高效液相色譜法同時測定小麥粉中乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚

姜志遠(yuǎn)，馬可佳，王 緣，王曉婧，趙 嵐

（黑龍江省疾病預(yù)防控制中心，黑龍江哈爾濱 150030）

小麥粉中含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪及膳食纖維等營養(yǎng)成分，是北方居民餐桌上重要的主食來源，因此市售小麥粉的品質(zhì)受到食品監(jiān)管部門的高度重視。但有些不法商販通過向劣質(zhì)小麥粉中添加防腐劑、抗生素和增白劑等非食品原料，掩蓋小麥粉質(zhì)量低劣的事實(shí)，使市售小麥粉的感官性狀達(dá)到出廠標(biāo)準(zhǔn)，這種行為存在很大的食品安全風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重危害了廣大消費(fèi)者的身體健康。在這些添加劑中，乙二胺四乙酸二鈉屬于超范圍使用的食品添加劑[1-2]，曲酸、間苯二酚是國家食藥總局明令禁止使用的化學(xué)成分[3-4]。市售小麥粉中是否添加乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚等非法添加劑，是評價小麥粉安全性的主要依據(jù)，因此研究市售小麥粉中多種非食品原料檢測方法非常重要。

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法同時對市售小麥粉中乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚這3 種化合物進(jìn)行檢測分析，探索同時測定小麥粉中多種非法添加劑的方法，為小麥粉的安全性評價及質(zhì)量監(jiān)督提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥粉樣品48批次，購自哈爾濱市、齊齊哈爾市、綏化市等地的糧油市場。

乙二胺四乙酸二鈉（含量：99.0%；批號：20200701），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；曲酸（含量：100.0%；批號：CCFD200382），德國卡特化工有限公司；間苯二酚（含量：99.9%；批號：21071189），壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），美國Merck 公司；甲酸（色譜純），DIKMA 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

2695 型高效液相色譜儀；Watere 2489 型檢測器；GP324S 電子天平，Sartorius 公司；DC24H 氮吹儀，安譜科學(xué)儀器公司；KQ500VDE 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器；3K15 型高速冷凍離心機(jī)，SIGMA公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取乙二胺四乙酸二鈉、曲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，分別用30%甲醇溶液配制成50.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液；稱取間苯二酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，用80%甲醇溶液配制成50.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，用50%乙腈溶液稀釋成濃度為0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1、6.0 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品前處理

稱取市售小麥粉樣品5.0 g，置于聚丙烯離心管中，加入乙腈-甲醇-水溶液（5 ∶4 ∶1）10 mL，振搖混勻后，渦旋混勻10 min，超聲處理15 min，8 000 r·min-1離心10 min，獲取上清液并置于另一離心管中；再次加入乙腈-甲醇-水溶液（5 ∶4 ∶1）10 mL，重復(fù)提取一次，合并兩次小麥粉提取液。移取10 mL 提取液，置于帶刻度的離心管中，在40 ℃水浴下氮吹至近干，使用50%乙腈溶液復(fù)溶以后，定容至2 mL，過0.22 μm 濾膜后進(jìn)樣檢測[5-9]。

1.3.3 色譜條件

DiamonsiL-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱 溫：40 ℃； 流 速：1.0 mL·min-1； 進(jìn) 樣 體 積：20 μL；流動相：A 為乙腈，B 為0.1%甲酸溶液；檢測波長：275 nm；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.3.4 樣品測定

小麥粉樣品經(jīng)過前處理后，注入液相色譜分析并計(jì)算乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚的峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，建立3 種化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品峰面積代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算小麥粉樣品溶液中的化合物含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的優(yōu)化

參考文獻(xiàn)[10-12]中的色譜條件，改變流動相中乙腈、0.1%甲酸溶液的比例，研究了不同梯度下乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚的理論塔板數(shù)和分離度，結(jié)合3 種化合物的保留時間，確定了最佳流動相比例。在這種流動相條件下，3 種化合物的理論塔板數(shù)均不小于5 000，各個色譜峰的分離度均不小于1.5，具體結(jié)果見圖1、圖2、圖3。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 空白樣品加標(biāo)色譜圖

圖3 空白樣品（小麥粉）色譜圖

2.2 檢測波長的選擇

乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚的紫外吸收峰值不同。間苯二酚和曲酸的最大吸收波長在260 ～280 nm，乙二胺四乙酸二鈉的最大吸收波長在250 ～280 nm，為兼顧各個成分的靈敏度，并能實(shí)現(xiàn)同時測定的目的，選擇275 nm 作為3 種化合物共有的檢測波長。

2.3 提取溶劑的選擇

根據(jù)3 種化合物的溶解性和相關(guān)文獻(xiàn)資料的報(bào)道，選擇常用試劑甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、50%乙腈、乙腈-甲醇-水溶液（5 ∶4 ∶1）作為提取溶劑進(jìn)行比較。結(jié)果表明，選擇甲醇、乙醇提取小麥粉樣品，乙二胺四乙酸二鈉的回收率低于70%；選擇50%甲醇、50%乙醇和50%乙腈提取小麥粉樣品，進(jìn)樣后獲得的色譜圖中干擾峰較多，專屬性不強(qiáng)；選擇乙腈-甲醇-水溶液（5 ∶4 ∶1）提取小麥粉樣品，離心后上清液清澈透明，色譜圖中沒有干擾峰，3 種化合物均能獲得良好的回收率，可以滿足定量檢測要求。

2.4 線性范圍分析

準(zhǔn)確移取3 種化合物的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度溶液各20 mL，按照由低到高的濃度依次進(jìn)樣檢測，將峰面積（Y）作為縱坐標(biāo)，將濃度（X）作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚3 種化合物在0.50 ～10.00 μg·mL-1時，線性關(guān)系良好（表2）。

表2 線性范圍及檢出限結(jié)果

2.5 最低檢出限

在“1.3.3”的色譜條件下，將標(biāo)準(zhǔn)混合使用液用50%乙腈溶液逐級稀釋進(jìn)樣，以3 倍信噪比估算乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚的最低檢出限。由表2 可知，乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚這3 種化合物的檢出限分別為0.006 μg·kg-1、0.005 μg·kg-1、0.003 μg·kg-1，方法的檢出限滿足質(zhì)量分析的要求。

2.6 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

為了確定檢測方法的回收率，選擇清洗后干燥麥粒經(jīng)粉碎獲得的小麥粉作為加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)的空白基質(zhì)。分別移取“1.3.1”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，依次加入5.0 g 空白基質(zhì)中，按“1.3.2”方法制備濃度為1.0 mg·kg-1、2.0 mg·kg-1、4.0 mg·kg-1的加標(biāo)樣品溶液，每個濃度水平設(shè)置6 個平行樣。如表3 所示，小麥粉中乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚3 種化合物的平均回收率在97.2%～99.7%，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.06%～1.79%，說明回收率良好。

表3 小麥粉中3 種化合物的加標(biāo)回收率（n=6）

2.7 市售樣品測定

采用本方法對市售48 種小麥粉中的乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚3 種化合物進(jìn)行測定，結(jié)果未檢出這3 種化合物，說明檢測的小麥粉中不存在乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚3 種非食品原料的問題。本方法可用于小麥粉樣品的快速定量檢測。

3 結(jié)論

本文建立的高效液相色譜方法可以實(shí)現(xiàn)乙二胺四乙酸二鈉、曲酸和間苯二酚3 種化合物的有效分離，靈敏度高，線性關(guān)系良好，回收率高，且成功應(yīng)用于市售48 種小麥粉中3 種化合物的分離測定。