。本研究結(jié)果顯示,發(fā)酵軟顆粒飼料按5%比例替代基礎(chǔ)飼料相比于直接投喂基礎(chǔ)飼料而言,凡納濱對蝦的WGR、SGR和SR均顯著提高,分別提高了30.10%、16.46%和5.12%,而FCR同對照組相比顯著降低,降低了11.94%。這說明發(fā)酵軟顆粒飼料相比于基礎(chǔ)飼料而言,能促進(jìn)凡納濱對蝦的生長。

3.2 飼喂發(fā)酵軟顆粒飼料對凡納濱對蝦血清指標(biāo)的影響

凡納濱對蝦作為一種無脊椎動物,其免疫系統(tǒng)不完善,主要依靠其有效的細(xì)胞和體液固有免疫反應(yīng)來對抗傳染源[15];其中,溶菌酶是對蝦先天免疫系統(tǒng)中的重要防御物質(zhì),可通過溶解細(xì)胞壁來抵抗外界病原菌的入侵[16]。張盛靜等[17]研究發(fā)現(xiàn),凡納濱對蝦感染副溶血弧菌后,飼料中添加芽孢桿菌可提高溶菌酶的mRNA相對表達(dá)量。本試驗中,投喂發(fā)酵軟顆粒飼料可以顯著提高凡納濱對蝦血清溶菌酶活性,這與他人關(guān)于在對蝦上飼喂凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)、地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)和多黏類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)等益生菌研究結(jié)果[18-20]一致。酸性磷酸酶和堿性磷酸酶是對蝦抗疾病系統(tǒng)的重要組成部分[21]。酸性磷酸酶是溶酶體酶的關(guān)鍵成分,可抵御無脊椎動物的入侵生物體[22];堿性磷酸酶是一種參與免疫系統(tǒng)催化和代謝的金屬酶[23]。研究表明,使用益生菌可以增強(qiáng)水產(chǎn)動物這2種酶的活性。Yi等[24]研究發(fā)現(xiàn)鯽魚(Carassiusauratus)攝食添加了芽孢桿菌的飼料,其血清酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性均顯著提高;Li等[25]研究發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌能顯著提高凡納濱對蝦血清酸性磷酸酶活性。在本試驗中,試驗組凡納濱對蝦血清酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性均高于對照組,且血清酸性磷酸酶活性顯著提高。

丙二醛是脂質(zhì)過氧化分解代謝的產(chǎn)物,與機(jī)體自由基產(chǎn)生量成正比。當(dāng)機(jī)體內(nèi)存在的過量自由基不能被及時清除時,即可攻擊細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸,導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化、丙二醛含量增加,故丙二醛的含量常常可以反映出機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊和脂質(zhì)過氧化的程度,從而間接地反映出細(xì)胞損傷程度的嚴(yán)重性[26-27]。本試驗中,與對照組相比,試驗組凡納濱對蝦血清丙二醛含量顯著降低,這說明發(fā)酵軟顆粒飼料可降低對蝦體內(nèi)脂質(zhì)過氧化物和氧自由基的積累,抵抗氧化損傷。超氧化物歧化酶是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶,可以將生物體內(nèi)的超氧陰離子轉(zhuǎn)變成過氧根離子,超氧化物歧化酶常與丙二醛一起作為評價動物機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)[28]。研究表明,芽孢桿菌可以提高凡納濱對蝦和草魚血清超氧化物歧化酶活性[29]。但在本試驗中,試驗組血清總超氧化物歧化酶活性相比于對照組有所提高,但差異不顯著。以上結(jié)果表明,發(fā)酵軟顆粒飼料可提高凡納濱對蝦的非特異免疫酶活性,進(jìn)而達(dá)到增強(qiáng)對蝦免疫力、維護(hù)機(jī)體健康生長狀態(tài)的作用。

3.3 發(fā)酵軟顆粒飼料對凡納濱對蝦肝胰腺和腸道形態(tài)的影響

肝胰腺是凡納濱對蝦體內(nèi)重要的免疫器官[30],也是甲殼動物重要的消化器官,能分泌消化酶,促進(jìn)消化吸收,儲存營養(yǎng)物質(zhì),此外還兼具解毒功能[31]。E細(xì)胞為肝胰腺干細(xì)胞,可通過分裂和分化產(chǎn)生其他類型的肝細(xì)胞,從而補充一些退化損耗的細(xì)胞;R細(xì)胞的功能是吸收儲存營養(yǎng)和參與脂蛋白的代謝;B細(xì)胞負(fù)責(zé)營養(yǎng)吸收,是消化酶合成的主要場所[32]。有研究表明,飼料中添加復(fù)合酶制劑和復(fù)合菌制劑時,凡納濱對蝦的肝小管排列整齊、緊密,B細(xì)胞和R細(xì)胞數(shù)量均較為豐富[33]。本研究結(jié)果顯示,飼喂發(fā)酵軟顆粒飼料與飼喂基礎(chǔ)飼料的凡納濱對蝦相比,肝小體排列緊密,肝小體之間基底膜完整,B細(xì)胞、R細(xì)胞和E細(xì)胞數(shù)量均較為豐富,說明發(fā)酵軟顆粒飼料有利于維持凡納濱對蝦的肝胰腺健康狀態(tài),改善其生長性能。

腸道不僅是對蝦消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的重要器官,還是病原菌入侵機(jī)體的門戶,因此腸道的形態(tài)和結(jié)構(gòu)與對蝦的生長性能和健康水平密切相關(guān)[34]。研究表明,腸道微絨毛與腸道吸收面積密不可分,提高腸道微絨毛高度和密度可以使消化酶與食糜更充分地接觸,增大營養(yǎng)物質(zhì)運輸面積,提高腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用[35]。本研究結(jié)果顯示,與飼喂基礎(chǔ)飼料相比,飼喂發(fā)酵軟顆粒飼料可明顯提高凡納濱對蝦的腸絨毛高度,說明發(fā)酵軟顆粒飼料可以促進(jìn)對蝦腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用,進(jìn)而維持腸道的發(fā)育和健康。

3.4 發(fā)酵軟顆粒飼料對凡納濱對蝦腸道菌群的影響

腸道益生菌可通過促進(jìn)機(jī)體對食物的消化吸收以及競爭性的抑制腸道有害微生物生長,進(jìn)而維持機(jī)體腸道內(nèi)生態(tài)平衡,促進(jìn)機(jī)體健康生長[36]。本試驗研究了發(fā)酵軟顆粒飼料對凡納濱對蝦腸道菌群的影響,PCoA和NMDS分析結(jié)果顯示,飼喂發(fā)酵軟顆粒飼料的凡納濱對蝦與對照組相比,腸道微生物群落結(jié)構(gòu)有明顯的變化,說明發(fā)酵軟顆?？梢哉{(diào)節(jié)凡納濱對蝦腸道菌群,改變腸道微生物組成。大量研究表明,變形菌門是對蝦腸道中的主要優(yōu)勢菌門[37-38],該門的一些成員參與了氮循環(huán)和有機(jī)化合物的礦化過程[39-40]。在本研究中,凡納濱對蝦腸道變形菌門相對豐度最高,其次是擬桿菌門、放線菌門和厚壁菌門,這與Wang等[5]的研究結(jié)果一致。在屬水平上,凡納濱對蝦腸道以未分類_f_紅桿菌科、Psedoruegeria和未分類_f_黃桿菌科為主。紅桿菌科細(xì)菌在健康對蝦腸道中具有較高的相對豐度,是指示對蝦健康的關(guān)鍵微生物類群,被認(rèn)為是抗逆防病的益生菌資源[41]。研究表明,魯杰氏菌屬與對蝦SR呈顯著正相關(guān)[42]。黃桿菌科包括多種致病菌,可導(dǎo)致魚和蝦的腮部病變[43-44],對水產(chǎn)動物是有害的微生物類群。本研究發(fā)現(xiàn),飼喂發(fā)酵軟顆粒飼料的凡納濱對蝦腸道中未分類_f_紅桿菌科和魯杰氏菌屬的相對豐度提高,未分類_f_黃桿菌科的相對豐度降低,這表明飼喂發(fā)酵軟顆可使等對蝦腸道菌群結(jié)構(gòu)向有利于健康的方向調(diào)整,這一結(jié)果進(jìn)一步證實了發(fā)酵軟顆飼料對凡納濱對蝦健康的調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié) 論

飼料中添加5%發(fā)酵軟顆粒飼料可提高凡納濱對蝦WGR、SRG和SR,降低FCR,增強(qiáng)非特異性免疫力,改善肝胰腺健康,調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)并改善腸道形態(tài)。